全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(9): 16881697 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(31071341, 31171482)和江苏省自然科学基金项目(BK2011445)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 王忠, E-mail: wangzhong@yzu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: wanglingling066@163.com (王玲玲); E-mail: liuzhikakashi@163.com (刘智) ** 同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2012-02-10; Accepted(接受日期): 2012-04-20; Published online(网络出版日期): 2012-07-03.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120703.0946.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01688
固定和染色方法对小麦胚乳细胞结构显示的影响
王玲玲 1,** 刘 智 1,** 熊 飞 1 李栋梁 1 周卫东 2 陈义芳 2
王 忠 1,*
1扬州大学 / 江苏省作物遗传生理重点实验室 / 农业部长江中下游作物生理生态与栽培重点开放实验室, 江苏扬州 225009; 2扬州大
学分析测试中心, 江苏扬州 225009
摘 要: 以扬麦 16小麦颖果为材料, 采用戊二醛-四氧化锇(GA-OsO4)或高锰酸钾固定, 并分别用 5种染色方法[甲苯
胺蓝-O (TBO)、多色性染液、高碘酸-希夫试剂(PAS)、考马斯亮蓝和 PAS-TBO]进行半薄切片染色, 对超薄切片进行
醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色 , 在光学显微镜和透射电镜下观察比较了小麦胚乳细胞结构显示的差异。结果表明 ,
GA-OsO4 固定的半薄切片染色效果整体上优于高锰酸钾固定, 但是在 PAS-TBO 复染中, 高锰酸钾固定制样效果最
好。在超薄切片观察中, GA-OsO4固定制样能较好地保存胚乳细胞超微结构, 但对膜性结构显示不够清晰, 而高锰酸
钾固定制样则能较好地固定细胞的膜性结构, 并且能够增强膜结构反差, 只是对多糖和蛋白质的固定和显色较差。因
此, 应根据观察对象来选择适当的固定及染色方法。
关键词: 小麦; 胚乳细胞; 固定方法; 染色方法; 半薄切片; 超薄切片
Effect of Fixation and Staining Methods on Structure Observation of En-
dosperm Cell of Wheat
WANG Ling-Ling1,**, LIU Zhi1,**, XIONG Fei1, LI Dong-Liang1, ZHOU Wei-Dong2, CHEN Yi-Fang2, and
WANG Zhong1,*
1 Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province / Key Laboratory of Crop Physiology, Ecology and Cultivation in Middle
and Lower Reaches of Yangtze River, Ministry of Agriculture, Yangzhou 225009, China; 2 Testing Center of Yangzhou University, Yangzhou
225009, China
Abstract: Two fixing methods and five staining agents were used to compare which one is best for optimal observation of en-
dosperm cell of wheat under optical and transmission electron microscopes. Caryopsis samples of Yangmai 16 were fixed with
glutaraldehyde-osmium tetroxide (GA-OsO4) or potassium permanganate and stained with toluidine blue (TBO), polychromatic
dye, periodic acid schiff (PAS), coomassie brilliant blue, or PAS-TBO during the preparation of semi-thin sections. The GA-OsO4
fixation showed better overall performance than the potassium permanganate fixation, but the best observation was got by potas-
sium permanganate fixation and PAS-TBO counterstaining. The GA-OsO4 fixation had the advantage of preserving endosperm
cell intrinsic feature in ultra-thin section but the disadvantage of unclear display of the membranous structure. The potassium
permanganate fixation was able to show the structure of the cell endomembrane vividly with satisfactory contrast between
background and membranous structure; however, the color stained in polysaccharide and protein was poor. Therefore, appropriate
fixation and staining methods should be based on the target and objective of experiment.
Keywords: Wheat; Endosperm cell; Fixation method; Stain method; Semi-thin section; Ultra-thin section
小麦是我国重要的粮食作物之一, 其胚乳体积
占颖果的 90%左右 , 是储藏营养物质的主要场所 ,
胚乳的发育状况对小麦品质和产量起着至关重要的
作用。对小麦胚乳细胞的发育过程和结构特点已有
大量报道[1-10]。传统切片观察胚乳细胞的方法是先将
颖果用化学固定剂固定经石蜡或树脂包埋后切片染
色, 最后用显微镜或电子显微镜观察, 但采用何种
固定液, 何种染液效果最佳, 目前尚无明确的报道。
第 9期 王玲玲等: 固定和染色方法对小麦胚乳细胞结构显示的影响 1689
我们曾用 2 种固定方法和不同染色方法对水稻
胚乳细胞制作半薄切片和超薄切片, 观察后发现戊
二醛-锇酸(GA-OsO4)固定的半薄切片染色效果整体
上优于高锰酸钾固定; GA-OsO4 固定制样的超薄切
片电镜观察可见清晰的细胞组织结构, 但细胞中内
膜性结构不够清晰, 而高锰酸钾固定制样则能较好
地显示细胞中内膜结构[11]。小麦胚乳细胞与水稻胚
乳细胞在结构和组分上存在一些差异, 水稻胚乳细
胞中淀粉体是复粒淀粉体, 即一个淀粉体中含多个
淀粉粒, 水稻胚乳细胞中蛋白体有 2种类型, 其中蛋
白体 I (protein body I, PbI)由粗面内质网(RER)发育
而来 , 呈球形 , 表面附有核糖体或多聚核糖体 , 蛋
白体 II (protein body II, PbII)由液泡发育而来, 多呈
不规则块状; 而小麦胚乳细胞中大淀粉体为单粒淀
粉体 , 即一个淀粉体只有一个淀粉粒(A-型), 小淀
粉体由大淀粉体出芽衍生, 或小淀粉体自身缢缩增
殖, 小淀粉体含多个小淀粉粒(B-型)。小麦胚乳细胞
中 A-型淀粉粒直径大于 15 µm, 在花后 4~10 d发生
与发育, B-型淀粉粒直径为 5~15 µm, 在花后 10~20
d 发生与发育 [12], 因此, 观察膜性结构对了解小麦
小淀粉体的发生和增殖有重要意义。此外, 小麦只
有一种胚乳蛋白体, 由内质网衍生或是由液泡发育
而来, 利用水稻胚乳细胞固定染色方法制作小麦胚
乳细胞结构切片, 能否获得清晰的观察效果尚未见
研究报道。本研究试用 2 种固定方法观察小麦胚乳
细胞淀粉体和蛋白体的发生发育, 比较 2 种固定方
法和 5 种半薄切片染色方法制片对小麦胚乳细胞结
构的观察效果, 旨在为研究小麦胚乳发育提供可靠
的技术方法。
1 材料与方法
1.1 材料及取样
2011年, 将扬麦 16按常规栽培方法种植于扬州
大学农学院网室, 4月底至 5月初进入开花期, 采用
挂牌和点颖相结合的方法标记开花时间。取发育天
数 5~26 d的颖果制作半薄切片和超薄切片。
1.2 样品固定包埋块的制备
1.2.1 GA-OsO4固定法 将发育不同天数的小麦
颖果去两端, 切成 1~3 mm3的小块, 迅速放入 2.5%
戊二醛固定液(用 0.2 mol L1 磷酸缓冲液配制)中,
0~4℃固定 3 h以上; 经 0.1 mol L1的磷酸缓冲液清
洗 3次, 再用 0.5%锇酸于 4℃下振荡固定 3 h; 然后
用缓冲液清洗 3 次, 乙醇逐级脱水, 环氧丙烷置换,
Spurr树脂浸透包埋; 最后在 70℃烘箱中聚合。
1.2.2 高锰酸钾固定法 将样品迅速放入 1.2%
高锰酸钾固定液(用巴比妥钠缓冲液配制, 含 0.5%
NaCl), 0~4℃下固定 4 h, 用巴比妥钠缓冲液清洗 5
次后乙醇逐级脱水, 环氧丙烷置换, Spurr 树脂浸透
包埋, 70℃烘箱聚合。
1.3 切片、染色与观察
用 2 种固定方法制作的样品包埋块经修样后,
均在超薄切片机(Leica Ultracut R, Leica, Germany)
上切片, 半薄切片厚度为 1 µm, 超薄切片厚度为 70
nm。超薄切片经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色, 于透
射电子显微镜(Philip Tecnai 12, Philips, Holland)下
观察并拍照。用 Adobe Photoshop CS3软件对高锰酸
钾固定样品的超薄切片图片上色处理。半薄切片用
甲苯胺蓝 -O (TBO)、多色性、高碘酸 -希夫试剂
(periodic acid schiff, PAS)、考马斯亮蓝和 PAS-TBO
复染 5 种方法染色 , 于光学显微镜(Leica DMLS,
Leica, Germany)下观察, 用附带的成像系统照相。
(1) TBO 染色。将切片置于 70℃恒温烤片机
(Leica EMMP, Leica, Germany)上加热烤干, 滴加 1%
TBO (用 1%四硼酸钠配制[13])溶液, 加热 1~2 min,
用蒸馏水洗净多余染液, 烤干后显微观察。
(2) 多色性染色。在王爽等[14]的方法上略作改
动, 先配制 0.2 mol L1磷酸二氢钠缓冲液(pH 7.2)、
10 g L1次甲基蓝溶液和 0. 5 g L1碱性复红溶液, 再
将这 3种溶液按 10∶2∶8比例混合, 用混合液对切
片染色。
(3) PAS 染色。能将 GA-OsO4固定制样的切片
中的淀粉体和蛋白体染成洋红色, 而细胞壁染色较
浅。参考 Lyon等[15]报道的标准法配制试液, 置 4℃
冰箱内密闭贮备。染色前将切片加热烤干, 先滴加
0.5% HIO4, 加热 10 min左右, 当切片周围有大量小
气泡出现后用蒸馏水清洗 , 烤干后滴加希夫试剂 ,
反应 30~60 s, 观察到切片呈现玫瑰红色即可清洗,
烤干后显微观察。
(4) 考马斯亮蓝染色。考马斯亮蓝染液可以将细
胞质中的贮藏蛋白染成深蓝色 , 具有较高专一性 ,
用该染色法可以较好地观察小麦胚乳细胞中蛋白体
的分布和发育情况。参考胡适宜等[16]的方法, 略有
改动。取 1 g考马斯亮蓝 R, 加 7%醋酸 100 mL。装
入小口瓶中, 置于 60℃温箱中待完全溶解后备用。
染色方法同 TBO染色。
(5) PAS-TBO复染。半薄切片经 PAS染色并洗
1690 作 物 学 报 第 38卷
净烤干后再滴加 1% TBO 溶液, 置烤片机上加热,
用蒸馏水清洗, 烤干后显微观察。
1.4 成熟小麦籽粒扫描电镜观察
参考自然断裂法[17]。取发育正常饱满的小麦成
熟颖果, 用单面刀片在籽粒背部轻划一刀痕, 用镊
子夹住其两端, 使籽粒自然断裂, 用小刀切下断裂
部, 制成 3 mm厚的样品。选择断面平整且完整的样
品, 自然断裂面向上, 用双面胶带粘贴在样品台上,
离子溅射镀金, 于扫描电子显微镜(Hitachi S-4800II
FESEM, Hitachi, Japan)下观察胚乳细胞结构。
2 结果与分析
2.1 染色和固定方法对胚乳细胞显微结构呈色
的影响
从花后 7 d 和 14 d 的观察结果显示 , 常规
GA-OsO4 固定制样的半薄切片整体染色效果优于高
锰酸钾固定制样, 而高锰酸钾固定的样品染色时间
普遍比 GA-OsO4固定的样品短。
2.1.1 TBO 染色 TBO 染色能使 GA-OsO4固定
制样的细胞壁、细胞核、淀粉体、蛋白体在光镜下
清晰可见, 但液泡膜以及淀粉体被膜不明显(图 1-A,
B)。花后 7 d样品用高锰酸钾固定制样的切片用 TBO
染色, 可观察到淀粉体被染成深蓝色, 细胞壁、细胞
核稍被染色, 其他细胞器几乎不被染色(图 1-C), 这
可能是高锰酸钾固定液对淀粉粒染色有促进作用的
缘故[18]。花后 14 d 的样品 2 种固定方法的 TBO 染
色效果较接近, 但高锰酸钾固定制样的淀粉体被膜
突出 , 而细胞核的染色较 GA-OsO4 固定制样的浅
(图 1-B, D)。
2.1.2 多色性染色 GA-OsO4固定的样片用多色
性染液染色效果良好, 细胞壁、淀粉体被膜和蛋白
体呈玫瑰红色, 细胞核呈蓝色, 整个切片着色均匀,
反差大(图 1-E, F)。高锰酸钾固定制样的花后 7 d半
薄切片多色性染色整体效果与 TBO染色类似, 淀粉
粒被染成深红色, 淀粉体被膜和细胞壁部分有浅红
色出现(图 1-G); 花后 14 d 的切片染色效果较理想,
细胞核深蓝色, 蛋白体、细胞壁、淀粉体被膜呈玫瑰
红色, 尤其是淀粉体被膜着色好, 轮廓清晰(图 1-H)。
2.1.3 PAS染色 花后 7 d的染色较花后 14 d的
深(图 1-I, J)。高锰酸钾固定制样的切片用 PAS法染
色能较好地显示出小麦胚乳细胞内部结构 , 细胞
壁、淀粉粒、蛋白体、淀粉体被膜以及贮藏蛋白液
泡膜被染成浅洋红色, 结构显示较清晰, 但细胞核
染色较浅(图 1-K, L)。
2.1.4 考马斯亮蓝染色 花后 7 d, 在常规固定
制样的胚乳细胞中观察到小的球状蛋白体(图 1-M),
而高锰酸钾固定制样的则不明显(图 1-O)。花后 14 d,
蛋白体数量增多, 体积增大, 许多蛋白体聚集在一
起, 融合成无定形的大蛋白体, 此时胚乳细胞中 B-
型淀粉粒数目增多(图 1-N, P)。
2.1.5 PAS-TBO 复染 先对切片进行 PAS 染色,
此时淀粉体呈玫瑰红色, 蛋白体呈浅红色, 细胞壁
和细胞核几乎不被染色; TBO 复染后, 原先没有被
染色的或染色较浅的细胞壁、蛋白体、细胞基质和
细胞核都被染成蓝色(图 1-Q, R, S, T), TBO的复染
弥补了 PAS染液对蛋白体、细胞壁、细胞基质以及
细胞核的染色不足。高锰酸钾固定的花后 7 d 的样
片中, 胚乳细胞和淀粉粒呈玫瑰红色, 细胞壁呈浅
蓝色, 细胞中的内质网、高尔基体等被染成蓝色, 且
液泡膜和淀粉体的被膜结构清晰(图 1-S); 花后 14 d
的样片中, A-型和 B-型淀粉粒被染成玫瑰红色, 显
示在胚乳细胞中 A-型淀粉粒体积增大, B-型淀粉粒
数目增多, 而细胞壁、淀粉粒被膜以及蛋白体被染
成蓝色(图 1-T)。
2.2 固定方法对胚乳细胞超微结构显示的影响
2.2.1 高锰酸钾固定制样 对花后不同发育天数
的小麦颖果进行高锰酸钾固定, 切片染色后用电子
显微镜观察, 可见十分清晰的胚乳细胞内膜结构。
在被观察的小麦胚乳细胞内, 核膜、内质网、前质
体和淀粉体膜等内膜完整, 形态清晰可辨(图 2-A)。
花后 5 d, 扁豆状的 A-型淀粉粒开始发育, 并且随
着胚乳细胞的发育体积不断增大。花后 6 d 的胚乳
细胞淀粉体较花后 5 d 明显增大, 淀粉体被膜轮廓
清晰, 淀粉体内基质浓密, 淀粉粒呈典型的凸透镜
状(图 2-B); 此时胚乳细胞高尔基体、高尔基体小泡、
内质网和前质体丰富(图 2-C), 推测细胞内生命代谢
活动旺盛; 在一些胚乳细胞的淀粉体中淀粉粒体积
较小, 平面上见到的管状结构实际为片层膜结构在
淀粉粒两端大量分布(图 2-D), 淀粉体具双层被膜
(图 2-E), 这在观察小麦胚乳细胞淀粉体被膜与淀粉
体增殖的关系中有着重要意义; 还可见到由高尔基
体分泌的由单层膜包裹的电子致密小泡(图 2-E), 这
些电子致密小泡参与合成和运输等生命代谢活动。
花后 8 d, 胚乳细胞里已有大量的淀粉体, 每个淀粉
体中只有一个 A-型淀粉粒(图 2-F), 还未充实至整
个淀粉体, 在基质中有平行排列的片层膜结构(图
2-G, H), 同时细胞基质中还出现少量贮藏蛋白颗粒
(图 2-I)。
第 9期 王玲玲等: 固定和染色方法对小麦胚乳细胞结构显示的影响 1691
图 1 固定与染色方法对半薄切片中胚乳细胞结构呈色的影响(×1000)
Fig. 1 Influence of fixation and staining methods on structural coloration of endosperm cells in semi-thin sections (×1000)
A~D: TBO染色; E~H: 多色性染色; I~L: PAS染色; M~P: 考马斯亮蓝染色; Q~T: PAS-TBO复染。GA-OsO4固定制样花后 7 d的胚乳细
胞示淀粉体和蛋白体在生长发育前期的形态; 花后 14 d的胚乳细胞示淀粉体和蛋白体的数目增加, 体积增大, 其中照片N中蛋白体融
合成许多无定形蓝色蛋白块。高锰酸钾固定制样花后 7 d的胚乳细胞示胚乳细胞发育前期丰富的细胞镜观, 膜结构细胞器显示突出;
花后 14 d的胚乳细胞示淀粉体和蛋白体不断积累, B-型淀粉粒数目增多, 其中照片 P中蛋白体融合成无定形蛋白块。Nu: 细胞核; Pb:
蛋白体; Sg: 淀粉粒; Sa: A-型淀粉粒; Sb: B-型淀粉粒。
A–D: staining of TBO; E~H; staining of Pleochroic dye; I–L: staining of PAS; M–P: staining of Coomassie brilliant blue; Q–T: staining of
PAS-TBO. The portion of endosperm cells at 7 d after flowering with GA-OsO4 fixation shows the morphological characteristics of amy-
loplast and protein body at the early growth stage, and the portion of endosperm cells at 14 d after flowering shows amyloplast and protein
body increased in number and volume. Picture N shows the protein bodies fused and forming many blue formless clumps. The portion of
endosperm cells at 7 d after flowering with KMnO4 fixation shows the morphological characteristics of endosperm cell at early growth stage
with clear membranous structure of organelle. The portion of endosperm cells at 14 d after flowering shows amyloplast and protein body in a
continuous accumulation and the increase of B-type starch granule. Picture P shows protein bodies fused and forming formless clumps. Nu:
nucleus; Pb: protein body; Sg: starch granule; Sa: A-type starch granule; Sb: B-type starch granule.
2.2.2 GA-OsO4 固定制样 该法能较好地保存
胚乳细胞超微结构, 能清晰地显示胚乳细胞中的淀
粉粒、蛋白体、内质网、液泡等细胞器, 淀粉粒上
有较多的电子密度较高的斑块。但与高锰酸钾固定
方法相比, 淀粉体的双层被膜反差较低, 淀粉粒长
轴方向两端片层膜结构不明显(图 3-B, C)。花后 6 d
的胚乳细胞中有大量的液泡, 内质网、线粒体等细
胞器, 从电子致密程度来判断, 有的液泡中已经开
始积累蛋白(图 3-A)。花后 8 d胚乳细胞细胞核呈球
形, 形态完整, 淀粉体数目增多, 体积增大。细胞核
周围可见正在发生缢缩增殖的淀粉体。液泡中积累
的蛋白质电子致密程度加深, 蛋白体已具初步结构
1692 作 物 学 报 第 38卷
图 2 高锰酸钾固定法制样的小麦胚乳细胞超微结构
Fig. 2 Ultrastructure of endosperm cell with potassium permanganate fixation
A: 花后 5 d的胚乳细胞, 示细胞核、核孔(箭头)、高尔基体、原质体、内质网和淀粉体(bar=2 µm); B: 花后 6 d的胚乳细胞, 示淀粉体
的形态(bar=2 µm); C: 花后 6 d的胚乳细胞, 示淀粉体、高尔基体以及高尔基体分泌的致密小泡(bar=2 µm); D: 照片 C局部放大(bar =1 µm); E:
照片 D矩形框区域放大, 示致密小泡、淀粉粒和淀粉体被膜(箭头) (bar=0.2 µm); F: 花后 8 d的胚乳细胞, 示淀粉体的形态和分布, 每
个淀粉体内含有一个 A-型淀粉粒(bar=5 µm); G: 花后 8 d的胚乳细胞, 示淀粉粒在淀粉体内增大以及淀粉粒赤道面沟槽和片层膜结构
(星号) (bar=2 µm); H: 照片 G矩形框区域放大, 示淀粉体边缘处片层膜结构(星号) (bar=1 µm); I: 花后 8 d胚乳细胞, 示蛋白体和蛋白
贮藏液泡(bar=1 µm)。 Ae: 淀粉体被膜; As: 淀粉体基质; Cm: 细胞质基质; Cw: 细胞壁; Dv: 电子致密小泡; Ga: 高尔基体; Nu: 细胞
核; Nm: 核膜; Pr: 前质体; Pb: 蛋白体; PSV: 蛋白贮藏液泡; RER: 粗面内质网; Sg: 淀粉粒。
A: portion of endosperm cell at 5 d after flowering (DAF), showing nucleus, nuclear pores (arrowheads), golgi apparatus, proplastid, endo-
plasmic reticulum, and amyloplast (bar=2 μm); B: portion of endosperm cell at 6 DAF, showing morphological characteristics of amyloplast
(bar=2 μm); C: portion of endosperm cell at 6 DAF, showing amyloplast, golgi apparatus, and dense vesicle (bar=2 μm); D: amyloplast area in
picture-C enlarged (bar=1 μm); E: boxed area in picture-D enlarged to show the dense vesicle, starch granule, and amyloplast envelop (ar-
rowhead) (bar=0.2 μm); F: portion of endosperm cell at 8 DAF, showing the morphological character and distribution of amyloplast and a
single A-type starch granule in one amyloplast (bar=5 μm); G: portion of endosperm cell at 8 DAF, showing the developing starch granule in
amyloplast and the location of tubili and equatorial groove in granule (asterisk) (bar=2 μm); H: boxed area in picture-G enlarged to show the
tubuli at the periphery of the granule (asterisk) (bar=1 μm); I: portion of endosperm cell at 8 DAF, showing protein body and protein storage
vacuole (bar=1μm). Ae: amyloplast envelope; As: amyloplast stroma; Cm: cytoplasmic matrix; Cw: cell wall; Dv: dense vesicle; Ga: golgi
apparatus; Nu: nucleus; Nm: nuclear membrane; Pr: proplastid; Pb: protein body; PSV: protein storage vacuole; RER: rough endosplasmic
reticulum; Sg: starch grain.
第 9期 王玲玲等: 固定和染色方法对小麦胚乳细胞结构显示的影响 1693
图 3 GA-OsO4固定法制样的小麦胚乳细胞超微结构
Fig. 3 Ultrastructure of endosperm cell with GA-OsO4 fixation
A: 花后 6 d的胚乳细胞, 示淀粉体和蛋白贮藏液泡(PSV), 淀粉体中含有一个A-型淀粉粒, PSV中开始积累蛋白质(bar=2 μm); B: 照片
A的矩形框区域放大, 示淀粉体、PSV、蛋白体的亚显微结构, 淀粉体双层被膜结构清晰, 片层膜结构不明显(箭头) (bar=1μm); C: 花
后 8 d的胚乳细胞, 示淀粉体内 A-型淀粉粒, 淀粉体缢缩增殖, 片层膜结构不明显(箭头) (bar=2 μm); D: 花后 8 d的胚乳细胞, 示细胞
核、淀粉体和蛋白体的亚显微结构(bar=10 μm); E: 花后 8 d的胚乳细胞, 示小液泡中蛋白体形态(bar=1 μm); F: 花后 10 d的胚乳细胞,
示淀粉体和 PSV的亚显微结构, PSV中含多个蛋白体(bar=5 μm); G: 照片 F矩形框区域放大, 示 PSV超微结构, 蛋白体沿 PSV边缘分
布(bar=5 μm); H: 花后 12 d的胚乳细胞, 示淀粉体和蛋白体的数目增多(bar=10 μm); I: 花后 14 d的胚乳细胞亚显微结构(bar=5 μm); J:
花后 14 d的胚乳细胞, 示 PSV中蛋白体和蛋白质基质小泡(bar=1 μm); K: 花后 16 d的胚乳细胞, 示小淀粉粒在大淀粉粒周围出现, 大
淀粉粒赤道面沟槽处的片层膜结构消失(箭头) (bar=5 μm); L: 花后 16 d的胚乳细胞, 示内质网腔膨大, 积累蛋白质(bar=2 μm); M: 照
片 L矩形框区域放大, 示内质网衍生蛋白体 (bar=1 μm); N: 花后 18 d的胚乳细胞, 示 B-型淀粉粒增多(bar=10 μm); O: 照片 N矩形框
区域放大, 示一个淀粉体内有 4个 B-型淀粉粒(bar=5 μm); P: 花后 20 d的胚乳细胞, 示细胞中有大量 B-型淀粉粒(bar=10 μm); Q: 花
后 20 d的胚乳细胞, 示在 A-型淀粉粒的淀粉体内发生 B-型淀粉粒(bar=2 μm); R: 花后 24 d的胚乳细胞, 示淀粉粒和贮藏蛋白充满胚
乳细胞, 细胞核被挤缩至细胞边缘并变形(bar=10 μm); S: 花后 26 d的胚乳细胞, 示蛋白体在细胞质基质中聚集成无定形蛋白块(bar =
2 μm); T: 成熟小麦籽粒淀粉胚乳横断面, 示 A-型和 B型淀粉粒及大小淀粉粒间的蛋白质基质(箭头) (bar=20 μm)。Nu: 细胞核; Pb: 蛋
白体; PSV: 蛋白贮藏液泡; RER: 粗面内质网; Sa: A-型淀粉粒; Sb: B-型淀粉粒。
1694 作 物 学 报 第 38卷
A: portion of endosperm cell at six days after flowering (DAF), showing amyloplast and protein storage vacuole (PSV), a single A-type starch
granule in amyloplast, and initial building of protein in PSV (bar=2 μm); B: boxed area in picture-A enlarged to show the submicroscopic
structure the clear two-layer membrane of amyloplast envelop and the unconspicuous structure of tubuli (arrowhead) (bar=1 μm); C: portion
of endosperm cell at 8 DAF, showing the proliferation of amyloplast with constricted A-type starch granule and the unconspicuous structure
of tubuli (arrowheads) (bar=2 μm); D: portion of endosperm cell at 8 DAF, showing submicroscopic structure of nucleus, amyloplast, and
protein body (bar=10 μm); E: portion of endosperm cell at 8 DAF, showing the structure of protein body in small vacuole (bar=1 μm); F:
portion of endosperm cell at 10 DAF, showing submicroscopic structure of amyloplast and PSV and several protein bodies in PSV (bar = 5
μm); G: boxed area in picture-F enlarged to show the protein bodies in PSV distributing along the edge of PSV (bar=5 μm); H: portion of
endosperm cell at 12 DAF, showing the number of amyloplast and protein body increased (bar=10 μm); I: submicroscopic structure of en-
dosperm cell at 14 DAF (bar=5 μm); J: portion of endosperm cell at 14 DAF, showing protein body and small vacuole of protein matrix in
PSV (bar=1 μm); K: portion of endosperm cell at 16 DAF, showing appearance of small starch granules around large starch granules (A-type
starch granule) and the disappearance of tubuli at equatorial groove in granule (arrowheads) (bar=5 μm); L: portion of endosperm cell at 16
DAF, showing storage protein accumulation in swelling lumen of rough endoplasmic reticulum (RER) (bar=2 μm); M: boxed area in picture-L
enlarged, showing protein body derived from RER (bar=1 μm); N: portion of endosperm cell at 18 DAF, showing number of B-type starch
granule increased (bar=10 μm); O: boxed area in picture-N enlarged to show four B-type starch granules in one amyloplast (bar=5 μm); P:
portion of endosperm cell at 20 DAF, showing a large number of B-type starch granules in an endosperm cell (bar=10 μm); Q: portion of
endosperm cell at 22 DAF, showing the development of B-type starch granules in an amyloplast, which contains A-type starch granules
(bar=2 μm); R: portion of endosperm cell at 24 DAF, showing endosperm cell filled with starch granules and protein matrix, the deformed
nucleus shrinking to the edge of the cell (bar=10 μm); S: portion of endosperm cell at 26 DAF, showing protein bodies fused and formed as
formless clumps in cytoplasmic matrix (bar=2 μm); T: nature fracture surface of side region in mature kernel, showing A- and B- types starch
granules and protein matrix around (arrowhead) (bar=20 μm). Nu: nucleus; Pb: protein body; PSV: protein storage vacuole; RER: rough
endosplasmic reticulum; Sa: A-type starch granule; Sb: B-type starch granule.
形态(图 3-C, D, E)。在花后 10 d的胚乳细胞中, 蛋
白质贮藏液泡中的蛋白体积累增多(图 3-F), 蛋白体
截面与线粒体截面大致相等。有的蛋白体附着在蛋
白质贮藏液泡膜上, 推测这些蛋白体有可能刚刚进
入蛋白质贮藏液泡中(图 3-G)。花后 12 d, 胚乳细胞
中的淀粉体和蛋白体数量增多、体积增大, 淀粉体
分布在中央大液泡周围, 大小不等的球形贮藏蛋白
分布在细胞质和蛋白贮藏液泡中(图 3-H)。花后 14 d,
淀粉粒长轴直径长度达到 12 μm, 大部分呈椭圆状
或棒状, 几乎看不见淀粉体被膜和片层膜结构, 此
时有少量位置邻近的蛋白体发生融合, 形成无定形
蛋白块(图 3-I)。在蛋白质贮藏液泡中有大量的蛋白
体和电子致密小泡, 蛋白体上附着一些小泡并与蛋白
体结合, 使蛋白体的体积增大, 而有的小泡融合在一起
形成新的蛋白体(图 3-J)。花后 16 d, 胚乳细胞中 B-
型淀粉粒开始出现, 直径为 2~3 μm, 分布在 A-型淀
粉粒周围, 而此时 A-型淀粉粒长轴直径已达 11~18
μm, 淀粉体双层被膜不明显, 分散在淀粉粒周围。
由于淀粉粒在数量和体积上迅速增多, 占据了细胞
中大部分体积, 细胞核被挤压变形至不规则形状。
部分内质网网腔和末端膨大, 积累贮藏蛋白, 并当
贮藏蛋白体积达到一定程度时与内质网脱离, 形成
圆球状蛋白体, 蛋白体周围附着核糖体(图 3-K, L,
M)。花后 18 d, 在胚乳细胞中观察到 B-型淀粉体内
有多个椭球形淀粉粒(图 3-N), 相互接触面发生变形
产生棱边, 类似花后 3~5 d 水稻淀粉粒的形状(图
3-O)。花后 20 d的胚乳细胞内 B-型淀粉粒数量迅速
增大(图 3-P), B-型淀粉粒在 A-型淀粉体内以出芽的
方式发生, 如 A-型淀粉体长轴方向中部向基质内突
起产生 3 个 B-型淀粉粒, 此时这 3 个淀粉粒还未脱
离 A-型淀粉体(图 3-Q)。同时细胞内还不断积累贮
藏蛋白, 蛋白体的体积也不断增大, 有的已经超过
B-型淀粉粒。花后 24 d, 胚乳细胞中充满 A-型淀粉
粒、B-型淀粉粒和贮藏蛋白, 淀粉体被膜消失或已
发生降解。B-型淀粉粒的数量继续增加, 部分含 B-
型淀粉粒的淀粉体内有 2~3个淀粉粒(图 3-R)。花后
26 d, 胚乳接近成熟, 胚乳细胞富含淀粉粒和蛋白
质, 结构紧密, 蛋白体分布在 2种淀粉粒间隙, 被挤
压融合成块状(图 3-S)。对成熟籽粒的扫描电镜观察
表明, A 型淀粉粒占据细胞大部分体积, 而 B-型淀
粉粒数量最多, 贮藏蛋白质基质分布其间(图 3-T)。
3 讨论
3.1 固定剂的选择
固定是指用化学固定剂或冷冻、干燥及高温等
物理方法迅速杀死细胞的过程, 目的是尽可能使细
胞中的各种细胞器以及大分子保持原有状态, 不发
生位移, 使脱水、包埋、切片、染色以及电镜观察
期间组织机构变化最小[19]。因此, 对材料固定的好
坏将直接影响显微结构图片成像质量。理想的固定
剂应使细胞中各种成分都得到良好的固定, 但是目
前还没有一种理想的固定剂能将细胞中的物质全部
固定。
戊二醛前固定, 锇酸后固定双重固定制样方法
广泛应用在动植物中。戊二醛对样品的穿透力较强,
能固定较大的组织块, 既能很好地固定蛋白质和糖
第 9期 王玲玲等: 固定和染色方法对小麦胚乳细胞结构显示的影响 1695
元等结构, 也不易使酶丢失活性, 且长时间固定不
会使组织变脆, 因此能较好的保存组织的超微结构,
但对磷脂固定效果欠佳 , 膜结构细胞器反差不明
显。锇酸能较好的固定蛋白质、脂肪酸, 弥补了戊
二醛的不足之处。但有时植物样品采用此法制样经
双重染色后反差较低, 有时会出现组织结构不完整,
图像不清晰等现象[11]。这可能与植物样品过大或组
织致密固定液难以渗透到样品内部有关。另外, 在
实验过程中应该注意 pH和温度, 中性或碱性 pH均
能使戊二醛聚合 , 降低固定效果 , 戊二醛前固定 ,
锇酸后固定宜在 4℃条件下进行。
高锰酸钾是一种强氧化剂, 在固定细胞的过程
中能形成二氧化锰, 它能去除细胞质内的可溶性蛋
白质和蛋白性结构, 并保留膜中的脂类成分(二氧化
锰能以微细颗粒沉积于脂类的亲水端), 因而细胞内
的膜性结构(如内质网系统、高尔基体复合体、淀粉
体、液泡和线粒体等)被清晰显示出来[20]。但它对多
糖、细胞质基质固定效果欠佳, 从小麦胚乳细胞发
育后期的切片上来看, 淀粉粒和贮藏蛋白结构模糊,
在电镜下电子密度低 , 没有 GA-OsO4 固定反差明
显。基于高锰酸钾固定剂对植物组织的固定特性 ,
可以将它运用在观察细胞内膜性结构细胞器中, 对
本研究而言 , 内质网 , 淀粉体被膜 , 淀粉体片层膜
结构, 高尔基体及其衍生的电子致密小泡是观察重
点, 这对研究淀粉体增殖和贮藏蛋白的积累过程有
着重要意义。
3.2 不同染色方法的半薄切片
花后 4~10 d, 小麦胚乳细胞中大淀粉体开始发
生与发育, 数量较少而体积较大; 同时, 花后 7 d左
右, 蛋白体开始出现[21]。花后 14 d, 胚乳细胞处于生
长分化阶段, 此时小淀粉体开始出现[22]。贮藏蛋白
也在该时期不断积累, 本研究为了能够兼顾大小淀
粉体和蛋白体三者的光镜观察, 选择花后 7 d 和花
后 14 d的小麦颖果胚乳为制片材料。
从 2 种固定方法的半薄切片染色结果上看, 不
同的染色方法对细胞中组织呈色情况不同, 各有其
优缺点。GA-OsO4固定, TBO 染色的半薄切片染色
效果比高锰酸钾固定的好, 尤其是花后 7 d 的胚乳
细胞中只有淀粉粒被染色, 而其他细胞器几乎不被
染色。在多色性染色、PAS 染色和考马斯亮蓝染色
都有类似现象, 直到花后 10 d以后细胞壁、蛋白体
和细胞核才能被染色。这可能是因为发育前期的小
麦胚乳较幼嫩, 取样时考虑到保持其结构完整性而
没有将颖果切成小块, 高锰酸钾固定液无法渗透到
细胞内部, 胚乳内部组织固定不充分, 导致染色不
充分。GA-OsO4固定的多色性染色效果与 TBO染色
类似, 只是两者呈色情况不同, 其中多色性染色法
使细胞核呈蓝色, 细胞壁、淀粉体被膜和蛋白体呈
玫瑰红色, 反差明显, 是观察半薄切片中细胞核在
胚乳发育过程中变化的较理想染色方法。高碘酸-希
夫试剂(PAS)法是鉴定多糖类物质良好的组织化学
方法, 能将组织中的糖原和糖蛋白染成鲜艳的紫红
色。PAS 反应作为多糖类的组织化学方法已广泛被
应用, 在植物组织中常用来鉴定淀粉粒, 但该染色
方法对细胞壁、细胞核、蛋白体以及细胞基质染色
不足, 若专一性观察胚乳发育过程中淀粉充实状况,
PAS 染色法是较好的选择。考马斯亮蓝能将胚乳细
胞中的贮藏蛋白染成深蓝色, 淀粉体、细胞壁和细
胞核几乎不被染色, 是观察蛋白体生长发育和贮藏
蛋白积累过程较理想的染液。该方法曾被用于观
察不同作物胚乳蛋白质积累状况, 获得了较好的效
果[9,15,23]。
通过对 4 种染色液单独使用对半薄切片呈色效
果的分析, 用不同的单色性染液对切片复染, 以期
找到一种较理想的观察胚乳细胞发育的染色方法。
结果发现 PAS-TBO复染效果最好。PAS法对多糖的
呈色是基于醛类和希夫试剂的结合, 产生的红色反
应是不易脱色的 , 所以在复染时作为第一步染色 ,
接着用脂类或蛋白质的试剂染色不受干扰[15]。从结
果中看, 此染色方法对高锰酸钾固定制样效果更加
显著。不仅淀粉粒呈玫瑰红色, 而且细胞壁、内质
网、蛋白体、淀粉体被膜被染成蓝色, 融合了 PAS和
TBO染色法的优点, 且互不干扰, 照片清晰美观。
3.3 2种固定方法的超薄切片
高锰酸钾固定法最显著的特点是对胚乳细胞中
的膜结构保存良好, 尤其是淀粉体被膜和其内的片
层膜结构。淀粉体被膜在淀粉的积累过程中具有重
要作用。Buttrose [1]认为参与淀粉合成的酶类结合在
内膜上。罗玉英[24]在玉竹造粉质体中观察到分裂环
结构, 认为该结构与造粉质体的缢缩和最后的分裂
有关。因此清晰的超微结构对研究膜性细胞器的生
命活动十分重要。在淀粉不断积累的同时, 淀粉体
内的片层膜结构也异常丰富, 从切片中来看, 这种
片层膜结构呈不同长度的圆柱体, 平行或垂直于切
片平面, 它们不与淀粉体内膜联系, 散布在淀粉体
基质中, 主要集中在淀粉粒长轴两端凹陷处(图 2-G),
1696 作 物 学 报 第 38卷
边缘部位也有少量分布(图 2-H)。这种片层膜结构在
小麦花后 3 周以内都能看到(图 2-F, G; 图 3-R), 大
约在花后 24 d以后才渐渐消失(图 3-P, Q, R)。这些
位于大淀粉体外缘处细窄形的片层膜结构被认为在
淀粉积累过程中起重要作用[17]。Parker[3]在花后 25 d
的小麦胚乳中观察到多个小淀粉体在大淀粉体赤道
面沟槽处和边缘发生。Buttrose [1]和 Hughes [22]认为
小淀粉体起源于大淀粉体的突出部分, 并以出芽的
方式脱离大淀粉体, 在细胞质基质中生长。本研究
利用 GA-OsO4 固定法观察到 B-型淀粉粒在大淀粉
体内发生, 同时小淀粉体还可以自身增殖, 一个小
淀粉体可以含有多个小淀粉粒(图 3-N, Q)。
关于小麦蛋白体的起源、贮藏蛋白运输与积累
的基粒一般认为蛋白质在粗面内质网(RER)上合成,
边翻译边被运输到内质网腔内, 接着通过高尔基体
运输到蛋白质贮藏液泡(PSV)中[24]。虽然在小麦胚乳
分化期, 作者用高锰酸钾固定法观察到了高尔基体
的存在 , 但其分泌的电子致密小泡直径约 0.1~0.2
μm (图 2-E), 而 RER腔中积累的蛋白质颗粒直径约
0.3~0.5 μm (图 3-M), 且这些蛋白颗粒在未脱离RER
形成独立的离散蛋白体前体积还在不断增大, 这种
直径上的差距使得高尔基体无法将这些蛋白颗粒运
输到 PSV 中, 推测 PSV 中贮藏蛋白是由 RER 衍生
出蛋白体, 蛋白体再直接进入 PSV中。此外, PSV中
含大量蛋白质基质小泡, 这些小泡融合在一起形成
贮藏蛋白(图 3-J)。
4 结论
以GA-OsO4固定制样的半薄切片能观察到胚乳
整个生长发育周期的形态, 5种染色方法中以TBO和
多色性染液较好; 高锰酸钾固定制样则以 PBS-TBO
复染效果最好。以 GA-OsO4固定制样的超薄切片能
较好观察到胚乳细胞淀粉体发生发育以及贮藏蛋白
积累的过程, 而高锰酸钾制样侧重于固定细胞的膜
性结构, 是一种观察膜系结构及其变化的好方法。
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