全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(4): 641649 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项(nycytx-27-gw101)和重庆市蚕桑重大科技专项(CSTC, 2009AA1024)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 余茂德, E-mail: yumd@163.com, Tel: 023-68250191
第一作者联系方式: E-mail: speker@163.com ** 共同第一作者
Received(收稿日期): 2010-09-13; Accepted(接受日期): 2011-01-06.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00641
三个桑树肌动蛋白基因的克隆与组织表达分析
李 军 赵爱春** 王茜龄 张琼予 黎其友 金筱耘 李镇刚 余茂德*
西南大学生物技术学院, 重庆 400715
摘 要: 肌动蛋白基因在植物各种生理活动中具有极其重要的作用。通过同源克隆与反向 PCR的方法, 克隆了 3个
肌动蛋白基因的核心片段, 其中一个为已报道的 MaACT1, 另 2 个分别被命名为 MaACT2 和 MaACT3, 进而 PCR 扩
增获得 MaACT1和 MaACT2肌动蛋白全长 CDS, 其中 MaACT2基因全长 1 704 bp, 由 4个外显子和 3个内含子组成,
CDS为 1 134 bp, 编码 377个氨基酸残基。采用 RT-PCR的方法分析了 3个基因在叶、茎、果、根等组织的表达情况
以及在茎、叶和托叶的生长过程中的表达变化。MaACT1 在茎中表达量较弱但有随着茎的生长逐渐增强的趋势, 在
幼叶中有较高的表达, MaACT2与 MaACT3在根、茎、叶等组织中都有较高表达, MaACT3在叶、托叶和茎的各个发
育时期表达都很稳定, 可以作为桑树基因表达研究的内参基因。
关键词: 桑树; 肌动蛋白; 基因克隆; 表达分析; 进化
Molecular Cloning and Tissues Expression Analysis of Three Actin Genes from
Mulberry (Morus alba)
LI Jun, ZHAO Ai-Chun**, WANG Xi-Ling, ZHANG Qiong-Yu, LI Qi-You, JIN Xiao-Yun, LI Zhen-Gang,
and YU Mao-De*
Collage of Biotechnology of Southwest University, Chongqing 400715, China
Abstract: Actins play extremely important roles in plants. To date, no full-length cDNA actin genes have been reported in mul-
berry. In this study, we cloned three core fragments, two full CDS, and one full-length genomic sequence of actin genes from
mulberry by means of homologous cloning and PCR strategy. The three mulberry actin genes obtained were designated MaACT1,
MaACT2, and MaACT3. The full length of MaACT2 is 1 704 bp, which contains four exons and three introns. A putative CDS of
MaACT2 (1 134 bp in length) encodes 377 amino acid residues. The RT-PCR analysis showed that MaACT1 had lower expres-
sions in various tissues and organs than those of MaACT2 and MaACT3. The expression level of MaACT1 in stem was very low at
beginning and increased gradually with the development of stem, while its expression was relatively high in young leaf. MaACT2
and MaACT3 had high and stable expressions in root, leaf, and stem, especially MaACT3 was expressed stably at different devel-
opmental stages. Therefore, MaACT3 is considered as a good candidate of internal reference gene in mulberry.
Keywords: Morus alba; Actin; Gene cloning; Expression analysis; Evolution
肌动蛋白是真核生物中普遍存在的一种古老的
蛋白质, 它是构成细胞骨架的主要成分, 执行着重
要的生理功能, 如参与细胞分裂、胞质环流、延长
生长等[1]。同时, 肌动蛋白也是研究植物发育的一个
重要物质。肌动蛋白在花粉管细胞胞质中形成了非
常精密的结构, 并在花粉管生长的过程中提供所需
的能量[2-4]。此外, 由于部分肌动蛋白基因表达量较
高且稳定, 因此常被用作基因表达分析的内参[5]。在
高等植物中, 肌动蛋白都是由基因家族编码的[6]。目
前已经有很多植物肌动蛋白基因被克隆和分析, 但
主要集中在拟南芥、棉花、水稻、烟草等模式植物
和经济作物上[7-10]。
桑树(Morus alba)是一种重要的经济作物, 桑叶
是家蚕正常生长发育的唯一饲料, 桑椹具有较高的
营养价值和保健作用。随着对桑树研究的不断深入,
桑树发育机理研究是今后研究的重要方向之一。
2008年, Pan等[11]报道了第一条桑树肌动蛋白序列片
段, 但没有后续的研究。目前在桑树转基因研究中
642 作 物 学 报 第 37卷
采用的都是外源的泛素、35S等通用启动子, 容易出
现基因沉默和表达量较低的现象, 如果采用内源性
强启动子可以有效避免这种现象。本研究以嘉陵 30
(为 2009 年重庆市审定的果桑品种)的叶片为材料, 通
过分子克隆技术, 找到一个在各时期和各组织表达
量均较高且稳定的肌动蛋白基因, 可作为桑树定量
分析的内参。试验结果也为桑树内源性强启动子的
克隆奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选取嘉陵 30健壮枝条上第 3~5叶位的叶片, 用
液氮速冻后保存于–80℃冰箱中备用。质粒载体
pMD19 simple vector、Taq DNA聚合酶、反转录酶
M-MLV、T4 DNA连接酶、限制性内切酶 Dra I、PshB
I、EcoR I、和 EcoR V均购自大连宝生物公司。胶
回收试剂盒、质粒抽提试剂盒均购自 Omega 公
司。引物(表 1)均由南京金斯特公司合成, 大肠杆菌
(Escherichia coli)菌株 DH5α购自上海生工生物工程
技术服务公司。
1.2 基因组 DNA、RNA的提取及 cDNA的合成
采用改进的 SDS 法提取桑树基因组 DNA[12]。
取 100 mg幼嫩组织于预冷的研钵中, 加入液氮研磨
成粉状, 加入 400 L的提取缓冲液(0.4 mol L–1 NaCl;
10 mmol L–1 Tris-HCl, pH 8.0; 2 mmol L–1 EDTA, pH
8.0)混匀, 加入 20% SDS 40 L, 10 mg L–1蛋白酶
K 8 L, 充分混匀; 55℃保温 1 h以上; 加入 6 mol L–1
NaCl溶液 300 L充分混匀; 在 4℃用 10 000×g离心
30 min, 取上清液; 加入 0.7倍的异丙醇, 充分混匀,
于–20℃静置 1 h; 用灭菌牙签挑出白色絮状物, 以
70%乙醇洗两次, 自然干燥; 加入适量 TE 溶解, 取
2 L用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, 并用紫外分光光
度计检测 DNA的浓度。
各取 50 mg桑叶等新鲜组织于预冷的研钵中加
液氮迅速研磨成粉末状, 参照 TaKaRa 公司 RNA 抽
提试剂盒说明书提取总 RNA, 最后用 50 L DEPC
水溶解 RNA, 0.8%琼脂糖变性凝胶电泳检测后, 紫
外分光光度计测定浓度。以总 RNA为模板, 以 Oligo
d(T)18为引物, 利用M-MLV反转录酶合成 cDNA第
一链, 置–80℃保存备用。
1.3 肌动蛋白核心片段的克隆
从 GenBank 上下载植物肌动蛋白的氨基酸序列,
通过 ClustalX 2.0.12 (http://www.clustal.org/)软件进
行氨基酸的多序列比对, 根据比对结果找到保守区
域, 利用软件 Primer 5.0 (http://www.primer-e.com/)
设计简并引物 P1与 P2 (表 1), 以 cDNA为模板进行
PCR扩增, 其程序为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 30
s; 57℃退火 30 s; 72℃延伸 1 min; 72℃延伸 5 min;
PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后, 切下目的条
带 , 用 Omega 胶回收试剂盒回收 , 回收产物与
pMD19-T simple vector 载体相连接, 转化 DH5感
受态细胞, 最后对筛选到的阳性克隆进行测序分析。
表 1 本研究使用的引物
Table 1 Primers used in this study
引物名称
Primer name
序列
Sequence
P1 5′-GA(C/T)AA(C/T)GG(A/G/C/T)AC(A/G/C/T)GG(A/G/C/T)ATGGT-3′
P2 5′-GG(A/G/C/T)GG(A/G/C/T)GC(A/G/C/T)AC(A/G/C/T)AC(C/T)TT(A/G/T)AT-3′
P3 5′-TCTGTGAGGTCACGTCCAGC-3′
P4 5′-TTGCCTTGGACTACGAGCAGG-3′
P5 5′-AACCCTCGTAGATAGGAACG-3′
P6 5′-CTGAACGGGAAATTGTTAGGG-3′
P7 5′-CCTCATCCCCTACATAGGC-3′
P8 5′-CTACCTGATGGACAGGTGA-3′
P9 5′-ATGGCAGATGGTGAGGAAATTC-3′
P10 5′-TTAGAAGCACTTCCTATGAAC-3′
P11 5′-TGCTATTCTCCGTCTCGACCTT-3′
P12 5′-GAGCAAGGGCTGTGATCTCC-3′
P13 5′-CGAAGGCTATGCCCTTCCAC-3′
P14 5′-GCTCATCCGATCAGCAATACCC-3′
P15 5′-AGAACACCCTGTTCTCCTCACT-3′
P16 5′-GATGACCTGTCCATCTGGCAA-3′
第 4期 李 军等: 三个桑树肌动蛋白基因的克隆与组织表达分析 643
1.4 反向 PCR扩增肌动蛋白基因组侧翼序列
取 10 g基因组 DNA, 分别加入 Dra I、PshB I、
EcoR I、和 EcoR V各 1 L消化过夜, 取适量用 0.8%
琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。选择酶切效果较好
的酶切产物用乙醇沉淀法回收, 加入 T4 DNA 连接
酶连接过夜, 用乙醇沉淀法回收连接产物备用。根
据已经获得的 3条肌动蛋白片段设计反向 PCR引物
P3~P8 (表 1), 分别以回收的连接产物—桑树基因组
酶切环化产物作为模板, 扩增肌动蛋白核心片段两
侧的片段以期获得肌动蛋白基因的整个编码区。
1.5 肌动蛋白基因生物信息学分析
结合 NCBI 已经报道的植物肌动蛋白基因和桑
树 3′EST, 分析本实验获得的 3个肌动蛋白基因的序
列结构。根据推测的编码框来设计引物对 P9和 P10
(表 1), 并以 cDNA为模板通过 PCR的方法扩增得到
MaACT1和 MaACT2全长 CDS。通过 NCBI数据库
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析肌动蛋
白保守结构域。利用软件 SWISS-MODEL Automated
Mode (http://swissmodel.expasy.org/)预测肌动蛋白的
三维结构, 并用软件 Swiss-PdbViewer (http://spdbv.
vital-it.ch/)展示获得的三维结构。
1.6 肌动蛋白基因组织特异性分析
根据 3 个肌动蛋白序列设计各自的特异引物
P11~P16 (表 1), 以总 RNA为分析标准, 通过 RT-PCR
检测 3 个肌动蛋白基因的在根、茎、叶、果实中表
达情况以及在叶、茎和托叶发育过程中的时期表达
情况。
2 结果与分析
2.1 桑叶总 RNA 的提取与肌动蛋白核心片段的
获得
按照 TaKaRa的 RNA抽提试剂盒说明书提取桑
树第五叶位叶片的总 RNA (图 1)。根据肌动蛋白保
守序列设计的兼并引物 P1和 P2, 以总 RNA反转录
得到的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增, 最终得到约
1 000 bp的条带(图 2)。随机挑取 10个阳性克隆测序,
经序列比对其中包括了 3 个不同的肌动蛋白基因片
段, 其中一个肌动蛋白基因已被报道(GenBank 登录
号为 DQ785808), 在此被命名为MaACT1, 另外 2个
肌动蛋白基因分别被命名为 MaACT2和 MaACT3。
2.2 反向 PCR扩增肌动蛋白基因组全序列
分别根据上述得到的肌动蛋白 cDNA 核心区,
设计反向 PCR 引物, 以基因组环化产物作为模板进
行扩增, 以肌动蛋白 MaACT2 的引物 P3 和 P4 扩增
得到一条约 2.2 kb的片段(图 3), 测序后通过拼接发
现此序列中包含了肌动蛋白整个编码框, 该基因全
长 1 704 bp (图 4), 由 3个内含子和 4个外显子组成
(图 5), 与拟南芥[13]肌动蛋白基因的结构完全相同, 编
码区长 1 134 bp, 编码 377个氨基酸残基, 不同的是
在内含子, 桑树的 MaACT2 三个内含子都比拟南芥
的要长。通过对桑树 3′EST 的检索与比对发现, 一
条 EST (GenBank登录号为 ES448844)与基因序列完
全匹配, 证实该基因存在 313 bp的 3′UTR区, 但在
UTR序列中并没有发现明显的多聚腺苷酸加尾信号
AATAA。
图 1 桑叶总 RNA电泳图
Fig. 1 Electrophoresis analysis of total RNA in mulberry leaf
M: Trans 2000; 12: Total RNA.
图 2 扩增的肌动蛋白基因核心片段电泳图
Fig. 2 Electrophoresis analysis of actin DNA fragments by
PCR
M: Trans 2000; 1~2: PCR扩增产物。
12: Products of PCR amplification.
图 3 反向 PCR扩增 MaACT 2
Fig. 3 Reverse PCR of MaACT 2
1–2: Dra I; 3–4: PshB I; 5–6: EcoR V; 7: EcoR I; M: Trans 2000.
644 作 物 学 报 第 37卷
图 4 MaACT2全长克隆
Fig. 4 Cloning of full-length cDNA of MaACT2
M: Trans 2000; 1: 全长 cDNA; 2: 基因组 DNA。
1: Full-length of cDNA; 2: Genomic DNA.
此后 , 设计基因特异引物扩增肌动蛋白全长
CDS基因序列, 以Oligo d(T)18为引物合成的 cDNA
为模板, 通过 PCR扩增, 获得一条 1.1 kb左右的片
段(图 4)。经克隆测序发现, 其中一个克隆与上面由
MaACT2 基因组序列推导出的 cDNA 序列同源性为
100% (图 6), 而且也获得另一个克隆, 测序并分析确
定为 MaACT1 的全长 CDS 基因, 2 个肌动蛋白基因
推导氨基酸序列相似度为 96%。我们获得的 3 条肌
动蛋白基因序列已经在 GenBank 注册, MaACT1、
MaACT2 和 MaACT3 登录号分别是 HQ163774、
HQ163775和 HQ163776。
2.3 桑树肌动蛋白进化分析
将获得的 3条肌动蛋白基因片段的DNA序列利
用MEGA4.0进行了进化分析, 并用小鼠 α肌动蛋白
2 (GenBank 登录号为 NM_033268)作为外群, 构建
其 NJ 进化树(图 7)。MaACT2 和 MaACT3 首先聚于
进化树同一节点 , 然后再和 MaACT1 相聚 , 说明
MaACT2 和 MaACT3 这两个基因在亲缘关系及功能
上可能比 MaACT1 更为相近, 该结果在表达谱分析
的结果中得到证实。
为了探索桑树肌动蛋白与其他植物肌动蛋白基
因的进化关系, 选取来自杨树、棉花和拟南芥的 39
个肌动蛋白基因, 利用它们的完整的氨基酸序列构
建 NJ 进化树(图 8), 以酵母肌动蛋白和棉鼠 β 肌动
蛋白基因作为外群。进化分析发现来源于植物的肌
动蛋白被分为两个明显的亚群 Class I和 Class II, 该
结果与 Zhang等[14]所构建的结果相似。由于MaACT3
序列不完整, 因此没有采用, 来源于桑树的两个肌
动蛋白基因分别归入两个亚群, 说明桑树肌动蛋白
基因也同其他植物一样出现了基因重复事件并发生
了功能的分化。
2.4 肌动蛋白组织表达性分析
通过 RT-PCR 分析了 3 个肌动蛋白基因在 8 个
不同组织的表达情况, 以及这 3 个基因在第 1~5 叶
位的托叶、第 1~13叶位叶片以及第 1~7叶位的茎段
中的表达变化。引物 P11和 P12扩增 MaACT1基因,
P13和 P14扩增 MaACT2, P15和 P16扩增 MaACT3,
3个肌动蛋白基因分别扩增的片段长度分别为 445、
445和 448 bp。
2.4.1 肌动蛋白组织特异性分析 分别提取位于
第 7 叶位的茎段、叶片、叶柄、托叶、韧皮部、表
皮以及桑果实的总 RNA, 利用 RT-PCR 分析各基因
在植物各组织的表达情况(图 9)。经分析发现, 肌动
蛋白 MaACT2和 MaACT3在桑树的叶、茎、托叶、
叶柄、果实、表皮、韧皮部和桑根中都有表达, 其
中 MaACT2 在各组织中的表达具有一定的差异, 但
表达量都较高, 而MaACT3在各组织稳定高量表达。
图 5 MaACT2基因结构图
Fig. 5 Sketch map of MaACT2
A: MaACT2; B: 拟南芥 ACT12。
A: MaACT2; B: Arabidopsis thaliana ACT12.
第 4期 李 军等: 三个桑树肌动蛋白基因的克隆与组织表达分析 645
图 6 MaACT2 cDNA序列及推导氨基酸序列
Fig. 6 cDNA and cDNA-derived amino acid sequences of MaACT2
方框部分为起始密码子和终止密码子, 下画线为多聚腺苷酸尾。
Initiation codon and termination codon are shown in quadrangles, and Poly A is underlined.
图 7 桑树肌动蛋白基因进化关系
Fig. 7 Phylogenetic tree of three genes in mulberry
MaACT1 则呈现不同的表达模式, 在不同组织中表
达量具有明显的差异 , 在叶中具有较高的表达量 ,
在其他组织中没有检测到表达。
2.4.2 肌动蛋白在桑树的托叶、茎和叶片不同生长
阶段的 RT-PCR 分析 托叶是植物幼叶的保护器
官, 它在桑树芽越冬以及春季幼叶的初始发育中起
保护作用, 在养蚕业中桑托叶生长发育状况还标志
着桑树叶片的成熟程度, 有利于家蚕幼虫期适熟叶
的采收。本实验提取第 1~5 叶位的托叶、第 1~8 叶
位的不同节间的茎段和第 1~13叶位的叶片总 RNA。
以 RT-PCR 分析了各基因在托叶、叶片和茎段生长
过程中的表达情况(图 10~图 12), 结果表明, 在托叶
中 , MaACT2 和 MaACT3 的表达非常稳定 , 而
MaACT1在第 1~4叶位的托叶中表达量很低, 在第 5
叶位的托叶中表达有所增强。
在桑树茎段的表达分析中发现, MaACT2 表达
存在极其微弱的上升趋势; MaACT3 的表达则较为
稳定; MaACT1的表达量虽然总体很弱, 但是在不断
增强。这个实验结果暗示 MaACT1 在桑茎的发育中
起了某种重要的功能。在叶片中MaACT2和MaACT3
的表达也较为稳定, MaACT1在第 1~6叶位的叶片中
有较强的表达, 在第 7~13 叶位的叶片中表达量较低,
然而在第 9~11 叶位的叶片中出现了一个增长的表
达, 且这个结果在重复 3 次以后仍得到相似的结果,
具体原因尚不清楚, 有待进一步研究分析。
2.4.3 肌动蛋白结构分析 通过GenBank数据库
分析 MaACT2 保守结构域(图 13), 发现氨基序列中
含有保守的 ATP、Gelsolin 和 Profilin 结合位点, 属
于肌动蛋白家族。肌动蛋白具有 4 个结构域(图 14),
646 作 物 学 报 第 37卷
图 8 桑树肌动蛋白基因与来自棉花、拟南芥和杨树的肌动蛋白基因之间的进化关系
Fig. 8 Phylogenetic relationship of the Morus alba actin genes to actins from cotton, Arabidopsis thaliana, and poplar
图 9 肌动蛋白基因组织特异性表达分析
Fig. 9 Tissue-special expression analysis of genes
1: 茎; 2: 叶; 3: 叶柄; 4: 托叶; 5: 韧皮部; 6: 表皮; 7: 果实; 8: 根。
1: stem; 2: leaf; 3: petiole; 4: stipule; 5: phloem; 6: phloem;
7: fruit; 8: root.
图 10 肌动蛋白托叶时期表达特异性分析
Fig. 10 Expression analysis of actins in stipula
1~5: 第 1~5叶位的托叶。
1–5: Stipula between the first and fifth leaves.
图 11 肌动蛋白茎时期表达特异性分析
Fig. 11 Expression analysis of actins in shoot
1~7: 第 1~7叶位的茎段。
1–7: Stem between the first and the seventh leaves.
在结构域 I中存在 DNA酶结合环, 为肌动蛋白中关
键的区域, 所以肌动蛋白的变异大多出现在结构域
I和 IV中。本实验发现的 2个肌动蛋白基因 MaACT
1和 MaACT2仅在结构域 IV中存在极小的差异, 但
表达模式完全不同, 暗示这两个肌动蛋白基因具有
不同的生物学功能。目前对拟南芥肌动蛋白研究得
比较清楚, AtACT2 倾向于在幼嫩的组织中表达[15],
第 4期 李 军等: 三个桑树肌动蛋白基因的克隆与组织表达分析 647
本实验中 MaACT1 的表达模式与其相似。将豌豆肌
动蛋白 PeACT1, 拟南芥 AtACT2和桑树 MaACT1进
行比对(图 15)发现 3 个基因在第 201 位、第 237 位
和第 241 位氨基酸出现了类似的替换, 在第 201 位
由 S 取代了 M, 第 237 位 A 取代 S, 第 241 位 S 取
代 N, 暗示这几个突变可能与它们的功能有直接的
联系。
图 12 肌动蛋白叶的时期表达特异性分析
Fig. 12 Expression analysis of actins in leaves
1~13: 第 1~13位叶。
1–13: leaves from the first to the thirteenth.
图 13 MaACT2结构域预测分析
Fig. 13 Predication analysis of domain of MaACT2
图 14 肌动蛋白三维结构
Fig. 14 3-D structure of actins
3 讨论
本研究采用同源克隆与反向 PCR法相结合克隆
了桑树中 3 个肌动蛋白基因的核心片段, 且克隆了
一个完整的肌动蛋白基因, 并明晰了该基因的结构,
发现桑树这个肌动蛋白基因不仅在氨基酸序列上非
常保守, 而且在基因结构上也非常保守, 由 4 个外显
子和 4 个内含子组成。通过进化分析发现桑树的这
3 个肌动蛋白基因中 MaACT2 先和 MaACT3 聚在一
起 , 最后再与 MaACT3 相聚 , 说明 MaACT2 和
MaACT3 这 2 个基因在亲缘关系及功能上可能比
MaACT1 更为相近。RT-PCR 结果显示 MaACT2 和
MaACT3 在各个组织都有较稳定的表达 , 其中
MaACT3 更为稳定。MaACT1 在桑的叶、茎和叶柄
中有表达, 这些组织中表达并不稳定,在靠近茎尖的
几位叶中有较高的表达, 在离茎尖越远的几位叶中
表达相对较低; 在茎中的表达呈现逐渐增强的模式,
说明该基因倾向于在幼嫩的组织中表达。在细胞的
整个生命周期过程中 , 细胞骨架是至关重要的 ,
MaACT2 和 MaACT3 表达高且稳定, 因此推测这一
类基因可能在细胞骨架的形成与维持中具有重要的
作用。MaACT1在幼嫩的茎和叶中高量表达, 且在老
的茎和叶中表达量逐渐减少, 说明该类基因在茎、
叶等营养器官发育过程中具有重要作用。这一类基
因在细胞内部形成大量的微丝, 为细胞内部物质的
运输和细胞延长提供动力, 因此当叶片与茎段发育
完全时, 基因的表达量下降至基底表达水平。在桑
树托叶中只检测到 MaACT1 微弱的表达, 我们推测
可能在托叶发育过程中存在另一个与 MaACT1 具有
相似功能的肌动蛋白基因。MaACT1 与拟南芥的
AtACT2以及豌豆的 PeACT1的表达模式相似, Huang
等[13]发现拟南芥 AtACT4 和 AtACT12 在花粉中高量
表达, 而 AtACT1仅在一些营养性的组织中表达。An
图 15 不同物种肌动蛋白比对分析
Fig. 15 Comparison alignment of actins from different species
648 作 物 学 报 第 37卷
等[16]发现 AtACT1 和 AtACT3 在成熟的花粉中大量
积累, 但在其他组织中几乎检测不到。Li等[8]系统研
究了棉花肌动蛋白基因家族基因的表达模式, 发现
GhACT1 与棉纤维生长直接相关。Zhang 等[14]发现
PtrACT1 在成熟木质部高量表达。在植物肌动蛋白
家族中可能存在一群与生长直接相关的基因, 它们
以其独特的方式为植物生长提供动力[17-19]。
在桑树与其他植物肌动蛋白基因进化分析中发
现, MaACT1与 GhACT1、GhACT5、GhACT6聚为一
类, GhACT1在棉纤维的延伸过程中具有重要的作用,
说明 MaACT1 可能在植物生长过程中扮演了重要的
角色。MaACT2与 PtrACT5、PtrACT4聚为一类, 从
Zhang 等对杨树肌动蛋基因的组织表达分析中发现,
这两个基因在杨树的各种组织中都有表达, 且较稳
定, 说明这一类基因可能在维持细胞骨架方面具有
重要的功能。
植物肌动蛋白通常由 376~377 个氨基酸残基组
成, 具有高度的保守性。Higheower 等[20]研究表明,
植物和动物肌动蛋白之间存在 11%~15%的差异, 水
稻与玉米肌动蛋白之间的氨基酸存在 8%~10%的氨
基酸取代, 大豆异形体之间仅存在 6%~9%的氨基酸
取代, 由此可见, 肌动蛋白基因是相当保守的。内参
基因是在研究其他基因表达模式的时候作为参照的
一个基因, 在植物中常用 16S RNA、组蛋白 H3、
GAPDH基因以及肌动蛋白基因等。目前桑树研究中
还没有一个较好的内参基因, Pan等[11]报道了第一个
桑树肌动蛋白基因及 MaACT1, 并以此作为内参基
因研究桑树乙烯氧化酶ACO基因在低温诱导下的表
达。但在本实验中发现 MaACT1 表达并不稳定, 其原
因是 Pan等[11]在研究中采用的引物扩增得到 MaACT1
和 MaACT2 的混合产物, 所以较为稳定。本研究中
发现的 MaACT2 和 MaACT3 表达都较稳定 , 故
MaACT3是桑树的一个好的内参基因。
在动物中, 肌动蛋白基因主要由细胞质来源与
肌肉来源两大类组成[21]。细胞质来源的肌动蛋白是
构成细胞骨架的重要成分; 肌肉来源的肌动蛋白与
肌球蛋白构成了细胞形态变化、细胞器运动等生理
活动的主要动力。在对拟南芥肌动蛋白的研究中发
现肌动蛋白可以被分为生殖与营养型两大类。从本
实验的结果中发现, 植物中的肌动蛋白也可以分为
两类, 第一类表达较恒定, 是构成植物细胞骨架的
重要成分, 对于维持细胞的形态与细胞器定位有重
要作用, 如 MaACT2 和 MaACT3; 第二类仅在特定
时期表达, 与植物生理活动密切相关, 如 MaACT1。
在植物基因组中, 肌动蛋白出现了大量的基因重复
事件, 其功能极其复杂, 在植物发育过程中起了至
关重要的作用, 因此对肌动蛋白极其复杂的生理功
能研究还有待进一步的深入。
4 结论
从桑树中获得了 3个肌动蛋白基因的基因片段,
定名为 MaACT1、MaACT2和 MaACT3。从桑树基因
组中获得了包含MaACT2全部编码区的基因组序列,
包含 3′端全部 UTR区和 5′端的部分序列, 并由此设
计引物从 cDNA中扩增得到 MaACT2和 MaACT1的
全长 CDS序列。MaACT2和 MaACT3在托叶、茎和
叶中表达比较稳定 , MaACT1 倾向于在幼嫩的茎
和叶中表达, 可能与植物茎、叶等营养器官的发育
相关。
References
[1] Staiger C J, Schliwa M. Actin localization and function in higher
plants. Protoplasm, 1987, 141: 1–12
[2] Kabsch W, Vandekerckhove J. Structure and function of actin.
Annu Rev Biophys Biomol Struct, 1992, 21: 49–76
[3] Kandasamy M K, McKinney E C, Meagher R B. The late pol-
len-specific actins in angiosperms. Plant J, 1999, 18: 681–691
[4] Chen N Z, Qu X L, Wu Y J, Huang S. Regulation of actin dy-
namics in pollen tubes: control of actin polymer level. J Integr
Plant Biol, 2009, 51: 740–750
[5] Thomas C, Meyer D, Wollf M, Himber C, Alioua M, Steinmetz A.
Molecular characterization and spatial expression of the sun-
flower ABP1 gene. Plant Mol Biol, 2003, 52: 1025–1036
[6] Firtel R. Multigene family encoding actin and tubulin. Cell, 1981,
24: 6–7
[7] McDowell J M, Huang S J, McKinney E C, An Y Q, Meagher R
B. Structure and evolution of the actin gene family in Arabidop-
sis thaliana. Genetics, 1996, 142: 587–602
[8] Li X B, Fan X P, Wang X L, Cai L, Yang W C. The cotton
ACTIN1 gene is functionally expressed in fibers and participates
in fiber elongation. Plant Cell, 2005, 17: 859–875
[9] McElroy D, Rothenberg M, Reece K S, Wu R. Characterization
of the rice actin gene family. Plant Mol Biol, 1990, 15: 257–268
[10] Thangavelu M, Belostotsky D, Bevan M W, Flavell R B, Rogers
H J, Lonsdale D M. Partial characterization of the Nicotiana ta-
bacum actin gene family: evidence for pollen specific expression
of one of the gene family members. Mol Gen Genet, 1993, 240:
290–295
[11] Gang P, Cheng F L. Isolation of an 1-aminocyclopropane-1-
carboxylate oxidase gene from mulberry (Marus alba L.) and
analysis of the function of this gene in plant development and
第 4期 李 军等: 三个桑树肌动蛋白基因的克隆与组织表达分析 649
stresses response. J Plant Physiol, 2008, 165: 1204–1213
[12] Aljanabi S M, Martinez I. Universal and rapid salt-extraction of
high quality genomic DNA for PCR-based techniques. Nucl Acids
Res, 1997, 25: 4692–4693
[13] Huang S, An Y Q, McDowell J M, McKinney E C, Meagher R B.
The Arabidopsis thaliana ACT4/ACT12 actin gene subclass is
strongly expressed throughout pollen development. Plant J, 1996,
10: 189–202
[14] Zhang D Q, Du Q Z, Xu B H, Zhang Z Y, Li B. The actin multi-
gene family in populus: organization, expression and phyloge-
netic analysis. Mol Genet Genomics, 2010, 284: 105–119
[15] Kandasamy M K, McKinney E C, Meagher R B. Functional
nonequivalency of actin isovariants in Arabidopsis. Mol Biol Cell,
2002, 13: 251–261
[16] An Y Q, Huang S R, McDowell J M, McKinney E C, Meagher R
B. Conserved expression of the Arabidopsis ACT1 and ACT3
actin subclass in organ primordia and mature pollen. Plant Cell,
1996, l8: 15–30
[17] Meagher R B, McKinney E C, Kandasamy M K. Isovariant dy-
namics expand and buffer the responses of complex systems: the
diverse plant actin gene family. Plant Cell, 1999, 11: 995–1005
[18] Staiger C J, Blanchoin L. Actin dynamics: old friends with new
stories. Curr Opin Plant Biol, 2006, 9: 554–562
[19] Fu Y. The actin cytoskeleton and signaling network during pollen
tube tip growth. J Integr Plant Biol, 2010, 52: 131–137
[20] Hightower R C, Meagher R B. The molecular evolution of actin
1986. Genetics, 1986, 114: 315–332
[21] Pollard T D, Cooper J A. Actin and actin-binding proteins: a
critical evaluation of mechanisms and functions. Annu Rev Bio-
chem, 1986, 55: 987–1035