全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(9): 1597−1605 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)前期项目(2007CB116209)，河北省重点基础研究项目(08965525D)，河北省自然科学基金(C2007000476)
资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 肖凯, E-mail: xiaokai@hebau.edu.cn
Received(收稿日期): 2009-01-07; Accepted(接受日期): 2009-03-15.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01597
利用 cDNA-AFLP 技术分析小麦应答低磷胁迫的特异表达基因
谷俊涛 2 鲍金香 1 王效颖 1 郭程瑾 1 李小娟 2 路文静 2 肖 凯 1,*
1 河北农业大学农学院, 河北保定 071001; 2 河北农业大学生命科学学院, 河北保定 071001
摘 要: 以磷高效小麦品种石新 828为材料, 采用 cDNA-AFLP技术, 鉴定了短期(1~6 h)、中期(12~48 h)和长期(72~
144 h)低磷胁迫根系特异上、下调表达基因的表达序列标签(EST)。共有非重复的上调 ESTs 142个, 下调 ESTs 94个。
胁迫下的前者分别含短、中和长期 23、53和 66个; 后者分别含短、中和长期 17、39和 38个。对其功能比对发现, 上
调 ESTs在功能上归属于信号转导、转录调控、代谢、逆境响应、发育、物质运输、脂类代谢和功能未知等类别, 下
调 EST除上述类别外, 还含有蛋白质合成和降解等类别。部分转录因子基因(如水稻 OsPTF1和拟南芥 ZAT10高度同
源的转录因子基因)、促分裂原激酶基因 MAPK1a、钙依赖蛋白激酶基因 CPK1A 和蛋白激酶基因(如 serine/threonine
kinase)、高亲和磷转运蛋白基因(PHT3 和 PT2)、过氧化物酶基因 (如 peroxidase 73)和谷胱甘肽-S-转移酶基因
(glutathione S-transferase), 受到低磷胁迫的特异增强诱导, 在改善小麦植株对低磷胁迫的适应能力中可能具有重要
作用。研究表明, 小麦对低磷胁迫的响应, 在分子水平上存在着植株感受低磷胁迫信号和信号转导、进一步在生理生
化方面对胁迫信号产生应答等复杂的过程。
关键词: 小麦; 低磷胁迫; cDNA-AFLP; 特异表达基因; 基因功能类别
Investigation Based on cDNA-AFLP Approach for Differential Expressed
Genes Responding to Deficient-Pi in Wheat
GU Jun-Tao2, BAO Jin-Xiang1, WANG Xiao-Ying1, GUO Cheng-Jin1, LI Xiao-Juan2, LU Wen-Jing2, and
XIAO Kai1,*
1 College of Agronomy, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China, 2 College of Life Science; Agricultural University of Hebei,
Baoding 071001, China
Abstract: To date, differential expression genes in response to deficient-Pi stress have been identified and well studied in Arabi-
dopsis thaliana, and totally 612 up-regulated and 254 down-regulated genes with various functions were reported. However, there
is no similar report in wheat (Triticum aestivum L.). In this study, seedlings of wheat cultivar Shixin 828 with high phosphorus use
efficiency were treated with 20 µmol L−1 Pi for 1 to 144 h, and the differential expressed sequence tags (ESTs) with up-regulated
and down-regulated patterns were investigated based on cDNA-AFLP approach after deficient-Pi treatment for short term (1–6 h),
medium term (12–48 h), and long term (72–144 h). A total of 142 nonredundant ESTs with up-regulated pattern were identified, in
which 23, 53, and 66 ESTs expressed in treatments of short, medium, and long term, respectively. Simultaneously, 94 nonredun-
dant ESTs with down-regulated pattern were detected in treatments of short (17), medium (39), and long term (38). These ESTs
were classified into several functional groups with Blast in GenBank. Except for 44 function-unknown ESTs with the up-regulated
pattern, the remained up-regulated ESTs conferred functions of signal transduction, transcription regulation, metabolism, stress
response, development, transport, and lipid metabolism. Besides the above functions, protein synthesis and protein degradation
were also observed in the down-regulated ESTs. Some genes of transcription factors (such as the transcription factor genes with
high homologous to rice OsPTF1 and Arabidospsis ZAT10), mitogen activated protein kinase (MAPK1a), calcium-dependent pro-
tein kinase (CPK1A), and protein kinase (such as serine/threonine kinase), high-affinity phosphate transporter (PHT3 and PT2),
peroxidase (such as peroxidase 73) and glutathione (glutathione S-transferase) were specifically up-regulated under deficient-Pi
condition. This suggested that they might play important roles in promoting adaptation to deficient-Pi environment.
Keywords: Wheat (Triticum aestivum L.); Low-Pi stress; cDNA-AFLP approach; Expressed sequence tags (ESTs); Functional
classification of genes
1598 作 物 学 报 第 35卷

磷素是植物必需的大量营养元素之一。由于磷
素在土壤中的有效性低、移动性差, 磷素供应不足
经常造成植株生长发育和产量的限制。在缺磷条件
下, 植株的生化过程和形态发生明显的适应性变化[1]。
目前, 在拟南芥中已开展了较全面的植株应答
磷胁迫的特异表达基因鉴定研究[2-4]。如在短期(1~6
h)、中期(12~48 h)和长期(72~144 h)低磷胁迫条件下,
在拟南芥中分别鉴定了 612 个上调表达基因和 254
个下调表达基因[4]。其中, 鉴定的上下调特异表达基
因在功能上分别归属于信号感受、转导、转录调控、
代谢、物质运输、发育和逆境抵御等不同类别。表
明植物对低磷胁迫的响应, 在分子水平上是植株对
低磷逆境信号感受、信号在植株体内转导和下游相
关响应基因特异表达综合作用的结果[5]。
cDNA-AFLP 是将 RT-PCR(逆转录聚合酶链式
反应)和 AFLP(扩增片段长度多态性)两种技术组合
进而建立的系统分析基因差异表达的有效方法 [6],
具有反应条件严谨、退火温度高、重复性好等特点。
目前已被广泛用于许多植物种属基因的差异表达研
究[7-9], 为全面揭示植株应答环境信号和非生物逆境
基因, 进而阐明植株应答特定外部逆境的基因调控
网络提供了有效的技术途径。
迄今, 有关小麦应答低磷胁迫的转录谱特征尚
少见报道。本研究采用 cDNA-AFLP技术, 鉴定了小
麦不同低磷胁迫时间点的特异表达基因, 并用基因
比对方法鉴定其可能的生物学功能及其类别, 进一
步探讨部分小麦应答低磷胁迫基因的生物学功能。
旨在为进一步揭示小麦应答低磷胁迫响应的调控网
络奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及处理
以磷高效小麦品种石新 828 为材料[10], 在生长
室内用水培法培养小麦幼苗。在 25℃下进行种子催
芽, 选择发芽整齐一致的种子, 摆放在与培养液面
接触、孔径为 0.3 mm的不锈钢网上, 生长至三叶期。
其间选用的培养液为正常含磷量(2 mmol L−1 Pi)的
MS营养液。培养期间每 3 d更换一次培养液, 用气
泵供气。从三叶期开始, 进行植株低磷处理。将培
养液中的 Pi由 2 mmol L−1调整为 20 µmol L−1, 在处
理 1、3、6、12、24、48、72 和 144 h 后收获根系
样本, 以低磷处理前的同一批小麦根系为对照。
1.2 样品总 RNA提取和双链 cDNA的合成
参照产品说明书, 用 TRIzol 试剂盒(Invitrogen)
提取对照和各处理时间点的总 RNA。经过琼脂糖变
性胶进行总 RNA 浓度和质量检测后 , 利用双链
cDNA合成试剂盒(TaKaRa产品)合成双链 cDNA。
1.3 双链 cDNA纯化浓缩、限制性双酶切和接头
连接
采用苯酚 /氯仿 /异戊醇(25/24/1)溶液纯化双链
cDNA, 无水乙醇沉淀后浓缩, 加适量的灭菌蒸馏水,
依据 A260值将对照和各种低磷处理的双链 cDNA 含
量调整至相同浓度。常规方法进行 Mse I和 Pst I限
制性双酶切。其后, 在反应体系中加入 0.5 μL的 T4
DNA连接酶, Mse I接头和 Pst I接头各 1 μL, 以及
2.5 μL 10×T4 连接酶缓冲液, 进行接头连接。其中,
Mse I接头序列为 5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′(正
向)和 5′-TACTCAGGACTCAT-3′(反向); Pst I接头序
列为 5′-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3′(正向)和
5′-TGTACGCAGTCTAC-3′ (反向)。
1.4 cDNA-AFLP预扩增和选择性扩增
参照 Bachem等[6]的方法, 将完成限制性双酶切
和连接接头的产物进行 10×稀释, 进行预扩增。预扩
增反应的热循环程序为 95℃下 2 min, 随后为 30个
循环过程, 每个循环中包括 95℃变性 30 s, 56℃退火
30 s和 72℃延伸 1 min。完成后将预扩增产物于 4℃
保存。其中, 用于预扩增反应的引物为 M00 (5′-GAT
GAGTCCTGAGTA-3′)和 P00(5′-AGACTGCGTACA
TGCAG-3′), 分别与 Mse I和 Pst I的接头序列相匹
配。选用 16条 M引物和 16条 P引物进行选择性扩
增。其中, 16条 M引物分别与 Mse I的预扩增引物
匹配, 16条 P引物分别与 Pst I的预扩增引物匹配。
但上述引物的 3′-端较预扩增引物均增加 2~3个随机
碱基。每条M引物分别与 P引物进行组合, 共有 256
个引物对组合。用于选择性扩增的 M引物和 P引物
如表 1 所示。cDNA-AFLP 的选择性扩增程序为
95℃下 2 min后进行 13个下述热反应循环; 95℃变
性 50 s, 65℃退火 40 s, 72℃延伸 60 s; 95℃变性 50 s,
56℃退火 40 s, 72℃延伸 60 s, 31个循环; 72℃保温
10 min。对照和不同低磷处理时间点的各引物组合
均重复 3次。
1.5 cDNA-AFLP 产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳及
银染显影
采用常规技术进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色
和显影。室温下自然干燥胶板, 用扫描仪进行凝胶
上条扫描和数据保存。
1.6 差异条带 DNA再次 PCR扩增和克隆
从聚丙烯酰胺凝胶上切下重复间稳定一致的差
第 9期 谷俊涛等: 利用 cDNA-AFLP技术分析小麦应答低磷胁迫的特异表达基因 1599


异条带, 以 96℃处理 20 min。12 000×g离心 5 min
后, 吸取上清液 1 μL 作为再次 PCR 扩增反应的模
板。PCR 反应体系及程序与前述选择性扩增相同,
其中, 各 EST 再次扩增时选用的引物, 与 cDNA-
AFLP 中鉴定该特异表达 EST 的引物一致。PCR 产
物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后, 与 pUCm-T载体
(上海 Sangon)连接 , 转化感受态大肠杆菌菌株
DH5α。采用常规碱裂解法, 提取单菌落克隆质粒。进
一步用载体上含有的限制性切点 Eco RI和 Hin dIII对
质粒进行双酶切鉴定和 PCR检测。无误后测序(上海
Sangon), 获得 EST序列。
1.7 EST生物信息学分析和短、中和长期应答低
磷基因的划分
利用 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的
BLAST 工具与 GenBank 的 dbEST 数据库和蛋白数
据库, 进行特异表达基因同源性比较和功能分析。
参照网站 http://mips.gsf.de/proj/funcatDB/search_main_
frame.html的分类方法进行。参照 Misson等[4] 的方
法, 将低磷处理后 1~6、12~48和 72~144 h内特异表
达的基因划分为短、中和长期特异表达基因。
2 结果与分析
2.1 获得的应答低磷胁迫 EST数量
在短期、中期和长期不同低磷胁迫时间处理中,
分别鉴定了 142个特异上调表达的基因(EST)和 94个
特异下调表达的基因(EST)。其中, 在 142个上调基
因(EST)中, 短期、中期和长期低磷处理下的数量分
别为 23、53和 66个; 在 94个下调表达的基因(ESTs)
中, 短、中和长期低磷处理下的数量分别为 17、39
和 38 个。各时间区段鉴定的特异表达基因(EST)数
量, 均为上调多于下调。
2.2 应答低磷胁迫根系 EST生物学功能及分组
上调表达基因具有信号转导、转录调控、代谢、
逆境响应、发育、物质运输、脂类代谢和功能未知
等类别功能(图 1-A); 下调表达基因除具有与上调表
达基因相同的功能外, 还有蛋白质合成和蛋白质降
解等功能(图 1-B)。表明小麦植株对低磷胁迫的响应,
在分子水平上, 存在着植株感受低磷胁迫信号和信
号转导、进一步在生化代谢、生理过程和植株形态
多层次对胁迫信号应答的复杂分子生物学过程。
各时期鉴定的上、下调 EST的可能生物学功能
及分组如表 2 和表 3 所示。前人在拟南芥、水稻中
鉴定的应答低磷胁迫、维持植株磷素内稳态和改善
植株在低磷胁迫中具有重要作用的转录因子基因[4],
如 bHLH 型转录因子基因 PH85-16 PTF 转录因子
(USF4)和 C2H2 型锌指蛋白型转录因子 ZAT10
(USF5)、参与磷素吸收的磷转运蛋白基因 PHT3
(ULF14)和 PT2(ULF15), 在本研究中也得到了鉴定。
表明上述基因在小麦应答低磷胁迫和改善植株的磷
素吸收能力中可能具有重要作用。

表 1 用于小麦应答低磷胁迫基因鉴定的 cDNA-AFLP 引物
Table 1 Primers used in cDNA-AFLP for identification of differential expressed genes under deficient-Pi condition
M引物
M primer
P引物
P primer
M22: GAT GAG TCC TGA GTA GT P19: AGA CTG CGT ACA TGC AGG A
M24: GAT GAG TCC TGA GTA TC P25: AGA CTG CGT ACA TGC AGT G
M31: GAT GAG TCC TGA GTA AAA P31: AGA CTG CGT ACA TGC AGA AA
M33: GAT GAG TCC TGA GTA AAG P33: AGA CTG CGT ACA TGC AGA AG
M42: GAT GAG TCC TGA GTA AGT P34: AGA CTG CGT ACA TGC AGA AT
M43: GAT GAG TCC TGA GTA ATA P39: AGA CTG CGT ACA TGC AGA GA
M44: GAT GAG TCC TGA GTA ATC P43: AGA CTG CGT ACA TGC AGA TA
M45: GAT GAG TCC TGA GTA ATG P47: AGA CTG CGT ACA TGC AGC AA
M50: GAT GAG TCC TGA GTACAT P11: AGA CTG CGT ACA TGC AGAA
M60: GAT GAG TCC TGA GTACTC P44: AGA CTG CGT ACA TGC AGATC
M67: GAT GAG TCC TGA GTAGCA P49: AGA CTG CGT ACA TGC AGCAG
M76: GAT GAG TCC TGA GTAGTC P50: AGA CTG CGT ACA TGC AGCAT
M78: GAT GAG TCC TGA GTAGTT P52: AGA CTG CGT ACA TGC AGCCC
M83: GAT GAG TCC TGA GTATCA P54: AGA CTG CGT ACA TGC AGCCT
M84: GAT GAG TCC TGA GTATCC P59 :AGA CTG CGT ACA TGC AGCTA
M85: GAT GAG TCC TGA GTATCG P62: AGA CTG CGT ACA TGC AGCTT
1600 作 物 学 报 第 35卷



图 1 不同低磷胁迫时间下小麦根系上调(A)和下调(B)的特异表达基因的功能类别
Fig. 1 Functional classification of up-regulated (A) and down-regulated genes (B) under different low-Pi regimes
短、中和长期分别指 20 μmol L−1 Pi处理根系 0~6、12~48和 72~144 h。
Short-, mid-, and long-term denote roots treated with 20 μmol L−1 Pi with 0–6 h, 12–48 h, and 72–144 h, respectively.

表 2 短期(1~6 h)、中期(12~48 h)和长期(72~144 h)低磷处理上调特异表达 EST 的可能生物学功能
Table 2 Putative biological functions of differentially expressed ESTs with up-regulated pattern in different Pi treatments of short
term (1–6 h), medium term (12–48 h) and long term (72–144 h)
EST 基因
Gene
功能
Function
功能分类
Function classification
低磷处理 1~6 h Deficient-Pi treated for 1–6 h
USF1 mitogen-activated protein kinase MAPK1a † protein amino acid phosphorylation
USF2 protein kinase-like protein† protein amino acid phosphorylation
USF3 calcium-dependent protein kinase CPK1A † protein amino acid phosphorylation
signal transduction
USF4 PH85-16 PTF1 mRNA† transcription factor
USF5 zinc finger (C2H2 type) family protein (ZAT10) † transcription factor
transcription
USF6 pyruvate kinase enzyme
USF7 putative glutamate dehydrogenase enzyme
USF8 acetohydroxyacid synthase enzyme
metabolism
USF9 dehydrin WZY2 mRNA response to biotic stress
USF10 myosin heavy chain VIII A2 response to biotic stress
stress response
USF11–USF23 function unknown (13)
第 9期 谷俊涛等: 利用 cDNA-AFLP技术分析小麦应答低磷胁迫的特异表达基因 1601


(续表 2)
EST 基因
Gene
功能
Function
功能分类
Function classification
低磷处理 12~48 h Deficient-Pi treated for 12–48 h
UMF1 phospholipase D intracellular signaling cascade
UMF1 protein kinase family protein ‡ protein amino acid phosphorylation
signal transduction
UMF2 zinc finger (C3HC4-type RING finger) family protein ‡ transcription factor
UMF3 AP2 domain-containing transcription factor‡ transcription factor
UMF4 myb family transcription factor ‡ transcription factor
transcription
UMF5 expansin-related protein ‡ morphegensis
UMF6 proline-rich family protein contains proline-rich region root morphegensis
UMF7 expansin family protein (EXPR3) DNA methylation
development
UMF8 hexose transporter transport
UMF9 amino acid transporter transport
UMF10 heavy-metal-associated domain-containing protein transport
UMF10 sulfate transporter transport
trafficking
UMF12 peroxidase ‡ enzyme response to oxidative stress
UMF13 glutathione S-transferase‡ enzyme response to oxidative stress
UMF14 pathogenesis-related protein response to biotic stress
UMF15 senescence-associated protein-related aging related
stress response
UMF16 short-chain dehydrogenase/reductase (SDR) enzyme
UMF17 cytochrome P450 electron transport
UMF18 dihydroflavonol 4-reductase anthocyanin biosynthesis
UMF19 AAA-type ATPase family protein similar to zinc dependent protease enzyme
UMF20 NADPH oxidase-like enzyme
metabolism
UMF21–UMF53 function unknown (33)
低磷处理 72~144 h Deficient-Pi treated for 72–144 h
ULF1 protein kinase-like protein protein amino acid phosphorylation
ULF2 protein kinase family protein protein amino acid phosphorylation
signal transduction
ULF3 inorganic pyrophosphatase phosphatase
ULF4 galactinol synthase carbohydrate biosynthesis
ULF5 tropine dehydrogenase aging
ULF6 bisphosphoglycerate mutase family protein glycolysis
ULF7 PEP carboxylase tricarboxylic acid cycle
ULF8 glutamate decarboxylase amino acid metabolism
ULF9 acireductone dioxygenase enzyme
ULF10 quinone oxidoreductase - like NADP-dependent oxidoreductase
ULF10 S-adenosyl-L-methionine carboxyl methyltransferase
metabolism
ULF12 lipase class 3 family protein lipid synthesis
ULF13 phosphoinositide-specific phospholipase C DNA methylation
lipid metabolism
ULF14 inorganic phosphate transporter (PHT3) Pi transport
ULF15 phosphate transporter (PT2) Pi transport
ULF16 lipid transfer protein lipid transport
ULF17 cation exchanger, putative (CAX7) ion transport
ULF22 putative protein 21K protein precursor invertase
trafficking
ULF18 MtN3-like protein endomembrane system
ULF19 ethylene-forming-enzyme-like dioxygenase oxidoreductase
development
ULF20 protein phosphatase 2C ABI1 response to abscisic acid stimulus
ULF21 peroxidase 73 response to oxidative stress
stress response
ULF23–ULF66 function unkown (44)
† 低磷短期处理上调表达的 EST在中期处理继续上调表达; ‡ 低磷中期处理上调表达的 EST在长期处理继续上调表达。
† ESTs up-regulated in short term treatments were further up-regulated in medium term treatments. ‡ ESTs up-regulated in mid-term
treatments were further up-regulated in long term treatments.

1602 作 物 学 报 第 35卷

表 3 短期(1~6 h)、中期(12~48 h)和长期(72~144 h)低磷处理下调特异表达 EST 的可能生物学功能
Table 3 Putative biological functions of differentially expressed ESTs with down-regulated pattern in deficient-Pi treatments of short
term (1–6 h), medium term (12–48 h), and long term (72–144 h)
EST 基因
Gene
功能
Function
功能分类
Function classification
低磷处理 1~6 h Deficient-Pi treated for 1–6 h
DSF1 guanine nucleotide-binding family protein † signalling signal transduction
DSF2 basic helix-loop-helix (bHLH) family protein † regulation of transcription transcription
DSF3 PSII D1 protein processing enzyme proteolysis and peptidolysis
DSF4 endo-1,4-beta-glucanase † carbohydrate metabolism
DSF5 RuBPcase large subunit † carbohydrate metabolism
metabolism
DSF6 acyl-[acyl-carrier-protein] desaturase fatty acid metabolism
DSF7 lipid transfer protein (LTP) lipid transport
lipid metabolism
DSF8 high-affinity nitrate transporter nutrient transport trafficking
DSF9 stress-responsive protein † response to abscisic acid stimulus stress response
DSF10–DSF17 function unknown (8)
低磷处理 12~48 h Deficient-Pi treated for 12–48 h
DMF1 two-component responsive regulator two-component signal transduction
DMF2 thioredoxin family protein‡ phosphatase
signal transduction
DMF3 homeobox-leucine zipper protein‡ regulation of transcription
DMF4 G-box binding factor 1 regulation of transcription
transcription
DMF5 60S ribosomal protein L14 ‡ protein synthesis
DMF6 40S ribosomal protein S10 protein synthesis
DMF7 peptide chain release factor‡ chloroplast organization and biogenesis
DMF8 ribosomal protein S6 protein synthesis
protein synthesis
DMF9 glycosyl hydrolase family 3 protein carbohydrate metabolism
DMF10 endo-1,4-beta-glucanase ‡ carbohydrate metabolism
DMF11 RuBPcase large subunit carbohydrate metabolism
metabolism
DMF12 heat shock protein protein folding
DMF13 auxin response factor 7b regulation of abiotic stress responding
stress response
DMF14–DMF39 function unknown (26)
低磷处理 12~48 h Deficient-Pi treated for 12–48 h
DLF1 serine/threonine kinase protein amino acid phosphorylation
DLF2 phosphate-responsive 1 family protein protein amino acid phosphorylation
signal transduction
DLF3 myb family transcription factor regulation of transcription
DLF4 RNA methyltransferase RNA processing
DLF5 RNA polymerase sigma subunit SigF transcription initiation
DLF6 protein transcription termination factor nusB regulation of transcription, DNA-dependent
transcription
DLF7 aspartyl protease family protein protein degradation protein degradation
DLF8 40S ribosomal protein S17 protein synthesis protein synthesis
DLF9 glycosyl hydrolase family carbohydrate metabolism
DLF10 aldose 1-epimerase galactose metabolism
metabolism
DLF11 phosphoethanolamine N-methyltransferase 3 phosphoethanolamine N-methyltransferase lipid metabolism
DLF12 glutaredoxin family protein transport
DLF13 high-affinity nitrate transporter NRT2 nitrogen transport
DLF14 trigger factor type chaperone family protein protein transport
trafficking
DLF15 plant defensin protein response to insect stress response
DLF16–DLF38 function unknown (23)
† 低磷短期处理下调表达的 EST在中期处理继续下调表达; ‡ 低磷中期处理下调表达的 EST在长期处理继续下调表达。
† ESTs down-regulated in short term treatments were further down-regulated in medium term treatments. ‡ ESTs down-regulated in me-
dium term treatments were further down-regulated in long term treatments.

第 9期 谷俊涛等: 利用 cDNA-AFLP技术分析小麦应答低磷胁迫的特异表达基因 1603


在上、下调应答低磷胁迫的特异表达 EST 中,
表现的规律有所不同。如鉴定的上调特异表达 EST
中, 表达水平表现为仅在短期特异上调, 以后在中、
长期保持相对稳定, 或在短、中期表达水平不断增
强, 在长期和中期相近, 以及短、中和长期随胁迫时
间延长不断增强等不同特征。同样, 下调特异表达
EST在应答低磷逆境的表达规律上与上调相似。
3 讨论
在低磷胁迫处理下, 拟南芥基因组中的许多基
因表达发生特异的上、下调变化[4]。本研究发现, 有
许多功能类别不同的基因 , 在短期 (1~6 h)、中期
(12~48 h)和长期(72~144 h)不同处理条件下表达水
平明显变化。其中, 包括 142个上调 EST和 94个下
调表达 EST。在基因功能类别上, 分别归属于信号
转导、转录调控、代谢、逆境响应、发育、物质运
输、脂类代谢、蛋白质合成及降解和功能未知等功
能类别。表明小麦对低磷胁迫的响应过程, 在分子
水平上, 是对低磷信号感受、转导和下游功能基因
应答等综合作用的结果。
在低磷胁迫下, 植株在生理、生化和形态学水
平上发生明显的适应性变化。如侧根增多和根体构
型改变, 以扩大根系对土壤磷素的吸收面积和能力,
进而提高植物对磷胁迫的适应能力[11-12]。此外, 低
磷胁迫诱导了植株根系高亲和吸收磷素系统活力增
强、有机酸类物质的分泌量增多、植株体内的碳代
谢和次生代谢发生变化 [1]。本研究鉴定的应答低
磷胁迫的特异表达基因中, 有 1个调控根系形态特征
的基因 proline- rich family protein containing proline-
rich region(UMF6), 该基因通过上调表达, 在调控小
麦鳞胁迫下的根体适应性变化中具有较重要作用。
植株在生理生化上对低磷胁迫的应答, 较大程
度上起因于信号转导后转录调控水平的改变。烟草
bZIP型转录因子 Phi-2[13]、拟南芥型 Myb型转录因
子 PHR1[14]、水稻 bHLH转录因子 OsPTF1[15]和拟南
芥WRKY型转录因子 WRKY75[16], 低磷胁迫下的表
达水平发生较大变化, 在维持植株体内的磷素内稳
态和增强植株的耐低磷能力中具有重要作用。本研
究中 , 在低磷胁迫上调表达的 EST 中 , 与水稻
OsPTF1 和拟南芥 ZAT10 高度同源的转录因子基因
(USF4和 USF5), 在试验短、中和长期胁迫中的表达
呈不断增强特征, 表明上述转录因子基因在小麦应答
低磷逆境和抵御低磷胁迫中具有较大的调控效应。
植物磷转运蛋白参与了植株对生长介质中磷素
的吸收和磷素在细胞和组织中的转运, 迄今在不同植
物种属中已克隆和鉴定了多个磷转运蛋白基因[17-20]。
在低磷胁迫下, 部分磷转运蛋白基因表现明显的诱
导增强表达特征, 在改善植株对低磷水平下磷素的
吸收和加快磷素在植株体内的转运中具有重要作能
用[21-22]。如超表达水稻高亲和磷转运蛋白基因 OsPT1
的转基因植株 , 能显著增加植株的磷素吸收能力 ,
与对照植株相比, 低磷条件下植株的长势明显得到
改善[21]。此外, 在烟草的悬浮细胞中超表达拟南芥
的高亲和磷转运蛋白基因 AtPT1, 也具有显著改善
烟草遗传转化细胞在磷胁迫下磷素吸收和生长特性
的功能[22]。本研究中, 与磷转运蛋白 PHT3 和 PT2
高度同源的两个基因(ULF14 和 ULF15)在低磷逆境
下特异增强表达, 表明上述基因在应答低磷胁迫和改
善植株增强对低磷胁迫的适应能力中具有重要作用。
蛋白质磷酸化是植物生物和非生物逆境信号转
导系统中的重要信号传递元件。其中, 钙依赖蛋白
激酶(CDPK)和促分裂原激酶(MAPK)信号级联传递
途径介导逆境信号转导的分子机制研究已有较多报
道。研究表明, 小麦 CPK1~CPK20 中的部分成员参
与了对干旱、盐分胁迫、低温、H2O2逆境等非生物
逆境的响应和对激素脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)的
应答 [23]。用离体叶片为试验材料的研究表明 ,
CDPK1 参与了外源蔗糖诱导的信号转导途径的信
号磷酸化过程[24]。表明小麦中的 CDPK基因也较广
泛参与了非生物逆境和发育信号的调控过程。迄今,
对拟南芥、烟草、番茄和水稻的研究发现, MAP 激
酶级联途径也广泛参与了病原生物胁迫信号、非生
物逆境信号、激素信号和发育信号等多种不同信号
的转导过程[25-28]。本研究中, 不少介导植株体内信
号转导的蛋白激酶基因发生特异性增强表达, 如促
分裂原激酶基因 MAPK1a(USF1)、钙依赖蛋白激酶
基因 CPK1A(USF3)和部分蛋白激酶基因 (USF2、
UMF1、UMF2、ULF1 和 ULF2)。表明小麦植株体
内感受低磷胁迫信号的转导通路中, 有上述保守蛋
白激酶信号转导系统MAPK和 CDPK途径和部分特
定蛋白激酶的参与。
磷胁迫等非生物逆境条件下, 会导致植物细胞
内自由基增加, 使自由基代谢平衡遭到破坏, 进而
使植株生理功能衰退[29]。对小麦研究表明, 较强的
细胞保护酶活性通过减轻低磷逆境下的活性氧伤害,
维持植株较强的生理功能, 是某些品种具有较强耐
1604 作 物 学 报 第 35卷

低磷能力的重要生化基础之一[30]。本研究鉴定的上、
下调特异表达基因中, 均含有较多的逆境响应基因,
如上调表达中的 USF9-USF10、UMF12-UMF15 和
ULF20-ULF21。其中, 2 个过氧化物酶(UMF12 和
ULF21)和 1个谷胱甘肽-S-转移酶(UMF13)在中、长
期低磷胁迫处理中特异上调, 表明上述基因在增强
植株对低磷胁迫诱发的活性氧清除、进而缓解植株
活性氧清除系统的失衡中具有较重要的作用。
本研究在低磷胁迫下调表达的基因中, 鉴定了
多个与蛋白质合成和分解相关的基因。如 60S 核糖
体蛋白 L14(DMF5)、40S 核糖体蛋白 S10(DMF6)、
肽链释放因子(DMF7)和核糖体蛋白 S6(DMF8)以及
40S 核糖体蛋白 S17(DLF8)等蛋白质合成相关基因,
和天冬氨酸蛋白酶(DLF7)蛋白质降解相关基因。表
明在低磷胁迫条件下, 除转录调节发生明显的改变
外, 植株体内蛋白质翻译水平上也发生明显变化。
转录和翻译的共同调节作用, 进一步引发植株在生
化代谢、生理过程和植株形态对低磷胁迫产生应答。
本研究中, 已知生物学功能的上调表达 EST 为
51个, 占总数(142)的 35.92%, 已知生物学功能的下
调表达EST为 37个, 占总数(94)的 39.36%。其中, 上
述未知功能的上、下调 EST GenBank序列比对其相
似性最大对应的多为基因组 DNA 或功能未知的
mRNA。这可能与小麦基因组与已完成基因组测序
的拟南芥、水稻差异较大, 这与上述模式植物多数
基因功能未知, 以及迄今有关小麦功能基因组的研
究尚少有关。
4 结论
鉴定非重复的 142个上调和 94个下调 EST。上
调 EST在功能上归属于信号转导、转录调控、代谢、
逆境响应、发育、物质运输、脂类代谢和功能未知
等类别, 下调 EST 除上述类别外, 还含有蛋白质合
成和降解等类别。部分转录因子基因 (如水稻
OsPTF1 和拟南芥 ZAT10 高度同源的转录因子基
因)、促分裂原激酶基因 MAPK1a、钙依赖蛋白激酶
基因 CPK1A 和蛋白激酶基因 (如 serine/threonine
kinase)、高亲和磷转运蛋白基因(PHT3 和 PT2)、过
氧化物酶基因(如 peroxidase 73)和谷胱甘肽-S-转移
酶基因(glutathione S-transferase), 受到低磷胁迫逆
境的特异增强诱导, 在改善小麦植株对低磷胁迫的
适应能力中可能具有重要作用。
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