全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(10): 1704−1711　 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 农业部行业专项(nyhyzx07-053); 教育部长江学者和创新团队发展计划(PCSIRT)
作者简介: 孙石(1973−), 男, 博士研究生。E-mail: sunshi73@163.com
*
通讯作者(Corresponding author): 邢邯(1963−), 教授, 博士生导师。Tel: 025-84395219; E-mail: hanxing@njau.edu.cn
Received(收稿日期): 2008-01-17; Accepted(接受日期): 2008-03-30.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01704
大豆品种 RGA分析与疫霉根腐病抗性鉴定
孙 石 1 赵晋铭 1 武晓玲 1 郭 娜 1 王源超 2 唐卿华 2 盖钧镒 1
邢 邯 1,*
(1 南京农业大学大豆研究所 / 国家大豆改良中心 / 作物遗传与种质创新国家重点实验室; 2 南京农业大学农业部病虫监测与治理重
点开放实验室, 江苏南京 210095)
摘 要: 采用 7 个具有不同毒性基因的大豆疫霉菌株, 对黄淮地区 48 个优良大豆种质资源进行了苗期接种鉴定, 筛
选出一批具有不同抗性的优异抗源, 说明黄淮地区蕴藏着丰富的大豆抗病资源。以相似系数 0.682聚类, 48个大豆品
种可以分成 8 类。同时, 根据抗病基因在保守区域序列同源性的原理, 利用 RGA-PCR 方法对 48 个品种的遗传多样
性进行分析, 从 48个大豆品种的抗病基因同源序列中共扩增出 53条谱带, 各品种之间谱带较清晰且呈现明显的多态
性, 以相似系数 0.746聚类, 48个大豆品种可以分成 7类。尽管抗性表型和 RGA聚类的类与类之间没有一一对应关
系, 但抗谱广的品种, 能较好地聚在一类, 如丰收黄、科丰 36、即墨油豆等。因此, 综合利用抗性表型和 RGA 分析
可以为大豆疫霉根腐病抗性基因鉴定、品种的培育和合理布局提供一定的理论依据。
关键词: 大豆; 抗病基因同源序列分析; 多态性; 抗性鉴定
Resistance Identification and Genetic Diversity among Soybean Cultivars
Based on Resistance Gene Analogue
SUN Shi1, ZHAO Jin-Ming1, WU Xiao-Ling1, GUO Na1, WANG Yuan-Chao2, TANG Qing-Hua2, GAI
Jun-Yi1, and XING Han1,*
(1 Soybean Research Institute, Nanjing Agricultural University / National Center for Soybean Improvement / National Key Laboratory for Crop Ge-
netics and Germplasm Enhancement; 2 Key Laboratory of Monitoring and Management of Plant Diseases and Insects, Ministry of Agriculture, Nan-
jing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China)
Abstract: Phytophthora root rot caused by Phytophthora sojae is a destructive disease for soybean [Glycine max (L.) Merr.] in
soybean production regions of the world. Utilization of resistant varieties is the most economical and environmentally safe method
for controlling this disease. A total of 48 soybean cultivars, which mainly used in Huang-Huai Valley, were analyzed to study their
resistance to P. sojae by identifying seedlings with 7 stains of P. sojae. The resistance to P. sojae varied among different cultivars,
which were divided into 8 groups at 0.682 similarity coefficient. The results showed that there exist the rich resistant soybean
resources to P. sojae in Huang-Huai Valley. Most known plant disease-resistance (R) genes include nucleotide binding site (NBS)
or leucine-rich repeats (LRRs) and serine/threonine protein kinase (STK) in their encoded products domains. Two primers,
XLRRfor/XLRRrev and Pto-kin1/Pto-kin2, were designed on the loci of these conserved domains. By polymerase chain reaction
(PCR) and denatured polyacrylamide-gel electrophoresis techniques, disease resistance gene analogues (RGA) amplified on 48
soybean materials. The RGA analysis of 48 cultivars produced 53 amplification bands, 39 of them (73.6 %) showed polymorphic,
and they were divided into 7 groups at 0.746 similarity coefficient. Although there was no parallelism relationship in groups be-
tween two different types of the clustering, the cultivars with broad resistance spectrum, such as Fengshouhuang, Kefeng 36, and
Jimoyoudou could be clustered into the same group. The result indicated RGAP (resistance gene analog polymorphism) technique,
combining the resistant spectrum, provides a useful and efficient way to improve the efficiency of parent selection in soybean
第 10期 孙 石等: 大豆品种 RGA分析与疫霉根腐病抗性鉴定 1705


breeding and to accelerate the process of developing soybean cultivars with resistance.
Keywords: Soybean; Resistance gene analogue (RGA); Polymorphism; Resistance identification
由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)引起的大豆
疫霉根腐病是大豆毁灭性病害之一, 自从 1989年被
沈崇尧等 [1]在东北大豆产区黑龙江省发现后, 在黄
淮夏大豆主产区也相继被发现[2-3]。目前该病已经在
我国一些大豆生产区发生并在局部地区造成较大损
失。选育抗病品种是控制大豆疫霉根腐病最经济、
有效的措施, 既避免了污染环境, 又可以降低成本
和人力投入。抗病基因的鉴定、抗病品种的筛选和
培育以及品种的合理布局等都是控制此病害的基础
工作。大豆对大豆疫霉根腐病的抗性通常以质量抗
性为主, 符合“基因对基因”假说[4-5], 即表现为品
种的某一抗性基因与大豆疫霉菌相对应的某一无毒
基因之间的专化性互作, 它的抗病性表型则是这两
者在特定环境条件下互作的结果。目前, 国际上已
经定位14个抗大豆疫霉根腐病的抗性基因[6-7], 但是
抗性品种在大面积推广种植后会对大豆疫霉产生选
择压力形成新的致病小种而丧失抗性 [8-10], 所以有
必要筛选和鉴定含有新的抗性基因或者含有多个抗
性基因组合的种质资源。在我国东北大豆产区已经
筛选出大量抗不同大豆疫霉菌株的种质资源 [11-12],
但针对黄淮夏大豆进行的多抗性鉴定工作开展的较
少, 该区拥有丰富的大豆种质资源, 开展大豆疫霉
根腐病的抗性鉴定及抗性遗传基础的研究工作具有
重要的实际意义。
近十几年来在多种植物中已克隆到一系列的抗
病基因, 迄今分离和测序的多数抗性基因及基因产
物, 有一些共同的结构, 如核苷酸结合位点(NBS)、
富含亮氨酸重复序列(LRR)和丝氨酸苏氨酸蛋白激
酶(STK)、跨膜结构域(TM)、亮氨酸拉链(LZ)、Toll
白介素-1区域(TIR)以及蛋白激酶(PK)等[13-16]。以抗
病基因的保守序列为基础设计引物, 应用 PCR 技术
的扩增和分离具有相似序列DNA片段, 即抗性基因
同源序列, 为快速鉴定候选抗病基因和评价抗病种
质资源提供了一条有效途径[17-19]。近年来许多研究
者已利用抗性基因同源序列相似性对水稻抗稻瘟病
和白叶枯病进行种质资源评价。例如, 朱有勇等[20]
从抗病基因同源序列遗传多样性、稻瘟病抗性、农
艺性状和经济性状等方面利用水稻品种多样性控制
稻瘟病的研究已取得一定效果。
本研究应用 7 个大豆疫霉菌株对黄淮夏大豆
主产区部分种质资源进行抗性鉴定 , 分析研究抗
源的遗传多样性和抗病基因同源序列的相似性及
其相互关系, 旨在筛选出抗谱较广的种质资源, 为
抗病育种及充分利用有特色的品种资源提供理论
依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
48个大豆品种来自黄淮夏大豆主产区, 由国家大
豆改良中心提供。
1.2 供试菌株
在已有资料和预备实验的基础上, 共采用 7 个来
自国内外的毒性谱不同的大豆疫霉菌株, 均由南京
农业大学农业部病虫监测与治理重点开放实验室提
供。试验前重新鉴定 7个菌株对寄主的毒力, 结果见
表 1。

表 1 7个大豆疫霉菌株的来源及其毒力公式
Table 1 Virulence formula and origin of seven stains of Phy-
tophthora sojae
菌株
Stain
来源
Origin
毒力公式
Virulence formula
PNJ1 中国 China 1d, 2, 3b, 3c, 4, 6, 7
PNJ3 中国 China 1a, 1b, 1c, 1d, 1k, 2, 3b, 3c, 5, 7
PNJ4 中国 China 1a, 1b, 1c, 1d, 1k, 2, 3b, 3c, 4, 6
Pm2 美国 USA 1b, 1d, 2, 3a, 3b, 4, 5, 6, 7
Pm14 美国 USA 1a, 1d, 2
H15 中国 China 3b, 3c, 5, 6, 7
Pm28 美国 USA 1a, 1b, 1c, 1d, 1k, 2, 3b, 3c, 5, 6, 7

1.3 抗性鉴定
采用下胚轴伤口接种法, 参考 Sandhu等[21]的方
法。在温室里每个品种每盆种植 10株, 待大豆 2片
复叶展平, 第 3 片复叶未展开时, 用灭菌刀片在子
叶节下方 1 cm处轻划长度约 1 cm的伤口, 取培养 7
d的菌丝块贴在伤口处, 在保湿箱中保湿 48 h后移出
放在 20℃~ 25℃温室继续培养。接种后第 6 天调查
发病情况, 感病植株在伤口处出现水渍状病斑, 很
快变成淡褐色 , 整株萎蔫 , 植株从接种部位折断 ,
全株枯死; 抗病植株仅在下胚轴伤口处发生局部变
褐或棕褐色, 病斑不扩展, 植株继续生长。每个品种
设 3个重复, 每次接种鉴定都以不含任何抗性基因的
品种 Williams作为对照。
1706 作 物 学 报 第 34卷

1.4 DNA提取
按稍加修改的 Keim等[22]的 CTAB法。
1.5 PCR扩增、电泳和银染
取 30 ng 基因组 DNA 进行 PCR 反应。采用水
稻 Xa21 基因 LRR 区域设计的引物 XLRRfor/
XLRRrev和番茄 Pto基因编码蛋白激酶的DNA序列
设计的 Pto-kin1/Pto-kin2[23-24](表 2)。反应程序为 94℃
预变性 3 min, 94℃变性 l min, 48℃退火 l min, 72℃
延伸 1 min, 共 30个循环, 最后 72℃延伸 7 min。PCR
反应体系、电泳和银染方法基本同文献[21]。
1.6 聚类分析
利用 NTSYS-pc Version 2.02 中的 UPGMA
(unweight pair-group method with arithmetic averages)
程序进行聚类分析, 构建遗传系统树。

表 2 用于 RGA分析的引物对
Table 2 List of RGA primer pairs used in this study
引物对代码
Code
引物名称
Primer name
序列
Sequence (5′–3′)
保守结构域来源
Origin of conserved motifs
XLRR for CCGTTGGACAGGAAGGAG RGA1
XLRR rev CCCATAGACCGGACTGTT
LRR region of Xa21 gene from rice
Pto-kin1 GCATTGGAACAAGGTGAA RGA2
Pto-kin2 AGGGGGACCACCACGTAG
Kinase domain of Pto from tomato

2 结果与分析
2.1 48个大豆品种的抗性表现
表 3表明 7个菌株对 48个大豆品种的侵染程度
不同, 侵染率最高达 83.3%, 最低为 31.3%; 对于同
一个大豆品种, 不同菌株对其毒力频率也存在着差
异, 最高为 100%, 最低为 0。根据鉴定结果, 筛选出
一批抗多个大豆疫霉菌株的优异抗源, 例如, 皖豆 4
号、科丰 36两个大豆品种对 7个菌株都表现抗性, 皖
豆 24、丰收黄和鲁豆 12对 6个菌株表现抗性; 另外,
即便是毒力频率较高的品种, 它们对不同的大豆疫
霉菌株也表现不同的抗性, 例如, 稻熟黄、沛县大白
角、泗豆 11、合豆 3号、皖豆 6 号和诱变 31 对这 7
个菌株的毒力频率同为 71.4%, 但它们的抗谱完全
不同, 说明它们有可能具有不同的抗性基因。显然
黄淮地区蕴藏着丰富的大豆抗病资源。
2.2 48个大豆品种的抗性聚类
从图 1 可知, 当阈值取 0.682 时, 测试的 48 个
大豆品种可以分为 8 个遗传相似组。其中 1、4、7
组为主要主群, 分别含有 16、12和 9个品种。第一
组群的品种对 7 个菌株的毒力频率较高 , 为
71.4%~100.0%, 这一组群包含有 4 种不同的反应类
型, 5个全感品种就划入此组群。而第 7组群品种对
7 个菌株的毒力频率较低, 为 0~28.6%, 第 8 组群 4
个品种对 7 个菌株的毒力频率也较低, 它与第 7 组
群的遗传相似性最高。以上结果表明黄淮夏大豆抗
疫霉根腐病资源品种的抗性多样性较为丰富。
2.3 大豆抗病基因同源序列的多态性
所用的 2对引物在 48个供试的大豆品种中共扩
增出 53条清晰条带, 多态带 39条, 占 73.6%。其中
RGA1的谱带主要分布于 80~1 500 bp (图 2), RGA2
的谱带分布于 80~2 000 bp。2对引物在品种中扩增
的谱带总数和平均多态性见表 4。
2.4 利用 RGA相似性对品种进行聚类
由于分析用的引物是根据抗病基因的序列设计
的 , 扩增谱带越多 , 则抗病基因同源序列越丰富 ,
在自然条件下抗病的可能性越高[14]。因此基于两对
引物的扩增结果进行聚类分析。从总体来看, 遗传
相似性最低的为 62.0%, 最高为 94.0%, 说明这些供
试品种在抗性遗传上互有一定程度的差异, 表现出
抗性遗传的多样性。以相似系数 0.746聚类, 48个大
豆品种可以分成 7类, 其中 2、3和 7为主要组群, 分
别包括 28个、7个和 4个品种(图 3)。第 2组群在相
似系数为 0.778时可以进一步划分为 5个亚组。
品种的抗性基因同源序列相似性在一定程度上
反映控制抗病性基因在结构和组成上的相似和差
异。从图 1和图 3可以看出抗性表型和 RGA聚类的
类与类之间没有一一对应关系 , 也就是说从品种
RGA的 DNA指纹多态性到抗性遗传表型的多样性,
在群体遗传学上没有显示出对应的关系。但抗谱广
的品种, 能较好地聚在一类, 如丰收黄、科丰 36、徐
豆 10号、即墨油豆、青阳早黄豆等。

第 10期 孙 石等: 大豆品种 RGA分析与疫霉根腐病抗性鉴定 1707


表 3 参试大豆品种及其对疫霉根腐病的抗谱
Table 3 Soybean cultivars and its resistance spectrum to strains of P. sojae
对 7个菌株的抗性反应 Reaction of resistance to seven stains 编号
No.
品种
Cultivar PNJ1 PNJ3 PNJ4 Pm2 Pm14 H15 Pm28
毒力频率
Virulent frequency (%)
1 滨海大白花 Binhaidabaihua S S S S R S S 85.7
2 楚秀 Chuxiu S R R S R S S 57.1
3 稻熟黄 Daoshuhuang S S R S R S S 71.4
4 东海平顶红 Donghaipingdinghong S S S R R R S 57.1
5 东辛 2号 Dongxin 2 S R R S R R S 42.9
6 灌豆 1号 Guandou 1 S R S S R S R 57.1
7 灌云大四粒 Guanyundasili S S S S R S S 85.7
8 海白花 Haibaihua S S S S S S S 100.0
9 淮豆 5号 Huaidou 5 S S S S S S S 100.0
10 淮豆 6号 Huaidou 6 R R R S S R R 28.6
11 沛县大白角 Peixiandabaijiao S S S R R S S 71.4
12 邳县软条枝 Pixianruantiaozhi S S R S R S S 71.4
13 泗豆 11 Sidou 11 S S S S S R R 71.4
14 铜山天鹅蛋 Tongshantian’edan S R R S R R S 42.9
15 徐豆 10号 Xudou 10 S R R S R R R 28.6
16 徐豆 11号 Xudou 11 R S R S R R S 42.9
17 徐豆 12号 Xudou 12 S S R S R R R 42.9
18 徐豆 1号 Xudou 1 S R R S R S S 57.1
19 阜豆 1号 Fudou 1 S R R S R S R 42.9
20 合豆 2号 Hedou 2 R R R S R R R 14.3
21 合豆 3号 Hedou 3 S R S S S R S 71.4
22 蒙庆 6号 Mengqing 6 S S R R R R R 28.6
23 青阳早黄豆 Qingyangzaohuangdou S S R R R R R 28.6
24 宿县 647 Suxian 647 S S R S R R S 57.1
25 五河大白壳 Wuhedabaike S S R S S S S 85.7
26 皖豆 4号 Wandou 4 R R R R R R R 0
27 皖豆 21 Wandou 21 S R R S R R S 42.9
28 皖豆 9号 Wandou 9 S S S S S S S 100.0
29 皖豆 24 Wandou 24 S R R R R R R 14.3
30 皖豆 19 Wandou 19 S S R S S S S 85.7
31 皖豆 1号 Wandou 1 S S S S R S S 85.7
32 皖豆 13 Wandou 13 S R R S R S S 57.1
33 皖豆 6号 Wandou 6 S R R S S S S 71.4
34 皖豆 3号 Wandou 3 S S S S S S S 100.0
35 科丰 36 Kefeng 36 R R R R R R R 0
36 科丰 37 Kefeng 37 S R R S R S R 42.9
37 科丰 35 Kefeng 35 S R R S R S S 57.1
38 科丰 53 Kefeng 53 R R S S R R R 28.6
39 诱变 31 Youbian 31 R R S S S S S 71.4
40 潍豆 6号 Weidou 6 S S R S S S S 85.7
41 莒选 23 Lüxuan 23 S S R S S S S 85.7
42 冀豆 4号 Jidou 4 S S R S R S S 71.4
43 丰收黄 Fengshouhuang S R R R R R R 14.3
44 即墨油豆 Jimoyoudou S S R R R R R 28.6
45 历城小粒青 Lichengxiaoliqing S S R S S S S 85.7
46 临豆 3号 Lindou 3 S R R S R S S 57.1
47 六十日金黄 Liushirijinhuang S S S S S S S 100.0
48 鲁豆 12 Ludou 12 R R R S R R R 14.3
侵染率 Infection percentage (%) 83.3 50.0 31.3 81.3 31.3 56.3 64.9
R: 抗病; S: 感病。R: resistant; S: susceptible.
1708 作 物 学 报 第 34卷



图 1 48个品种系统聚类
Fig. 1 Dendrogram of the tested 48 soybean cultivars
图中编号相对应的大豆品种与表 3一致。
The numbers in figure correspond to those listed in Table 3.

表 4 2对 RGA引物在 48个品种中检测到的多态性
Table 4 Polymorphism of the 48 soybean cultivars based on two pairs of RGA primers
代码
Code
总带数
Number of total bands
多态性带
Number of polymorphic bands
多态性带频率
Frequency of polymorphic bands (%)
RGA1 26 19 73.1
RGA2 27 20 74.1
合计 Total 53 39 73.6



图 2 引物 RGA1的部分品种 RGA指纹
Fig. 2 RGA fingerprints of partial soybean cultivars based on primers RGA1
第 10期 孙 石等: 大豆品种 RGA分析与疫霉根腐病抗性鉴定 1709




图 3 供试 48个品种 2对引物的 RGA指纹的树状聚类图
Fig. 3 Dendrogram of soybean cultivars based on RGA bands generated by two primer pairs
图中编号相对应的大豆品种与表 3一致。
The numbers in figure correspond to those listed in Table 3.

3 讨论
选育和种植高产抗病品种是减轻病害损失的重要
措施, 其中抗源的发掘利用和抗病基因的遗传分析是
抗病育种的基础。本研究表明我国的大豆蕴藏着丰富
的抗性资源, 这与前人的研究结果较为一致[25-26]。根
据 48份黄淮夏大豆种质资源对 7个大豆疫霉菌株抗
性反应的特点, 可将其划分为 8 个类群, 对这些不
同类群抗性种质的遗传分析和选择性利用, 不仅可
望从中挖掘新的抗性基因源, 而且可以提高大豆疫
霉根腐病抗性育种的效率。
RGA 分子标记与常用的中性分子标记(RAPD,
SSR)相比, 不仅能够揭示出材料间遗传背景的差异,
而且在一定程度上能反映出其抗性背景上的差异[15]。
自 1996年 Kanazin等[14]和 Yu等[16]首次利用抗病基
因编码产物的保守结构设计引物来分离大豆抗病性
相关的候选超基因家族的研究以来, 目前国内外已
利用 RGA方法研究多种作物遗传结构, 寻求与抗病
性相关的分子标记 , 从而进行分子标记辅助选择
(MAS)和控制病害[27-30]。李晔等[31]利用 RGA方法对
云南省 22 个主要栽培品种和地方资源品种的遗传多
样性进行聚类分析, 可以明显将品种的抗感水平分
开, 也与温室人工接种试验结果相似。
本研究把供试 48个品种按抗性表型和用 RGA-
PCR 的方法进行聚类分析, 结果没有显示出类与类
之间的一一对应关系, 但抗谱较广的品种, 能较好
地聚在一类。刘二明等[32]在利用 RGA分析法进行水
稻抗瘟性分类及品种与病菌谱系互作研究时, 也显
现出抗性基因与抗性表型聚类不完全对应的现象。
类与类之间没有呈现对应关系的原因可能有 2 个, 一
是从抗病基因到抗性表型是一个十分复杂的过程 ,
既涉及品种抗性基因本身, 也触及病原菌的无毒基
因与环境因素的互作; 二是本研究采用的 2对引物分
别来源于抗病基因的不同保守结构域, 因此检测到
的 RGA 片段不仅仅与大豆疫霉根腐病的抗性有关,
可能与更为广泛的抗性相关联。也许, 在了解更多
的大豆疫霉根腐病抗性基因结构的情况下, 通过设
计新的引物, 并与抗性表型分析的方法相结合, 这
个问题就能较好地解决。另外, 应用 RGA引物聚类
时, 亲缘关系近的能较好地聚在一类或相似程度高,
1710 作 物 学 报 第 34卷

如泗豆 11、徐豆 10号和徐豆 12号都具有美国品种
Williams的血缘。因此, 用 RGA-PCR进行聚类分析,
除反映出抗性基因同源序列相似性外, 也在一定程
度上体现品种的亲缘关系。
在大豆品种众多、抗性育种水平相对滞后的今
天, 可以将这两种方法结合应用, 既能从品种分子
遗传背景又能从抗性表型获得信息, 使之相互补充
完善。一方面, 在进行抗性育种时可利用本研究中
品种间相似系数较小、聚在不同类群中、可能携带
不同抗病基因的抗源做杂交亲本, 聚合不同的抗病
基因, 实现基因的累加, 使同一品种具有多个抗病
基因组合, 育成具有持久抗性的品种, 拓宽大豆抗
病种质的遗传基础; 另一方面, 在品种布局时采用
不同类型或遗传差异较大的品种搭配种植可减缓寄
主群体对病原菌的选择性压力, 达到持续控制大豆
疫霉根腐病的目的。
4 结论
本文筛选出一批具有不同抗性的优异抗源, 表
明黄淮地区蕴藏着丰富的大豆抗病资源。这些抗源
的遗传多样性较为丰富。尽管抗性表型和 RGA聚类
的类与类之间没有一一对应关系, 但抗谱广的品种,
能较好地聚在一类。因此 , 综合利用抗性表型和
RGA分析可以为大豆疫霉根腐病抗性基因鉴定、品
种的培育和合理布局提供一定的理论依据。
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