全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(5): 921−927 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30871494), 教育部博士点基金(200803890006), 福建省自然科学基金(2007J0304, 2008J0042)和福建
省重点学科经费资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 林文雄, E-mail: lwx@fjau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: liqisong0591@163.com
Received(收稿日期): 2011-07-08; Accepted(接受日期): 2011-12-19; Published online(网络出版日期): 2012-03-05.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120305.1039.013.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00921
水稻籽粒蛋白双向电泳条件的优化及其蛋白组学方法的比较
李奇松 陈 军 林世圣 李 忠 张志兴 林文雄*
福建农林大学生命科学学院农业生态研究所 / 福建农林大学作物生理与分子生态重点实验室, 福建福州 350002
摘 要: 探讨适用于籽粒蛋白组学研究的策略, 对深入研究籽粒的发育过程具有重要的意义。本文对比了 3 种不同
的蛋白提取方法, 优化了双向电泳中自制管胶一向的等电聚焦条件和 IPG 干胶条一向的等电聚焦时间, 以 MALDI-
TOF/MS、Western blot 和磷酸化蛋白组学 3 个重要的蛋白质组学研究方法对胶内蛋白质鉴定分析。结果表明, 可溶
性蛋白提取法最适用于籽粒蛋白组学的研究; 电泳条件优化后, 得到了较优的 2-DE 图谱; 胶内蛋白点适用于质谱分
析、蛋白表达量验证(Western blot)及籽粒蛋白的磷酸化组学的研究。本研究为下一步在蛋白组水平上分析籽粒发育
提供了技术支持。
关键词: 水稻; 籽粒; 蛋白组学; 双向电泳; 蛋白磷酸化
Optimization of Two-Dimensional Electrophoresis Condition for Rice Grain
Protein and Comparison of Relevant Proteomic Methods
LI Qi-Song, CHEN Jun, LIN Shi-Sheng, LI Zhong, ZHANG Zhi-Xing, and LIN Wen-Xiong*
Institute of Agricultural Ecology, School of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University / Key Laboratory of Crop Physiology and Mo-
lecular Ecology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
Abstract: A suitable proteomic strategy for rice grain protein research is important for further understanding rice grain develop-
ment at proteome level. In this study, three different protein extraction methods were compared and then electrophoretic condi-
tions of hand-made gel lands and IPG lands in IEF (isoelectric focusing) were optimized. Furthermore, three important proteomic
research strategies (MALDI-TOF/MS, western-blot and phosphoproteome) were used for identification and analysis of in-gel
proteins. The results showed that the method of soluble protein extraction was most suitable for investigation of grain proteomics,
with a well-distributed 2-DE gel profile under optimized electrophoretic conditions, and it was confirmed that MALDI-TOF/MS,
western-blot and phosphoproteome were the three suitable methods for the analysis of in-gel proteins. The establishment of the
suitable system for rice grain proteomic research paves the way for the next step to further analyse rice grain development at pro-
teome level.
Keywords: Rice; Grain filling; Proteomics; Two-dimensional electrophoresis; Protein phosphorylation
水稻籽粒灌浆对产量及品质至关重要。前人的工作
主要集中在生理水平的研究上, 例如分析籽粒中的激素、
淀粉合成酶等相关生理指标的变化[1-3]。然而, 籽粒的灌
浆是个复杂的生理生化过程, 涉及 269个基因的表达变化[4],
单靠几个生理指标无法深层次地揭示其机制。目前, 蛋白
质组学技术在水稻[5]、拟南芥[6]、大豆[7]、烟草[8]等植物
中已广泛应用, 而且随着研究的深入, 在磷酸化蛋白质组
学研究方面, Agrawal等[9]发现了油料种子(B. napus)发育
过程中有 243个磷酸化蛋白表达量发生变化, 对油料种子
发育调控机制进行了深入的探索。由此可见, 蛋白组学技
术在推动植物学的研究中起到了重要作用。然而, 由于受
籽粒中多糖等物质的影响, 较难提取籽粒总蛋白, 影响了
蛋白质组学技术在籽粒中的应用。在前人已发表的关于水
稻籽粒蛋白质组学研究的文献中 [10] , 所采取的蛋白提取
方法各不相同, 且缺乏详细的蛋白提取方法介绍。因此,
本文对比了 3种在植物组织中常用的蛋白提取方法, 明确
了最优的籽粒蛋白提取方法。在此基础上, 对籽粒蛋白组
学研究所涉及的关键技术做了进一步的优化, 例如双向电
泳参数, 质谱鉴定技术、磷酸化蛋白质组学技术和Western
blot免疫印迹技术等 , 提出了较详尽的籽粒蛋白组学研
922 作 物 学 报 第 38卷

究策略, 对水稻籽粒蛋白质组学的研究具有重要的借鉴
意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料与试剂
2010 年 6 月在福建农林大学教学农田种植本实验室
所选育的超大穗型水稻(Oryza sativa L. ssp. indica)品种
“金恢”。插植规格为 15 cm×15 cm, 按常规高产栽培技术管
理。取花后第 21天籽粒, 以液氮速冻, 置−80℃冰箱保存。
丙烯酰胺(ACR)、甲叉双丙烯酰胺(BIS)、十二烷基
硫酸钠(SDS)、TEMED、溴酚蓝等试剂购自上海生工生物
工程有限公司; PMSF、β-巯基乙醇、载体两性电解质pH
3~10 和pH 5~8 为GE Healthcare公司产品; 碘乙酰胺、
NP-40、DTT、胰蛋白酶等购自Sigma公司、Pro-Q DPS
(Invitrogen); 碳酸氢铵(色谱纯)、PVP (聚乙烯吡咯烷酮)、
PVPP (聚乙烯吡咯烷酮)、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、
碳酸氢铵、尿素、硫代硫酸钠、过硫酸铵、铁氰化钾、碳
酸钾、无水乙醇、丙酮、氢氧化钠、磷酸、浓盐酸、醋酸、
乙酸钠、硝酸银、碳酸钠、甲醛、三氯乙酸、牛血清白蛋
白等试剂均为国产分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 籽粒总蛋白提取 称取 3 g水稻籽粒, 加液氮、
石英砂和少量PVP (约 0.2 g)研磨成细粉, 分别采用TCA/丙酮
提取法[11]、苯酚提取法[12]、可溶性提取法[10]制备样品。
1.2.2 蛋白质裂解与定量 以TCA/丙酮提取的蛋白质
干粉 , 按 10 μL∶1 mg (裂解液 /蛋白质 )的比例加入
CHAPS裂解液(7 mol L−1尿素, 2 mol L−1硫脲, 65 mmol L−1
DTT, 4% CHAPS), 以其余 2种蛋白质提取法所得的蛋白
干粉, 均加入 200 μL裂解液。20~25℃下在超声波清洗器
中超声处理 30 min, 每 3 min振荡 30 s。25℃, 12 000×g离
心 25 min, 取上清液备用。用Brandford方法测定浓度。
1.2.3 蛋白质电泳 参照Laemmli的SDS-PAGE方法[13],
采用 5%的浓缩胶和 12%的分离胶进行电泳分离, 电泳参
数为固定电压 300 V, 10 mA 30 min, 25 mA 2 h至指示剂到
达胶的底部。用考马斯亮蓝R-250染色。
根据本研究所之前建立的自制管胶(2-DE)方法[11]。
第一向电泳参数为, 200 V 30 min, 300 V 30 min, 400 V 30
min, 500 V 30 min, 600 V 30 min, 800 V 16.5 h, 1 000 V 4 h,
1 200 V 2 h, 电泳温度 20℃。第二向电泳同样采用 5%的
浓缩胶和 10%的分离胶分离, 电泳参数为, 15 mA 30 min,
20 mA 2 h, 25 mA至指示剂到达胶的底部。采用硝酸银染
色法染色 [14]。使用 Imagescan (GE Healthcare, Uppsala,
Sweden) 扫描胶片 , 并用软件 ImageMaster 2D Platinum
5.0 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)分析图像。
参照GE Healthcare 24 cm IPG双向电泳操作手册进
行IPG-IEF(2-DE)。第二向SDS-PAGE凝胶为 12%分离胶,
以 15 mA恒定电流进行电泳, 溴酚蓝移动至胶条底部即
可停止 , 采用考马斯亮蓝法染色。使用 Imagescan (GE
Healthcare, Uppsala, Sweden) 扫描胶片, 并用软件Image-
Master 2D Platinum 5.0 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)
分析图像。
1.2.4 蛋白质点胶内酶解 参照Peng等[15]的方法略作
修改。挖取差异蛋白质点, 在 1 1∶ 的 0.03 mol L−1铁氰化
钾和 0.1 mol L−1硫代硫酸钠混合液中脱色(考马斯亮蓝染
色的胶粒用 50%乙腈脱色); 57℃条件下 0.01 mol L−1 DTT
溶液中还原 1 h, 0.055 mol L−1碘乙酰胺溶液烷基化 1 h
(IPG-IEF胶内蛋白点可省去还原烷基化); 用 12.5 ng µL−1
胰岛素酶缓冲液 4℃下水化 30 min, 并在 37℃下, 0.05 mol
L−1碳酸氢铵溶液中酶切 14 h。分别用 0.02 mol L−1碳酸氢
铵溶液、含 5%TFA的 50%乙氰、100%乙氰萃取酶切产物。
1.2.5 MALDI-TOF/MS (基质辅助激光解吸电离飞行时
间质谱)分析 使用德国BRUKER公司的ultrafleXtreme
MALDI III-TOF质谱仪分析样品。采用反射模式, 质谱信
号单次扫描累加 50次, 激光频率 1 000 Hz。基质为HCCA
(α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid)饱和液, 基质溶解液为
40%乙氰和 60%溶解有 0.1%TFA的双蒸水。用 2 µL
0.5%TFA溶液溶解肽段, 按 1 1∶ 将样品溶液和基质溶液
混合后点样, 自然干燥后, 在反射正电模式下分别批量自
动采集MALDI TOF一级图谱和MALDI TOF/TOF二级图
谱 。 用 MascotSearch 软 件 (http://www.atrixscience.com/
search_form_select.html)查询质谱分析所得数据。查询条
件为肽段分子量最大误差范围 1×10−4, 种属选择水稻(Oryza
sativa), 不完全裂解位点 1个, 选择NCBInr数据库链。
1.2.6 2-D 胶内磷酸化蛋白 Pro-Q DPS 染色 参照
Molecular ProbesPro-Q DPS操作说明。
1.2.7 水稻籽粒热激蛋白(HSP)Western b1ot 分析 应
用本研究提取的总蛋白质, 经 SDS-PAGE电泳, 电转移至
硝酸纤维素膜进行 Western 印迹杂交。将滤纸 2层、0.45
硝酸纤维素膜(NC)、凝胶、滤纸 2层按顺序先后叠放于盛
有电泳转移缓冲液的容器中, 浸泡 15 min后, 恒压 100 V
在 1 L含 20%甲醛电极缓冲液中转移 90 min, 将 NC膜置
封闭液中封闭。漂洗, 加入相应的一抗 Anti-HSP (1∶3 000
稀释)室温孵育 2 h, 洗涤。加入辣根过氧化物酶标记羊抗
鼠抗体, 室温下于摇床孵育 2 h, 洗涤, 用 HRP、DAB试
剂盒在室温下染色 8 min, 显色后扫描。
2 结果与分析
2.1 不同提取方法获取水稻籽粒蛋白质的差异
2.1.1 提取效率 由表 1 可以看出, 苯酚提取法所得
样品浓度最高, 达 11.8 mg mL−1, TCA/丙酮提取法所得样
品浓度最低, 仅 2.29 mg mL−1, 不利于电泳上样, 可溶性
提取法所得样品浓度适中, 为 4.78 mg mL−1。进一步分析
显示, TCA/丙酮提取法的蛋白质得率最高, 达 0.229%, 而
可溶性蛋白提取法最低, 仅为 0.031%。总体表现为: TCA/
丙酮法>苯酚提取法>可溶性提取法。可见不同的蛋白质
提取法在提取水稻籽粒蛋白质中存在着明显差异。
2.1.2 蛋白质 SDS-PAGE图谱 对于上样量均为 50 μg
的 SDS-PAGE (图 1), 可溶性提取法条带多且清晰, 条带
第 5期 李奇松等: 水稻籽粒蛋白双向电泳条件的优化及其蛋白组学方法的比较 923


表 1 3 种总蛋白质提取方法比较
Table 1 Comparison of three protein extraction protocols
方法
Method
蛋白质样品体积
Protein sample volume
(mL)
浓度
Concentration
(mg mL−1)
蛋白得率
Protein yield
(%)
储存蛋白含量
Storage protein
content
蛋白点数
Spot
可溶性提取法 Soluble protein extraction method 0.2 4.78±0.113 0.031±0.0008 低 Low 693±18
TCA/丙酮提取法 TCA-acetone method 3.0 2.29±0.136 0.229±0.0136 高 High 600±31
苯酚提取法 Phenol extraction method 0.2 11.8±0.107 0.078±0.0007 中Medium 545±25
蛋白质得率 = 浓度×蛋白质样品体积/鲜样质量×100%。
Protein yield = Concentration×Protein sample volume/Fresh sample quality×100%.




图 1 3 种提取方法的水稻籽粒蛋白的 SDS-PAGE 图谱
Fig. 1 SDS-PAGE profiles of total proteins extracted from rice
grains using three protocols
M: 标准分子量蛋白质; A: 可溶性提取法; B: 苯酚提取法;
C: TCA/丙酮提取法。
M: protein marker; A: soluble protein extraction method; B: phenol
extraction method; C: TCA-acetone method.
均匀分布在 116.2~14.4 kD间, 谷蛋白含量少; 苯酚提取
法条带模糊且背景高, 样品中杂质和谷蛋白含量高; TCA/
丙酮提取法条带少, 高分子量蛋白部分缺失, 裂解后蛋白
浓度太低, 仅 2.29 mg mL−1。
2.1.3 蛋白质的双向电泳 利用 3 种方法提取的水稻
籽粒蛋白样品, 选用长度为 17.5 cm自制管胶, 两性电解
质pH 3~10 与两性电解质pH 5~8 比例为 1 5∶ , 上样量为
170 µg, 在其他条件一致的情况下, 双向电泳, 结果见图 2。
通过 ImageMaster 2D Platinum 5.0图谱分析, 对得到
的蛋白点数并结合蛋白得率、浓度、储存蛋白含量进行比
较(表 1和图 2)。TCA/丙酮提取法双向图谱中有 600个蛋
白质点, 但是背景高, 纵条纹多, 假点较多, 储存蛋白含
量高; 苯酚提取法双向图谱背景较低, 但是分离得到的蛋
白点最少, 仅 545 个, 储存蛋白含量居中。可溶性提取法
的双向图谱清晰, 蛋白点数最多, 有 693 个, 裂解后蛋白
浓度适中, 储存蛋白少; 表明可溶性提取法最适合籽粒的
蛋白质样品制备。
2.2 可溶性提取法提取的水稻籽粒蛋白双向电泳条件优化
2.2.1 自制管胶不同电解质比例对 2-DE图谱影响 如
图 3所示, 两性电解质pH 3~10与pH 5~8比例为 1 3∶ 时,



图 2 3 种方法提取的水稻籽粒蛋白 2-DE 图谱
Fig. 2 Two-dimensional gel electrophoresis images obtained from the total protein of rice grains following three protocols
A: TCA/丙酮提取法; B: 苯酚提取法; C: 可溶性提取法; a, b, c: 不同提取法 2-DE胶内相同部位的储存蛋白。
A: soluble extraction method; B: phenol extraction method; C: TCA-acetone method; a, b and c show the storage protein at the same region of
2-DE images of different protocols.
924 作 物 学 报 第 38卷



图 3 不同两性电解质比例的 2-DE 图谱(上样量均为 170 µg)
Fig. 3 2-DE images obtained from different ampholyte ratios
(loading 170 µg protein sample)
A: 电解质比例 1:3; B: 电解质比例 1:5。
A: ampholyte ratio 1:3; B: ampholyte ratio 1:5.

得到的 2-DE 图谱中蛋白点清晰, 分布均匀, 且无明显重
叠现象, 多数呈规则的圆形, 无明显的横纵条纹干扰, 点
的重复性好。两性电解质比例为 1 5∶ 时, 图谱上的蛋白
质点过于集中, 出现重叠现象, 不利于后续分析。
2.2.2 IPG-IEF 不同聚焦时间对蛋白质双向电泳图谱的
影响 为进一步验证可溶性提取方法双向电泳的适用
性, 应用 IPG-IEF, 并对水稻籽粒蛋白 IPG 聚焦程序进行
优化。图 4为 2种不同电泳程序(表 2)的水稻籽粒蛋白 2-DE
图谱, 表明用 24 cm IPG (pH 4~7)胶条(上样量 1.2 mg), 当
第二步聚焦为 1 000 V 2 h时, 蛋白质聚焦未充分, 2-DE胶
图上的蛋白质点出现较多的横条纹(图 4-A, a), 而当第二
步聚焦为 1 000 V 6 h时, 蛋白质聚焦充分, 2-DE胶图上的
蛋白质点呈现圆点, 无横向拖尾(图 4-B, b)。
2.3 质谱兼容性分析
为了判断 2-DE 上的蛋白点是否可用于蛋白质程序
分析, 把其中的部分蛋白点挖出(图 4-B), 进行质谱分析。
结果得到优质的肽质量指纹图谱(图 5-a), 图谱信噪比高, 对
其中的肽段 1 373.732 进行二级质谱分析, 结果 y 离子全
序列匹配(图 5-b), 得到高分数鉴定结果(表 3)。
2.4 2-DE胶内磷酸化蛋白 Pro-Q DPS染色分析结果
对于验证可溶性提取法对 Pro-Q DPS 磷酸化染色的
适用性, 图 6 表明胶内的磷酸化蛋白得到有效检测, 通过



图 4 不同电泳程序 2-DE 图谱对比
Fig. 4 Comparison of 2-DE images obtained from different electrophoretic procedures
A: 优化前电泳程序; B: 优化后电泳程序; a、b为上图框内区域放大图。
A: electrophoretic procedures before optimization; B: electrophoretic procedures after optimization;
a and b are the enlargement of regions in A and B.

表 2 2-DE 电泳程序优化
Table 2 Optimization of 2-DE Electrophoretic procedures
优化前电泳程序
Electrophoresis procedures before optimization
优化后电泳程序
Electrophoresis procedures after optimization 步骤
Step 升压方式
Pattern boosted voltage
电压
Voltage (V)
时间
Time (h)
升压方式
Pattern boosted voltage
电压
Voltage (V)
时间
Time (h)
1 Step 500 1 Step 500 1
2 Grd 1000 2 Grd 1000 6
3 Grd 8000 3 Grd 8000 3
4 Grd 8000 4 Grd 8000 4
5 Step 3000 30 Step 3000 30
第 5期 李奇松等: 水稻籽粒蛋白双向电泳条件的优化及其蛋白组学方法的比较 925




图 5 2-DE 胶内蛋白质点肽段指纹图谱
Fig. 5 Peptide mass fingerprinting (PMF) of protein spots in 2-DE gel
a: 一级肽段指纹图谱; b: 肽段 1373.732的二级肽段指纹图谱。
a: first-order peptide mass fingerprinting; b: second-order peptide mass fingerprinting of peptide 1373.732.

表 3 2-DE 胶内蛋白点 MALDI-TOF/TOF 质谱鉴定结果
Table 3 MALDI-TOF/MSMS results of protein spots in 2-DE gel
蛋白点编号
Spot No.
登录号
Accession No.
蛋白名称
Protein name
得分
Score
分子量/等电点
MW/pI
匹配肽数
Matched peptides
种属
Species
1 Gi|115463081
叶绿体 70 kD热激蛋白相似
Similar to stromal 70 kD heat
shock-related protein, chloroplast
479 48 676/4.57 3 水稻
Oryza sativa
2 Gi|3370780 几丁质酶
Chitinase
273 27 983/6.28 1 水稻
Oryza sativa
3 Gi|20159 19 kD 谷蛋白前体
19 kD globulin precursor
136 21 492/7.51 2 水稻
Oryza sativa
4 Gi|115452513 病原体相关蛋白
Pathogen-related protein
175 17 277/5.85 1 水稻
Oryza sativa
5 Gi|115489474 CROC-1相似蛋白
Similar to CROC-1-like protein
147 16 768/6.42 2 水稻
Oryza sativa

ImageMaster 2D Platinum 5.0分析, 发现有 486个磷酸化
修饰蛋白质点。
2.5 水稻籽粒热激蛋白(HSP) Western b1ot分析结果
建立在双向电泳基础上的差异蛋白质组学 , 需要
Western b1ot 免疫印迹的进一步验证, 通过对水稻蛋白中
热激蛋白(HSP)免疫印迹分析(图 7)表明, 在分子量 75 kD
处显出条带。



图 6 2-DE 胶磷酸化染色图谱
Fig. 6 Image of 2-DE gel with Pro-Q DPS stain


图 7 水稻籽粒蛋白中热激蛋白(HSP)免疫印迹
Fig. 7 Immunoblotting of heat shock protein (HSP) in rice
grains protein
M: 标准分子量蛋白质; S: 可溶性提取法所得样品。
M: protein marker; S: sample prepared by soluble protein extraction
method.
926 作 物 学 报 第 38卷

3 讨论
3.1 籽粒蛋白提取
水稻籽粒中的多糖、核酸、无机离子、大分子有机
质等严重影响籽粒蛋白的提取, 此外, 籽粒中富含的谷蛋
白也严重影响后续的双向电泳。前人认为TCA/丙酮提取
法适用于植物组织蛋白提取, 耗时少且容易操作, 沉淀蛋
白质迅速且钝化其内的蛋白酶 [16], 然而本研究的SDS-
PAGE结果表明采取该方法所获得的籽粒蛋白条带不够清
晰, 这是由于籽粒中多糖可同时被丙酮沉淀, 导致蛋白不
易裂解, 且蛋白样品浓度低, 同时谷蛋白不能有效去 除,
导致电泳图谱背景高。苯酚提取法有效地消除了多糖、核
酸等干扰物质, 在提取成熟水果(番茄、香蕉、橙)蛋白时
表现优越 [17], 但是该方法使用的试剂毒性大 , 蛋白损失
较大, 谷蛋白去除不彻底, 且提取步骤繁琐, 2-DE图谱中
蛋白质点最少。相对于TCA/丙酮提取法, 可溶性提取法,
溶液配制相对复杂, 耗时较长且蛋白得率低, 但能最有效
地去除谷蛋白、多糖、核酸等干扰, 而且所选用试剂毒性
小, 2-DE图谱中蛋白质点最多, 背景清晰。
此外 , 在样品制备过程中 , 需要用液氮充分预冷研
钵, 加入样品前加入少许 PVP (0.2 g 左右)可有效去除多
酚杂质; 籽粒在液氮中硬度大, 研磨耗时较多, 提取过程
中必须保持样品处于低温状态; 蛋白质干粉的裂解是样
品制备的重要步骤 , 本研究在裂解过程中结合低温超声
破碎和快速漩涡振荡技术, 不仅促进了蛋白质的溶解, 一
定程度上解决了蛋白得率低的问题 , 同时可减少样品中
核酸分子的干扰。
3.2 电泳及胶片染色
上样量和电泳环境的控制相对容易, 自制管胶上样
量有限 , 为(160±30) µg, 多选择灵敏度高的硝酸银染色
方法, 24 cm IPG胶条上样量较大, 为(1.2±0.5) mg, 多选
择跟质谱兼容性较好的考马斯亮蓝法染色 , 上样量可根
据胶染色结果进行调整。等电聚焦过程中温度是重复性好
的重要保证, 自制管胶电泳可放置于恒温箱中, IPG-IEF
胶条在电泳过程中要完全浸泡于矿物油中 , 保持恒定温
度, 并及时补充矿物油。在一向胶转第二向胶时, 注意排
除一向胶接触面气泡, 并用琼脂糖固定, 可避免产生纵条
纹。要得到涵盖尽量多蛋白点的电泳图谱, 合适的电解质
比例是至关重要的, 本实验结果表明, 自制管胶的载体两
性电解质的使用比例决定了图谱中蛋白质点的分布 , 当
电解质 pH 3~10和 pH 5~8的比例为 1 3∶ 时, 电泳图谱中
蛋白质点得到充分的分离。商业化胶条操作说明并不适用
于所有样品 , 聚焦时间过长或太短都会使蛋白质点出现
横纹; 低电压除盐不充分, 会导致聚焦时不能达到最高电
压, 本研究对于 IPG胶条的聚焦时间做了优化, 当程序中
1 000 V电泳时间为 2 h时, 蛋白点聚焦不充分, 尤其酸性
蛋白出现明显拖尾, 当 1 000 V延长到 6 h时, 蛋白充分聚
焦 , 样品除盐更加充分 , 解决了电泳过程中升压困难问
题。胶染色是得到高质量 2-DE 图谱的最后一步, 尤其在
银染过程中, 为了降低背景, 首先染色盒子应依次使用洗
衣粉、回收固定液和双蒸水洗涤干净, 每次触胶时都要更
换新的手套; 其次, 采用的甲醛应是新开封的, 而且要现
用现加; 最后, 银染过程要严格闭光, 显影前要严格控制
水洗时间。
3.3 质谱鉴定与Western blot分析
得到高分辨率、高重复性的水稻籽粒蛋白 2-DE图谱
是水稻籽粒蛋白质组学研究的基础, 质谱技术、磷酸化蛋
白质组学和Western blot技术是蛋白质组学研究的重要方
法。质谱技术已成为蛋白质组学研究中强有力的工具和核
心技术[18]。质谱分析是双向电泳后续蛋白质定性的重要
方法, 只有目的蛋白质得到鉴定, 才能对水稻籽粒蛋白进
行功能分析。质谱分析的质量取决于质谱样品的制备, 蛋
白酶解过程中人体角蛋白污染和细节操作不当都会导致
蛋白鉴定失败, 因此酶解最好在超净台中进行, 同时要带
好一次性手套和口罩, 还原和酶切两个步骤中必须将EP
管倒置于恒温箱, 防止水分蒸发过多。本研究将胶内的 5
个蛋白质点经胶内酶解后进行MALDI-TOF/MS分析 , 均
获得高质量的鉴定结果。此外, Western blot分析是进一步
验证质谱结果准确性和蛋白表达量的重要手段。然而, 所
采取的蛋白提取方法和实验操作不当 , 会造成目的蛋白
Western blot分析失败。因此, 为保证顺利转膜, 实验过程
中要保证滤纸、膜、胶和海绵之间没有气泡存在, 电极连
接正确, 电转时间要根据目的蛋白分子量来调整, 分子量
较大的蛋白需要适当延长; 显色时, 为避免背景过高, 在
目的条带显出时立即停显。本研究用免疫印迹法(Western
blot)检测出了水稻保守蛋白HSP, 因此可溶性提取的籽粒
蛋白可用于免疫印迹分析。
此外, 磷酸化蛋白质组学是研究蛋白翻译后磷酸化
修饰的重要方法 , 磷酸化研究是当今蛋白组学研究的新
热点 , 蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的
整个过程 [19], 因此应用磷酸化蛋白质组学技术研究水稻
籽粒灌浆 , 对揭示其机制具有重要作用。在使用Pro-Q
DPS进行磷酸化染色时, 经常会使图谱背景过高, 如果出
现这种情况可将胶再次水洗 20~30 min, 可降低背景, 但
是水洗时间不宜过长, 否则会降低信号强度。本研究应用
Pro-Q DPS染色剂对 2-DE胶进行检测, 得到了高分辨率的
磷酸化图谱, 发现有 486个磷酸化的水稻籽粒蛋白得到检
测 , 说明可溶性蛋白提取法也适用于籽粒蛋白的磷酸化
鉴定 , 这一结果暗示着蛋白可逆的磷酸化修饰在水稻籽
粒灌浆过程中起着重要的调节作用 , 磷酸化蛋白质组学
技术在水稻籽粒研究方面具有十分重要的应用前景。
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更正: 发表在本刊 2012年第 2期 360−368页的文章“非生物胁迫诱导的 GmMYB基因克隆与表达分析”一
文作者刘晋跃增加第二单位“中国科学院研究生院”。