全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(6): 1156−1160 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2002CB111302)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 何光源, E-mail: hegy@hust.edu.cn; Tel: 027-87792271
第一作者联系方式: E-mail: chenglibao453@163.com; Tel: 027-87792271
Received(收稿日期): 2008-11-05; Accepted(接受日期): 2009-01-28.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01156
表达大豆 GMCHI基因能够提高原核生物耐低温性
程立宝 1,2 李淑艳 3 景新明 2 何光源 1,*
1华中科技大学中英 HUST-RRes基因工程和基因组学联合实验室 / 教育部分子生物物理重点实验室 / 生命科学与技术学院, 湖北武
汉 430074; 2中国科学院植物研究所, 北京 100093; 3孝感学院生命科学与技术学院, 湖北孝感 432000
摘 要: 低温是种子萌发过程中常见的自然灾害, 在我国北方经常发生, 这导致种子萌发率较差、降低植株活力等后
果。利用 cDNA-AFLP技术从低温(4℃)吸胀 24 h的抗低温吸胀大豆品种中黄 22 (低温吸胀 24 h对萌发率无影响的品
种)中分离出一个基因片段, 命名为 GMCHI (GenBank 登录号为 EU699765), 通过 RACE 方法得到全长为 387 bp 的
cDNA序列。在 NCBI数据库中的查询表明, GMCHI基因和数据库记录的基因序列同源性较低, 因此可以断定 GMCHI
是在大豆中被发现的新基因。半定量 RT-PCR显示 GMCHI受 ABA和 PEG诱导。该基因与 PET30A连接后转入原核
细胞, 经过 IPTG诱导, 6% SDS-PAGE电泳条带说明, GMCHI在大肠杆菌中能够表达。把诱导表达和非诱导表达的菌
落在−20℃下 2 h后, 移至 37℃培养 20 d, 发现对照的菌落完全死亡, 而诱导表达 GMCHI的菌落只有部分死亡, 并长
出新菌落。RT-PCR检测表明新菌落携带 GMCHI基因, 证明 GMCHI基因的表达提高了大肠杆菌的低温耐性。
关键词: 大豆; GMCHI; 菌落; cDNA-AFLP; 基因; 低温
Expression of GMCHI Gene, Isolated from Soybean, Enhances the Survival in
Prokaryotes to Low Temperature Stress
CHENG Li-Bao1,2, LI Shu-Yan3, JING Xin-Ming2, and HE Guang-Yuan1,*
1 China-UK HUST-RRes Genetics Engineering and Genomics Joint Laboratory / Huazhong University of Science Technology, Wuhan 430074,
China; 2 Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China; 3 Life Science and Technique College of Xiaogan Univer-
sity, Xiaogan 432000, China
Abstract: Low temperature during germination being a natural disaster usually occurs in North of China, which results in low
germination rate and low seedling vigor, and even ultimately severe loss in yield. A gene was isolated from soybean Zhonghuang
22 cultivar (tolerant to low temperature in imbibition) for 24 h under 4℃ via cDNA-AFLP, name as GMCHI, GenBank accession
No. EU699765. The full-length sequence of GMCHI which was 387 bp in nucleotide was obtained by RACE method. The se-
quence of gene shared low similarity with that of genes documented in NCBI. Therefore we inferred that GMCHI was a new gene
discovered in soybean. Semi quantitative RT-PCR result revealed that GMCHI was induced by ABA and IPEG.. The gene ligated
with Prokaryotic expression vector was transformed into prokaryotic cell, the result of 6% SDS-PAGE induced by IPTG was ex-
pressed in Prokaryotes. The E. coli carrying GMCHI survived and showed tolerance to low temperature under the treatment of
−20℃ for 2 h. RT-PCR validated that GMCHI in Prokaryotes improved the adaptation to low temperature.
Keywords: Soybean; GMCHI; E. coli; cDNA-AFLP; Gene; Low temperature
冷害是一种经常发生在 0~15℃条件下的自然现象。
冷害的发生会导致种子萌发推迟 , 甚至不萌发 , 同时也
会造成植株萎蔫、生长受限、减产及绝产等, 尤其是起源
于热带和亚热带的作物, 更易发生冷害[1]。但是, 大多数
植物能够在有限的范围内抵抗外界低温环境的影响, 这
种现象被称作冷适应[2]。一些与冷诱导相关的基因在植物
冷适应中起非常重要的作用 , 研究发现植物中过表达
COR 基因后能够显著提高后代植株对低温、干旱和盐胁
迫的适应能力[3]。目前, 有关 DREB家族基因的研究已非
常清楚 , 作为调控因子家族中的各个成员 , 它们能够通
第 6期 程立宝等: 表达大豆 GMCHI基因能够提高原核生物对耐低温性 1157


过调控下游冷诱导基因的表达来提高植物对胁迫环境的
抵抗能力[4]。近年来, 人们发现大豆中的 SCOF-1 基因的
表达能够明显提高拟南芥对冷胁迫的适应, 转基因烟草
也有同样的结果[5]。低温诱导基因分为 2 种类型, 第 I 类
主要是脱水基因, 其表达能防止细胞过度脱水而使植株
免于死亡, 例如细胞晚期丰富蛋白(LEA)、参与渗透调节
物合成的酶类、分子伴侣及一些抗冻蛋白; 第 II类主要包
括转录因子、蛋白激酶以及参与转录后代谢调节的酶类。
在上述基因中, 部分受ABA诱导, 属于ABA途径依赖型,
而另一部分不受 ABA诱导, 属于不依赖 ABA途径型[6]。
大豆在全世界范围内广泛种植, 环境条件在很大程
度上限制了大豆的生长及分布, 尤其是纬度和海拔较高
的地区, 低温胁迫非常明显[7]。吸水是大豆种子萌发的必
要条件 , 但低温条件下的吸水会造成细胞膜的重组 , 导
致细胞液大量外渗 , 最终种子不能萌发 , 这种现象往往
发生在吸胀的开始阶段[8]。利用渗透调控物质处理种子能
在某种程度上减慢种子的吸水速度, 大大减轻水对细胞
膜的冲击。目前在农业上应用非常普遍的渗透调节物质是
PEG, 研究表明在种子吸水阶段, 受 PEG诱导的基因都和
种子低温抗性的提高有关[9]。
综上所述, 基因表达是植物对外界环境适应的前提
和基础, 也是利用基因工程方法提高作物抗性的有效手
段。本试验利用 cDNA-AFLP技术从低温吸胀的大豆中分
离到一个新基因。通过原核表达实验进行基因功能的初步
验证, 为研究基因在真核生物中的作用提供必要的基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
大豆中黄 22为耐低温吸胀 , 其种子含水量为 8.9%,
2006年购自中国农业科学院, 存于−20℃冰箱中。
1.2 cDNA-AFLP技术
cDNA-AFLP 的技术流程完全参照 Umezawa 等[10]和
Liang等[11]方法。选取在低温(4℃)和常温(22℃)下吸胀 24
h后的大豆种子, 利用试剂盒提取胚轴总 RNA (Qiagen)。
然后再利用 M-MLV RTase cDNA 合成试剂盒(TaKaRa,
Japan)合成双链 cDNA。使用 EcoR І和 Mse І 两种内切酶
组合同时对 100 ng双链 cDNA 进行酶切, 时间为 24 h。
用连接酶将 20 pmol接头与酶切后的 cDNA片段的 2端连
接。再根据接头序列设计的引物预扩增和扩增。6%的聚
丙烯酰胺凝胶电泳分离 PCR产物, 硝酸银染色, 显色。挑
取差异条带置于 0.5 mL离心管中, 加入 40 μL无菌水置
入 100℃沸水中 5 min, 取上清液作为模板再进行 PCR,
最后进行基因的克隆和测序。用 RT-PCR验证基因片段。
引物上游序列为 5′-GCGATTTATGCAAATCGT-3′; 下游序
列为 5′-CACAACAGGTTTAACCATAG-3′。PCR程序为 94 ℃
10 min; 94℃ 1 min, 50 1 min℃ , 72℃ 1 min; 共 30个循环;
72 10 min℃ 。利用生物信息软件分析验证后的基因片段,
以 5′和 3′RACE技术获得全长基因。
1.3 GMCHI基因在大豆胚轴中的表达分析
用 100 μmol L−1 ABA和 30% PEG (MV: 10 000)处理
吸胀中的大豆种子, 吸胀温度为 22℃, 处理 24 h。然后分
别在吸胀 0、6、12、18和 24 h研究基因在大豆胚轴中的
表达特性。RNA提取和 cDNA合成与上述相应方法相同。
基因的上游引物为 5′-GGTCTAGAATGAGAGGTGTTATT
GTCTTATT-3′; 下游为 3′-GATACCAAAAGGACAACACT
GCCATGGGG-5′。Tubulin 作为内参, 内参上游引物为
5′-AACCTCCTCCTCATCGTACT-3′; 下游为 5′-GACAG
CATCAGCCATGTTCA-3′。PCR程序为 94 5 min;℃ 94℃ 1
min; 52 1 min℃ ; 72 1 min℃ ; 共 35个循环; 72 10 min℃ 。
1.4 GMCHI基因在原核生物中的表达分析
1.4.1 基因转化及蛋白提取 按照基因两端序列设计
全长引物, 选用 Hind III和 BamH I两种内切酶作为酶切
位点。全长 GMCHI 基因连接到原核生物表达载体
-PET30A后转化 BL21感受态细胞, 加入 10 mL LB液体
培养基在 37℃下进行过夜培养。按照 1∶50 的比例把带
有重组子的菌液加入新鲜的 LB液体培养基中继续培养。
当菌液的 OD 值为 0.4~0.6 时, 把培养的菌液平均分成 2
份, 其中一份加入终浓度为 10 mg mL−1的 IPTG后继续培
养。取 OD大约为 1的 IPTG诱导的菌液和非诱导的菌液
各 2 mL, 用溶菌酶溶解, 得到蛋白。
1.4.2 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 采用 Bio-rad
mini protein III系统。蛋白样品中加入等体积的上样缓冲
液(20%浓缩胶缓冲液 4% SDS 10% β-巯基乙醇 20%甘油
和 0.1%溴酚蓝), 煮沸 3~5 min, 冰浴 15 min后 16 000×g、
4℃离心 15 min, 每泳道上蛋白样 5~10 μg。分子量标准为
低分子量蛋白(国产)。浓缩胶 5%, 80 V; 分离胶 15%, 200
V。电泳结束后, 用 MiniQ H2O漂洗凝胶, 12% TCA固定
1 h, 0.4%考马斯亮蓝 R-250染色 2 h, 10%冰醋酸和 30%乙
醇脱色液脱色。以 Umax扫描仪扫描并分析图片。
1.5 GMCHI基因功能的初步验证
取 OD为 1并且经过 IPTG诱导和非诱导的菌液 1 mL,
短暂离心后, 把离心管底部的菌体涂在带有 Kan的 LB固
体培养基平板上, 37℃下过夜培养。当长出菌落后, 把平
板放在 4℃下进行低温驯化 10 d, 再放于−20℃下 2 h。接
着转移到 37℃下培养 20 d, 并且对菌落的存活进行调查。
2 结果与分析
2.1 基因的分离与鉴定
本实验利用 cDNA-AFLP 技术从抗低温吸胀的大豆
种子中分离出一个受低温诱导的基因片段, 其长度大约
为 303 bp (图 1), 被命名为 GMCHI。利用 RT-PCR方法对
GMCH 的表达做进一步验证, 结果表明, 大豆胚轴在 4℃
下吸胀 24 h后, GMCHI的表达量约为 22℃下吸胀 24 h表
达量的 5倍(图 2和图 3), 因此我们可以确定 GMCHI是低
温诱导型基因。
1158 作 物 学 报 第 35卷


图 1 GMCHI基因的分离
Fig. 1 Isolation and identification
of GMCHI gene

图 2 利用 RT-PCR对 GMCHI进一步验证
Fig. 2 Further analysis of GMCHI expression by RT-PCR
C: 22℃下吸胀; T: 4℃下下吸胀。
C: the seeds imbibed at 22℃; T: the seeds imbibed at 4℃.

图 3 GMCHI表达量的分析
Fig. 3 Quantitative analysis of GMCHI expression

2.2 GMCHI蛋白序列的同源比对
利用 cDNA-AFLP技术分离出基因片段后, 通过RACE
方法得到全长的 GMCHI基因。GMCHI基因全长为 387 bp,
能够编码 129 个氨基酸残基。经 NCBI 数据库查询后发现,
GMCHI 与之前所报道的蛋白序列同源性 32.0%~37.7%, 同
源性低(图 4)。另外, 在 GMCHI序列中未发现保守的功能区
域, 所以关于基因的功能有待进一步验证。
2.3 基因表达分析
2.3.1 GMCHI基因在大豆胚轴中不同时间的表达分析
利用 100 μmol L−1 ABA和 30% PEG处理大豆种子。
结果表明, GMCHI 基因对 ABA 非常敏感, 处理 1 h 后,
表达量最大 , 但是随着时间延长 , 该表达量在转录水平
上呈下降的趋势。另外 , 利用 30% PEG 处理种子时 ,
GMCHI表达量在 18 h后开始有明显的增强(图 5)。总之, 从

图 4 数据库 NCBI中和 GMCHI具有同源性蛋白序列的比对
Fig. 4 Alignment between GMCHI and protein sequences reported in NCBI
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图 5 ABA和 PEG处理后 GMCHI的表达
Fig. 5 Expression of GMCHI after ABA and PEG treatment

GMCHI 的表达模型可以看出, 它很可能和外界环境的胁
迫相关。
2.3.2 GMCHI 基因在 BL21 感受态细胞中表达 为了
检测 GMCHI基因是否具有一个通读的开放阅读框(ORF),
利用原核表达的方法对 GMCHI基因进行初步研究。结果
表明, 在 6%的 SDS-PAGE上出现一条明显的基因表达条
带(图 6箭头所示), 说明 GMCHI能够在 BL21中表达出产
物。暗示该基因含有一个可读的阅读框, 为进一步的基因
功能分析奠定基础。

图 6 GMCHI在 6%的 SDS-PAGE中的表达分析
Fig. 6 Expression analysis of GMCHI in 6% polyacrylamide gel
M: marker; 1: 诱导基因表达的菌液; 2: 转入空载体的菌液; 3~4: 非
诱导表达的菌液。
M: marker; 1: E. coli with induced gene expression; 2: E. coli with
blank vector; 3–4: E. coli without induced gene expression.

2.4 基因功能的初步验证
为了进一步确定GMCHI基因的功能, 在原核生物中
进行了基因功能的初步验证。如图 7所示, 正常条件下,
诱导基因表达和非诱导基因表达的菌液在 LB固体培养基
平板上的生长没有任何差别。但在–20℃条件下冷冻处理
2 h, 然后转移到 37℃下恢复正常的生长。15 d以后, 我
们发现非诱导基因表达平板上的菌落全部死亡, 而在诱
导基因表达的平板上 , 虽然也有部分菌落死亡 , 但是很
多菌落又重新恢复生长, 表明 GMCHI基因的表达能够提
高菌落抵抗低温的能力。为了确定恢复生长的菌落为带有
目的基因的阳性菌落而不是被污染的杂菌, 从恢复生长
的菌落中随机挑选 4 个克隆进行 PCR 验证。结果发现这
4个克隆都携带目的基因 (图 8), 这表明菌液的低温耐性
是 GMCHI基因导入表达所引起。

图 7 GMCHI在菌液中的初步功能验证
Fig. 7 Primary identification of GMCHI function in E. coli
1: 非基因表达的菌落; 2: 基因表达的菌落; 3: 低温处理的非诱导基
因表达的菌落; 4: 低温处理的基因诱导表达的菌落。
1: E. coli without gene expression; 2: E. coli with gene expression; 3: E.
coli without gene expression after low temperature treatment; 4: E. coli
with gene expression after low temperature treatment.

图 8 利用 PCR方法对菌落的进一步验证
Fig. 8 Further identification to E. coli using PCR method
M: DNA2000 marker; 1: 空白对照; 2~5: 随机挑取的菌落。
M: DNA2000 marker; 1: control; 2–5: selected E. coli.

3 讨论
本试验得到 1个受低温诱导的 GMCHI基因。该基因
全长为 387 bp, 推测是一个在大豆中新被发现的基因。虽
然没有发现此基因序列含有保守功能域, 但这并不能断
定此基因没有功能。众所周知, 一些抗寒基因和 GMCHI
基因非常相似, 它们的基因序列长度很短并且也不含有
非常保守的区域, 但是对提高植株的抗逆境能力起非常
重要的作用, 例如 COR基因家族的成员, RD家族的一些
基因等等[3,12]。
植物在逆境条件下主要有 2 条信号转导途径, 即依
赖ABA和不依赖ABA的途径[6]。本试验结果表明GMCHI
基因被 ABA诱导(图 5), 说明 GMCHI在信号转导上依赖
于 ABA 途径, 但由于没有克隆到 GMCHI 基因的启动子,
还无法找到受 ABA调控的部位。目前所报道的对低温、
盐碱及干旱有响应的基因中, 很多都受 ABA 诱导, 例如
DREB、scof-1 及 RD 等家族基因[4-5,12], 因此可以初步判
断 GMCHI 基因可能和植物的抗寒有关。对于种子而言,
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PEG 是一种调节水势的渗透调节物质, 它能够减慢种子
萌发前吸胀过程中的吸水速率, 进而减少种子由于吸水
过快而造成的伤害 , 尤其是膜伤害 , 并且在生产上已经
取得了显著的效果。目前许多研究报道表明, 种子吸胀阶
段能被 PEG 诱导的基因都和胁迫相关[9]。PEG 处理后,
GMCHI在种子吸胀过程中能够被诱导表达, 暗示中黄 22
大豆品种能够适应低温下吸水, GMCHI 基因可能起着非
常重要的作用。
GMCHI 基因转入原核生物后, 此基因表达能够提高
细菌对低温的忍耐能力(图7), 这初步说明 GMCHI基因受
低温诱导, 可能是一个能够提高植物低温耐性的新基因。
但是现在还不能确定 GMCHI基因在植物中的作用, 尤其
是在大豆种子抗低温吸胀中的功能。虽然 CBF、LTI78及
ZAT12 能够提高转基因植株的抗胁迫能力[13-15], 到目前
为止 , 还没有发现和大豆种子低温吸胀相关的基因 , 如
果 GMCHI基因能够提高种子对低温吸胀的适应能力, 这
无疑给今后的育种工作提供了很大的帮助。
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