全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(7): 1061−1066 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2009AA101106, 2006AA100104), 国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2010CB125906,
2009CB118404, 2006CB101708), 国家自然科学基金项目(30671314)和高等学校创新引智计划(B08025)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 赵团结, 盖钧镒, E-mail: sri@njau.edu.cn; Tel: 025-84395405
Received(收稿日期): 2010-01-18; Accepted(接受日期): 2010-04-20.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.01061
大豆质核互作雄性不育系 NJCMS3A双亲雄性育性基因的 SSR标记
李曙光 赵团结* 盖钧镒*
南京农业大学大豆研究所 / 国家大豆改良中心 / 作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095
摘 要: 利用大豆质核互作雄性不育系 NJMCS3A的质、核供体亲本 N21566和 N21249构建 F2和 BC1F1育性分离群
体进行雄性育性的遗传分析与基因定位。结果表明, F1正反交可育, F2和 BC1F1的可育株与不育株分离比例经 χ2测验
分别符合 3∶1 和 1∶1, 表明 NJCMS3A 供体亲本雄性育性由一对基因控制, 可育等位基因为显性。该基因可能是
NJCMS3A 的一个恢复基因。选用 793 对 SSR 引物对 F2和 BC1F1群体分别进行育性基因定位, 发现该育性基因位于
O连锁群上, 在 Satt331和 Satt477标记之间, 与 Satt331、CSSR133和 Satt477标记距离的次序一致, 分别为 8.1~10.4、
11.4~16.4和 13.3~19.2 cM。
关键词: 大豆; 质核互作雄性不育; 雄性育性遗传; 基因定位
Mapping Male Fertility Gene with SSR Markers in Parents of Cytoplasmic-
Nuclear Male-Sterile Line NJCMS3A in Soybean
LI Shu-Guang, ZHAO Tuan-Jie*, and GAI Jun-Yi*
Soybean Research Institute of Nanjing Agricultural University / National Center for Soybean Improvement / National Key Laboratory for Crop Ge-
netics and Germplasm Enhancement, Nanjing 210095, China
Abstract: Utilization of the three lines [cytoplasmic-nuclear male-sterile (CMS) line, maintainer line, and restorer line] in pro-
ducing hybrids with heterosis has been very successful in a number of crops including soybean. The soybean CMS line NJCMS3A
was developed through six consecutive backcross generations with N21566 as cytoplasm source and N21249 as nuclear donor.
The objective of our study was to reveal the genetic mechanism and mapping the male fertility gene in the two parents of the CMS
line NJCMS3A, i.e. N21566 and N21249. The male fertility of (N21566×N21249) F2 and BC1F1 showed that the segregation ratio
of fertile to sterile plants fitted the expected ratios of 3:1 and 1:1, respectively, indicating one pair of gene conferring male fertility
in the parents of NJCMS3A with dominance allele in N21249 being male fertile. This gene might be one of the restorer genes for
the male sterility of NJCMS3A. The mapping results on BC1F1 and F2 showed that out of the 793 randomly selected SSR markers,
Satt331, CSSR133 and Satt477 on linkage group O were linked to the male fertility gene Rf with their genetic distances of
8.1−10.4, 11.4−16.4, and 13.3−19.2 cM, respectively, in a same order and its location between Satt331 and Satt477.
Keywords: Soybean; Cytoplasmic-nuclear male sterility; Fertility inheritance; Gene mapping
植物质核互作雄性不育(cytoplasmic-nuclear male
sterility), 简称细胞质雄性不育(CMS), 是由线粒体
基因组的变异或特异的线粒体基因表达导致的, 而
细胞核恢复基因(Rf)抑制线粒体基因组特定 CMS基
因的表达, 恢复雄性育性功能[1-3]。细胞质雄性不育
系、保持系以及恢复系“三系”配套是作物杂种优势
生产利用的主要途径, 已在玉米、油菜、水稻、高
粱等农作物中广泛用于生产杂交种子, 提高了作物
单产。大豆质核互作雄性不育的发现首先见于 Davis
申请的美国专利 [4], 该专利已到期 , 未见该发现进
一步应用的报道。我国吉林省农业科学院[5-6]、南京
农业大学[7-10]、安徽省农业科学院[11-13]和阜阳市农业
科学研究所[14]已经育成数十个质核互作雄性不育系,
并实现了“三系”配套。利用质核互作雄性不育系统,
已经育成并审定了大豆杂种品种[15-17]。
优良恢复系是利用 CMS 系统配制杂交种的基
1062 作 物 学 报 第 36卷

础 , 但育性恢复性是数量性状 , 易受环境影响 , 并
且需通过测交才能确定。定位恢复基因, 利用分子
标记对恢复基因进行标记辅助选择, 可提高育种效
率。许占友等[18]对2个不育系(阜CMS1A和阜CMS2A)
和 5 个恢复系的核基因池进行多态性筛选, 发现 3
个特异 SSR 引物 Satt143、Satt168和 Satt441。赵丽
梅等[19]利用(YA/167) F2群体及(YA//YB/167)群体进
行引物筛选, 获得 2对与恢复基因有关的位于 J连锁
群上引物 Satt414/16.4 cM和 Satt596/14.6 cM; 利用
(JLCMS82A×吉恢 1号) F2分离群体, 发现 J连锁群
上的 SSR标记 Sctt011、Satt547与恢复基因连锁, 遗
传距离分别为 3.6 cM、5.4 cM[20]。Yang等[21]将
NJCMS1A 的 2 个恢复基因定位在 M 和 A1 连锁群,
SSR标记 Satt626、Satt300与恢复基因的距离分别为
9.75 cM和 11.18 cM。董建生等[22]发现位于 D2连锁
群上的 Satt135与 NJCMS2A恢复基因相连锁, 遗传
距离为 11.47 cM。汤复跃等[23]根据可育、不育、半
不育基因池多态性的表现, 将大豆 M-CMS 恢复系
WR016的恢复基因定位在 A连锁群上。不同研究所
得结果不同, 可能与研究材料、方法不同有关, 也反
映了大豆现有 CMS系统的遗传基础比较复杂。
大豆质核互作雄性不育系 NJCMS3A 为南京农
业大学利用新不育细胞质亲本 N21566 (湖北地方品
种)与安徽品种 N21249 杂交和连续回交获得, 遗传
研究表明其具配子体不育特性, 但其亲本 N21566、
N21249与孢子体不育的 NJCMS1A的亲本 N8855、
N2899 杂交表现复杂的遗传关系, 推测 NJCMS3A
可能受多对基因控制[10]。本文利用大豆质核互作雄
性不育系 NJCMS3A 细胞质、核供体亲本构建分离
群体, 对育性基因进行遗传和定位分析, 以期获得
与雄性育性基因紧密连锁的分子标记, 为大豆细胞
质雄性不育三系的选育与利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试材料
大豆质核互作雄性不育系 NJCMS3A 的细胞
质、核供体亲本 N21566 和 N21249, 杂交组合
(N21566×N21249) F1 、 F2, 反 交 组 合 (N21249×
N21566) F1、[N21566/N21249//N21249] BC1F1群体。
供试材料均由国家大豆改良中心提供, 田间试验在
国家大豆改良中心江浦试验站进行。
1.2 大豆雄性育性的鉴定方法
在盛花期, 目测判别其花药的外观形态(散粉或
不散粉), 并利用醋酸洋红染色等方法显微镜检查花
粉育性(染色或不染色), 鉴定植株育性。成熟期可育植
株能够正常成熟, 无不实肉荚, 荚成熟时整株均呈黄
色, 叶片完全脱落, 具有大量结实荚; 不育株在成熟
期整株仍呈浓绿色, 叶片肥厚不脱落, 茎秆粗壮, 结
有大量未受精的, 长约 0.3~l.2 cm的幼嫩不实荚(小肉
荚)。综合盛花期和成熟期鉴定结果将植株分为不育和
可育两类, 分离结果采用 χ2适合性测验。
1.3 DNA的提取
在大豆 V3 期, 从 N21566、N21249, 二者杂交
F1、F2及 BC1F1 (N21566/N21249//N21249)群体植株
上分单株摘取叶片 , 在−70℃超低温冰箱中保存备
用。采用 CTAB法[24] (略加改进)提取叶片 DNA, 并
检测其浓度和质量。
1.4 基因池的构建
利 用 混 合 分 组 分 析 法 [25](bulked segregate
analysis, BSA), 在 BC1F1群体中, 随机选取 10株不
育株, 取等量DNA混合构成不育基因池, 简称 S池;
随机选取 10 株可育株, 取等量 DNA 混合构成可育
基因池, 简称 F池。
1.5 SSR标记分析
从 Song 等[26]整合的大豆公共遗传图谱, 随机
选取 787对 SSR引物, 引物序列来自 SoyBase (http://
129.186.26.94/ssr.html); 从 Xia 等[27]构建的大豆遗
传图谱(O 连锁群)选取 6 对 SSR 引物; 所有引物由
上海英骏(Invitrogen)生物技术有限公司合成。PCR
体系(10 μL)含 3.0 μL模板 DNA (10 ng μL−1)、3 μL
Primer (2 pmol μL−1)、1.5 μL 10×buffer (free MgCl2)、
0.24 μL dNTP Mix (2.5 mmol L−1)、0.8 μL MgCl2 (25
mmol L−1)、0.14 μL Taq polymerase (5 U μL−1)、1.4
μL ddH2O。PCR程序为 95℃预变性 5 min; 95℃变性
40 s, 46~55℃退火 50 s, 72℃延伸 50 s, 共进行 30次
循环; 72℃延伸 8 min, 4℃保存。每对 SSR引物具有
特定的退火温度, PCR 扩增程序根据引物实际 Tm
(退火温度)值设定, 其他程序不变。PCR在 EDC-810
型基因扩增仪中进行, 将扩增产物置 4℃冰箱中备
用。扩增产物加入指示剂后, 经 8%非变性聚丙烯酰
胺凝胶电泳、银染, 利用美国 Bio-Rad公司 VersaDoc
4000型高分辨率凝胶成像系统进行凝胶图像扫描 ,
记录实验结果。
1.6 数据处理与分析
根据 PCR扩增产物电泳后显示的谱带, 按以下
方法赋值, 与亲本 N21566 带型一致者记录为“A”,
第 7期 李曙光等: 大豆质核互作雄性不育系 NJCMS3A双亲雄性育性基因的 SSR标记 1063


与亲本 N21249 带型一致者记录为“B”, 数据缺失记
录为“−”, 杂合型记录为“H”, 将结果输入计算机。
采用 JoinMap 3.0 作图软件分析标记之间及其
与育性基因间的连锁 , 构建分子遗传图谱 , 采用
Kosambi函数计算遗传图距。
2 结果与分析
2.1 NJCMS3A供体亲本杂交后代雄性育性的遗传
2007 年 N21249 和 N21566 的正反交组合 F1在
成熟期表现正常可育。2008 年 F2、BC1F1群体育性
发生分离, 在盛花期采用醋酸洋红染色法进行花粉
育性鉴定, 单株花粉可育性从 0到 100%, 但表现明
显的双峰分布。结合收获期植株育性表现, 确定以
花粉可育率 10%为界, ≤10%为不育株, >10%为可育
株(表 1)。在收获期, 根据生长势、结荚情况、肉荚
有无、叶片衰老程度等综合判定植株育性, 收获期
植株育性与盛花期花粉育性保持一致。
从表 2 可见, F2 雄性可育与不可育株的比例为
82∶24, 符合 3∶1 的表型分离比例(χ2 = 0.20, P =
0.65), 并且收获期植株育性与盛花期花粉育性保持一
致, 育性分离表现孢子体遗传特点。BC1F1雄性可育与
不可育株的比例为 25∶27, 符合 1∶1的分离比例(χ2 =
0.02, P = 0.89), BC1F1的基因型分离结果支持 F2表型
分离的结果, 该组合雄性育性分离受一对基因控制。
鉴于 NJCMS3A 的细胞质、核亲本 N21566 和
N21249 之间有 1 对育性基因差异 , 可以推测
NJCMS3A的细胞质亲本 N21566的基因型为 S(RfRf),
细胞核亲本 N21249的基因型为 N(rfrf), S代表具有
不育基因的细胞质, N代表细胞质具有正常可育基因。
(N21566×N21249) F1 的基因型为 S(Rfrf), [N21566/
N21249//N21249] BC1F1群体基因型为 1/2 S(Rfrf)与
1/2 S(rfrf)。基因型为 S(Rfrf)的植株表现可育, 而基
因型 S(rfrf)表现不育, 因此 BC1F1 群体中可育与不
育株的比例为 1∶1。F2基因型分离为 1/4 S(RfRf)、
2/4 S(Rfrf)和 1/4 S(rfrf)。基因型为 S(RfRf)与 S(RfRf)
的植株均表现可育, 而基因型 S(rfrf)表现不育, F2群
体中可育与不育株的比例为 3∶1。因而 NJCMS3A
雄性育性的基因型应为 S(rfrf)。

表 1 F2与 BC1F1群体花粉育性的次数分布
Table 1 Frequency distribution of pollen fertility in F2 and BC1F1 (%)
世代 Generation 0–10 11–20 21–30 31–40 41–50 51–60 61–70 71–80 81–90 91–100 合计 Sum
F2 24 0 0 3 4 16 9 10 32 32 106
BC1F1 27 2 4 2 1 4 2 0 7 7 52

表 2 F2与 BC1F1植株育性适合性测验
Table 2 Chi-square tests of fertility performance of F2 and BC1F1 populations
世代
Generation
可育
Fertile plant
不育
Sterile plant
总数
Total
理论比例
Expected ratio
χ2c P
F2 82 24 106 3:1 0.20 0.65
BC1F1 25 27 52 1:1 0.02 0.89

2.2 NJCMS3A供体亲本雄性育性基因的定位
用分布于 20 条连锁群的 793 对 SSR 引物对亲
本 N21566和 N21249进行检测, 其中 413对在亲本
间表现多态性, 多态性频率为 52.08%。进一步利用
这 413对引物对[N21566/N21249//N21249] BC1F1群
体构建的可育基因池和不育基因池进行分析, 结果
显示, 18对 SSR引物在基因池之间表现多态性。利
用这 18对 SSR引物对 2个亲本(N21566和N21249)、
可育池(F池)与不育池(S池)进行扩增 , 结果表明位
于 O连锁群上的 Satt153、Satt243、Satt331、Satt477
与 CSSR133等 5对引物表现出多态性。
利用上述 5 对 SSR 引物, 对 BC1F1 群体进行
SSR-PCR 扩增, 对扩增结果进行卡方检验, 这 5 对
引物计算 χ2值均小于 20.05,1χ =3.84, 说明在 5%水平上
这些标记的分离符合 1∶1 的期望分离比例(表 3)。
结合该群体各单株的育性表型数据, 采用 JoinMap
3.0作图软件, 对 5个标记位点及 1个育性基因位点
(暂定为 Rf)进行作图分析, 结果表明该育性基因位
点与 Satt331、CSSR133和 Satt477遗传距离较近, 分
别为 10.4、16.4和 19.2 cM (图 1-A)。
进一步在 O 连锁群上选取 Satt331、Satt153、
Satt243、CSSR133、Satt477 和 Satt123 等 6 对 SSR
引物, 在 F2分离群体上进行 SSR-PCR扩增, 结果表
明这 6对引物均符合 1∶2∶1的分离比例(表 4)。采
用 JoinMap 3.0作图软件, 对这 6个标记位点及 1个
育性基因位点进行作图分析, 同样发现该育性基因
1064 作 物 学 报 第 36卷

表 3 具有多态性的 SSR标记在 BC1F1群体中的分离情况
Table 3 Segregation of five polymorphic SSR markers in BC1F1 population
引物
Primer
杂合型
Heterozygous type
父本型
Paternal type
总数
Total
χ2C(1:1) P
Satt331 27 25 52 0.02 0.8897
Satt153 26 26 52 0.02 0.8897
Satt243 27 25 52 0.02 0.8897
CSSR133 25 27 52 0.02 0.8897
Satt477 26 26 52 0.02 0.8897

表 4 具有多态性的 SSR标记在 F2群体中的分离情况
Table 4 Segregation of six polymorphic SSR markers in F2 population
引物
Primer
母本型
Maternal type
杂合型
Heterozygous type
父本型
Paternal type
总数
Total
χ2 (1:2:1) P
Satt331 22 57 27 106 1.08 0.5841
Satt153 23 56 27 106 0.64 0.7256
Satt243 24 54 28 106 0.34 0.8438
CSSR133 22 57 27 106 1.08 0.5841
Satt477 26 54 26 106 0.04 0.9813
Satt123 30 46 30 106 1.84 0.3967

位点与 Satt331、CSSR133和 Satt477连锁距离较近,
分别为 8.1、11.4和 13.3 cM (图 1-B)。

图 1 NJCMS3A雄性育性基因 Rf的遗传连锁图谱
Fig. 1 Linkage map between male fertility gene Rf and SSR
markers in NJCMS3A
A: 利用 BC1F1群体构建的连锁图谱; B: 利用 F2群体构建的连锁
图谱。
A: location of Rf on linkage map from BC1F1 population; B: loca-
tion of Rf on likage map from F2 population.

综合以上实验, 从同一组合的 BC1F1和 F2两个
群体分别进行雄性育性基因定位获得一致结果, 该
基因位于 O连锁群 Satt331和 Satt477之间(图 1), 离
Satt331、CSSR133 和 Satt477 标记距离的次序一致,
依次为 8.1~10.4、11.4~16.4和 13.3~19.2 cM。
3 讨论
育性鉴定、划分标准是细胞质雄性不育及其恢
复性遗传研究的前提条件, 准确鉴定分离群体的单
株育性, 对于试验研究结果至关重要。在大豆雄性
不育研究中, 常用 3种方法确定雄性育性。一是肉
眼观察花药散粉情况。可育植株的花药开裂、大量
散花粉, 且形态为鲜黄色、饱满; 而不育植株花药瘦
小、发白、花药不开裂, 或花药虽开裂但不散粉, 该
法简便但较粗放。二是显微镜检测花粉败育率。包
括以 1%醋酸洋红染色、I2-KI 染色以及花粉萌发试
验鉴定花粉育性, 由于大豆花期较长、开放花朵在
植株上分布相对分散, 单朵花受环境影响较大, 需
检测较多花朵才能反映实际育性 , 因而较费时费
力。三是成熟期整株的形态特征。典型不育植株成
熟时延迟落叶 , 叶片浓绿肥厚 , 茎秆粗壮 , 着生大
量未受精的不实肉荚, 一般情况下容易识别。但在
一定条件下, 由于存在天然昆虫传粉, 某些不育株
也大量结荚, 甚至不能区分可育和不育株。本研究
为降低非遗传因素对植株育性的影响, 在大豆育性
鉴定工作中, 综合运用了 3种方法 , 并以成熟期植
株育性判断结果为准。大豆为严格的自花受粉作物,
天然异交率低。在南京夏大豆开花期天气多雨潮湿,
对不育系结实影响大, 一般不育株结荚不足可育株
的 5%[28], 因此本文所采用的育性鉴定方法是可
行的。
第 7期 李曙光等: 大豆质核互作雄性不育系 NJCMS3A双亲雄性育性基因的 SSR标记 1065


相对于质核互作雄性不育系, 其恢复系的细胞
核中含有恢复基因, 利用[不育系//保持系/恢复系]
三交 F1分离群体可进行质核互作雄性不育系的恢复
基因定位。由于 NJCMS3A 的细胞质亲本 N21566
具有不育细胞质, 细胞核中育性基因(恢复基因)正
常; 而其细胞核亲本即保持系 N21249 细胞质基因
正常, 细胞核中含有不育基因, 不育细胞质与不育
细胞核两者结合 , 选育出质核互作雄性不育系
NJCMS3A。相比于不育系, 用原始核质供体材料做
亲本可追踪该不育系育性基因的传递, 更好地了解
育性遗传基础。本研究利用 NJCMS3A 的雄性育性
完全正常的质核供体亲本 N21566、N21249 构建 F2
和 BC1F1群体, 发现 N21566和 N21249之间存在一
对控制雄性育性的核基因, 其中可育等位基因显性,
而与之对应的不育等位基因隐性, 这与 Zhao 等[10]
研究结果一致。但本研究(N21566×N21249) F2出现
较多的不育株, 育性分离表现为孢子体不育, 而由
该组合衍生的 NJCMS3A 却表现配子体不育。已报
道的一些大豆细胞质雄性不育系 , 其选育的早代
(F1和 BC1F1)也表现与稳定不育系不同的遗传分
离[11-14]。研究表明 NJCMS3A 雄性不育性可能受多
对表现复杂互作关系的基因控制[10], 本研究所定位
的供体亲本核育性基因应该是 NJCMS3A 三系遗传
体系的一个重要位点, 它与其他基因位点的关系有
待进一步研究。
大豆质核互作雄性不育恢复基因的标记定位有
待深入。许占友等[18]、赵丽梅等[19]、Wang 等[20]、
Yang等[21]、董建生等[22]和汤复跃等[23]利用不同的材
料组合, 把恢复基因分别标记定位于(L、B2与 K)、
J、(M 与 A1)、D、A1 连锁群(参照 Song 等[26]构建
的连锁群)。其中, 许占友等[18]与汤复跃等[23]所利用
不育系的不育细胞质供体亲本相同, 均为 ZD8319,
但是恢复基因分别定位在不同连锁群上, 推测这是
因为核遗传背景不同, 造成育性恢复修饰基因差异;
同时由于雄性育性受环境条件影响以及育性划分标
准不同, 最终导致育性恢复基因标记定位结果不一
致。本研究利用(N21566×N21249) BC1F1群体发现位
于 O连锁群上的 Satt331、CSSR133和 Satt477与雄
性不育基因相连锁, 并利用该组合 F2 群体进行验
证。虽然与 NJMCMS3A 育性基因连锁的 3 个 SSR
标记与育性基因的遗传距离较大, 但目前大豆公共
遗传图谱 SSR标记数量已经达到 1 015个[26], 利用
Williams 82全基因组信息也可开发大量新标记, 这
些初定位结果将为进一步寻找与恢复基因更紧密连
锁的分子标记奠定基础。
4 结论
大豆质核互作雄性不育系 NJMCS3A 细胞质与
核供体亲本 N21566、N21249 之间有 1 对育性基因
存在差异, 可育等位基因为显性。该基因在 O 连锁
群上, 位于 Satt331 和 Satt477 之间, 距离 Satt331、
CSSR133和 Satt477标记分别为 8.1~10.4、11.4~16.4
和 13.3~19.2 cM。
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