全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(8): 1439−1444 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由农业部作物种质资源保护项目(NB08-2130135-(25-30)-21)和国家科技支撑计划项目(2006BAD08A06)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 王晓鸣, E-mail: wangxm@mail.caas.net.cn
第一作者联系方式: E-mail: whuiweiw@163.com
Received(收稿日期): 2009-02-10; Accepted(接受日期): 2009-03-14.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01439
玉米中 QM同源基因的克隆及其差异表达分析
王会伟 李洪杰 朱振东 武小菲 王晓鸣*
中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京 100081
摘 要: 利用 cDNA-AFLP和 5′ RACE技术在玉米自交系黄早四 Ht2上分离并克隆了 QM(编码核糖体蛋白 L10)同源
基因(命名为 ZmQM)。其 cDNA全长为 967 bp, 开放阅读框为 738 bp。该基因编码 245个氨基酸的 ZmQM蛋白, 分
子量为 27.78 kD, 等电点为 10.69, 预测含蛋白酶 C 磷酸化位点、N-酰基化位点和酰胺化等位点。玉米 ZmQM 蛋白
与包括人类等 l3 个物种 QM 蛋白的同源性比较发现, 氨基酸序列相似性为 66%~92%。RT-PCR 分析表明, 在接种玉
米大斑病菌(Exserohilum turcicum) 1 号小种 12 h 后, 黄早四 Ht2 中 ZmQM 基因表达量较黄早四中明显上调, 推测
ZmQM基因可能参与黄早四 Ht2对玉米大斑病菌 1号小种的抗性反应。
关键词: QM基因; 核糖体蛋白 L10; ZmQM基因; 黄早四 Ht2; Exserohilum turcicum
Cloning and Differential Expression of QM-Like Protein Homologue from
Maize
WANG Hui-Wei, LI Hong-Jie, ZHU Zhen-Dong, WU Xiao-Fei, and WANG Xiao-Ming*
Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement
(NFCRI), Beijing 100081, China
Abstract: A full-length QM-like cDNA (designated ZmQM) was cloned from maize (Zea mays L.) leaf tissues using cDNA am-
plified fragment length polymorphism (cDNA-AFLP) and rapid amplification of cDNA ends (RACE) techniques. The expression
of ZmQM was examined in leaves of the Ht2 isogenic lines Huangzaosi and HuangzaosiHt2 carrying gene Ht2 for resistance to
northern corn leaf blight after inoculation with race 1 of Exserohilum turcicum (Pass.) Leonard et Suggs. Gene ZmQM contains an
open reading frame 738 bp in length, which encodes 245 amino acids with a predicted molecular weight of 27.78 kD and an
isoelectric point of 10.69. Scanning PROSITE motifs indicated that the amino acid sequence of ZmQM protein includes a Ribo-
somal protein Ll0e signature, an N-glycosylation site, four protein kinase C phosphorylation sites, a casein kinase II phosphoryla-
tion site, a tyrosine kinase phosphorylation site, an N-myristoylation site, and an amidation site. The nucleotide sequence of
ZmQM shared 66–92% identity to QM genes isolated from other species. RT-PCR analysis showed that the expression of gene
ZmQM was up-regulated in Huangzaosi Ht2 at 12 h after inoculation with race 1 of E. turcicum compared with that in Huangzaosi.
By inference, ZmQM protein may be involved in response of HuangzaosiHt2 to inoculation by E. turcicum race 1.
Keywords: QM gene; Ribosomal protein L10; ZmQM gene; Huangzaosi Ht2; Exserohilum turcicum
玉米大斑病(northern corn leaf blight, NCLB)是
由玉米大斑突脐蠕孢菌[Exserohilum turicicum (Pass.)
Leonard et Suggs]引起的, 是玉米上重要的叶部病
害。防治玉米大斑病最为经济、安全、有效的方法
是种植抗病品种。近年来, 随着植物分子生物学技
术的发展和应用, 农作物分子育种成为作物遗传育
种新的生长点。因此, 对抗病基因的克隆和功能的
研究十分重要。
自从 1961年 Hooker发现并鉴定出 Ht1基因后[1],
国内外许多学者在大斑病抗性基因的发掘、鉴定和
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定位方面做了大量工作。迄今, 已报道了 Ht1[1]、
Ht2[2]、Ht3[3]、HtN[4]、HtM[5]、HtP[6]、ht4[7]和 rt[6]
等 8种大斑病抗性基因, 并对 Ht1、Ht2、Ht3和 HtN
进行了连锁图定位或者原位杂交定位, 部分标记已
经应用于品种抗病基因检测。但有关大斑病抗性基
因或其抗性相关基因的克隆未见报道。
Ht2 是一个发现较早, 研究较多的大斑病抗性
基因 , 且对目前我国玉米大斑病原菌优势小种
——1号小种[8](毒力公式Ht2Ht3HtN/Ht1)具有抗性。
因此, Ht2 基因对玉米抗大斑病育种具有重要的意
义。本研究利用 cDNA-AFLP 技术分析了玉米近等
基因系黄早四和黄早四 Ht2 受玉米大斑病菌 1 号小
种侵染后的差异表达, 从黄早四 Ht2 上获得了 QM
基因的相似序列(GenBank 登录号为 U06108), 利用
5′RACE 技术获得了其全长 cDNA, 命名为 ZmQM,
GenBank 登录号为 FJ600320, 对其编码的蛋白质性
质进行了分析, 并利用RT-RCR技术分析了玉米QM
基因在黄早四和黄早四 Ht2 接种玉米大斑病菌 1 号
小种后的表达情况。
1 材料与方法
1.1 玉米种植与取样
供试玉米为黄早四(HZS)和黄早四 Ht2 (HZSHt2)
近等基因系。在(30±3)℃的温室中, 待幼苗生长至五
叶期时, 选取在 PDA平板培养基上生长 1周且产孢
好的玉米大斑菌(E. turcicum) 1号小种, 用打孔器取
直径 1 cm的菌饼分别接种于玉米第 4叶上, 在每个
叶片中脉的一侧接 3个菌饼, 分别于接种后 0、3、6、
12、24、48和 72 h取叶片中脉另一侧组织, 迅速放入
液氮中, 然后保存于−80℃冰箱中备用。
1.2 RNA的提取与双链 cDNA合成
参照 TaKaRa公司的RNAiso Reagent Kit提供的
方法提取总RNA, 参照 cDNA Synthesis Kit (TaKaRa,
中国大连)提供的方法合成双链 cDNA。
1.3 cDNA-AFLP 分析及差异条带序列相似性分
析
采用 Bachem等[9]所述的方法进行 cDNA-AFLP
分析。对差异表达条带进行回收, 并克隆到 pGM-T
(Tiangen, 中国北京)载体上 , 送北京三博有限公司
测序。获得的序列运用 Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.
gov/blast.cgi)进行相似性搜索。共发现了 86 条差异
条带, 其中编号为 45的序列与其他物种的 QM基因
具有一定的相似性, 命名为 mQM。
1.4 利用 5RACE 技术克隆 mQM 的全长 cDNA
(ZmQM)
参照 5-full RACE Kit (TaKaRa, 中国大连)提供
的方法。根据 mQM的核苷酸序列, 运用 Primer 5.0
分别设计特异性外侧引物和内侧引物及 5-full
RACE Kit 提供的 5RACE 外侧引物和内部引物(表
1)。扩增出的产物克隆到 pGM-T (Tiangen, 中国北
京)载体后送北京三博有限公司测序。
1.5 ZmQM的生物信息学分析
用 ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov
/gorf/gorf.html)对 ZmQM 的开放阅读框进行预测,
并推导出 ZmQM 氨基酸序列。利用 Clustalx 软件
(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)比较 ZmQM 和其他
物种 QM 蛋白氨基酸序列相似性, 并运用 InterPro-
Scan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)、PROSITE
(http://www.expasy.ch/prosite/)、ProtParam (http://ex-
pasy.org/tools/protparam.html)和 SOPMA (http://npsa-
pbil.ibcp.fr/)等生物信息学软件分别对 ZmQM蛋白
的结构域、功能位点、氨基酸组成、等电点、分
子量、电荷分布、亲水性和二级结构等特性进行
分析。

表 1 引物序列
Table 1 Primer sequences used in this study
引物名称 Primer 引物序列 Sequence (5–3)
特异外侧引物 Special outer primer AGGAACGACTGTTTGGTG
特异内侧引物 Special inner primer GCAAGTTCACATAAGGCAC
5RACE外侧引物 5RACE outer primer CATGGCTACATGCTGACAGCCTA
5RACE内侧引物 5RACE inner primer CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG
mzACTIN-32F GTGACAATGGCACTGGAATG
mzACTIN-741B GACCTGACCATCAGGCATCTC

1.6 RT-RCR分析
采用 RT-RCR技术分析 ZmQM基因在黄早四和
黄早四 Ht2 上的表达差异, 同时分析 ZmQM基因在
黄早四 Ht2 受病原菌处理不同时间后的表达差异,
第 8期 王会伟等: 玉米中 QM同源基因的克隆及其差异表达分析

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对照为清水处理后的黄早四和黄早四 Ht2。以
ACT3[10] (mzACTIN-32F和 mzACTIN-741B)作内参
对照, 引物序列见表 1。ZmQM 基因的扩增引物与
5 RACE获得有效扩增的引物一致。
2 结果与分析
2.1 mQM的全长 cDNA克隆与序列分析
利用 AFLP-cDNA 技术, 在接种玉米大斑病菌 1
号小种后, 与黄早四相比, 黄早四 Ht2 上共发现了 86
条差异条带(图 1), 经回收、测序及 Blast比对, 发现条
带 45 与玉米 60S 核糖体蛋白 L10-3 的 1 个 mRNA
(GenBank 登录号为 EU976434) 3末端序列相似性为
99%。因此, 采用 5 RACE 技术扩增条带 45 的全长
cDNA。利用特异性内侧引物和 5RACE内侧引物组合
获得了有效扩增, PCR产物经克隆、测序分析, 得知其
大小为 967 bp。采用 ORF Finder预测, 发现该序列从
32 位到 769 位核苷酸为一个开放阅读框, 长 738 bp,
编码 245个氨基酸(图 2)。进一步通过 Blastn比对分析,
表明该序列与小麦、水稻等物种的 QM蛋白基因序列
高度相似, 且开放阅读框范围基本一致, 因此认为克
隆到的基因具有完整的开放阅读框, 命名为 ZmQM。

图 1 用 cDNA-AFLP分析接种玉米大斑病菌 1号小种不同时间
后黄早四 Ht2和黄早四中 mQM的表达差异
Fig. 1 Differential expression of mQM analyzed by
cDNA-AFLP between HuangzaosiHt2 and Huangzaosi inocu-
lated with race 1 of Exserohilum turcicum
R: 黄早四 Ht2; S: 黄早四。R: HuangzaosiHt2; S: Huangzaosi.

图 2 ZmQM基因序列及推导的氨基酸序列
Fig. 2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of gene
ZmQM cloned from maize
* 表示起始密码子, ***表示终止密码子; 核酸序列中加下画线
的碱基分别代表 5′和 3′端的非转录区域
Start and stop codons are indicated by single- and triple-asterisk,
respectively. Nucleotides sequences with underline represent the 5′
and 3′ untranslated regions.

应用 InterProScan搜索发现, ZmQM编码的多肽
中含有一个典型的 L10 结构域。根据 Farmer 等[11]
描述的 L10结构域特点, 对 ZmQM编码的多肽进行
结构分析, 证明在这个多肽中: 从 26位氨基酸至 56
位氨基酸为第 1个碱性氨基酸区域 B1, 173位到 197
位为第 2 个碱性氨基酸区域 B2, 59 位到 69 位含有
11个带电荷的氨基酸区域 C, 80位到 93位为 1个保
守的酸性氨基酸区域 A, 173位到 197位为 B1区域,
从 127 位氨基酸至 147 位氨基酸为富含甘氨酸和丙
氨酸区域 G/A, G/A 区域具有结合核苷酸的功能(图
3)。从 GenBank 中搜索了其他 13个物种中的 L10
结构域的序列 , 经过序列比对 , 发现这些序列与
ZmQM 的氨基酸序列相似性最高的为水稻(Oryza
sativa ssp. indica cultivar-group, 92%), 最低的为玉
蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis, 66%)(图 2)。
通过 ProtParam 软件分析, 预测 ZmQM 基因编
码的多肽分子量为 27.78 kD, 等电点为 10.69, 其氨
基酸组成为 Asp 和 Glu 酸性氨基酸残基数比例为
19%、碱性氨基酸 Arg 和 Lvs 残基数比例为 54%的
特点, 表明 ZmQM 蛋白为碱性蛋白质。同时, 对多
肽的疏水 /亲水性分析结果显示 , 其疏水性平均值
(average of hydropathicity)为–0.606。与其他已知蛋
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图 3 ZmQM与其他物种的 13个 QM基因的氨基酸序列同源性比较
Fig. 3 Alignment of deduced amino acid sequences of ZmQM gene from Zea mays with 13 QM genes from other species
*表示完全一致的序列, B1和 B2为碱性氨基酸区域, C为带电荷的氨基酸区域, A为酸性氨基酸区域, G/A为富含甘氨酸和丙氨酸区域。
Identical residues between sequences are indicated with an asterisk. B1 and B2 represent basic domains. A: acidic domain; C: charged cluster;
G/A: glycine alanine loop. Branchiostoma floridae: XP_002202219; Homo sapiens: AAB27665; Oryza sativa: CAA57339; Caragana jubata:
AAT74554; Camellia sinensis: AAT68777; Populus trichocarpa: ABK92819; Solanum melongena: P93847; Elaeis guineensis: ACF06451;
Arabidopsis thaliana: NP_563945; Physcomitrella patens: XP_001782980; Triticum aestivum: AAP80617; Chlamydomonas reinhardtii:
XP_001694428; Ustilago maydis: XP_759469.
第 8期 王会伟等: 玉米中 QM同源基因的克隆及其差异表达分析

1443


白比较, ZmQM可能是一种可溶性蛋白。
通过搜索 PROSITE 数据库, 获得的 ZmQM 多
肽序列中包含 4个蛋白酶 C磷酸化位点 TRR (3~5)、
SFR (9~11)、SVR (162~164)和 SRK (193~195), 1个
N-糖基化位点 NVSS (84~87), 1个酪蛋白激酶 II磷
酸化位点 SRAD (202~205), 1 个酪氨酸激酶磷酸化
位点 RKGVDEFPY (65~73), 1 个 N-酰基化位点
GMRGAF (139~144), 1 个酰胺化位点 MGRR (26~
29), 此外还存在 1 个核糖体蛋白 L10 特征序列
RGAFGKPQGTCARV (141~154)。运用 SOPMA 预
测 ZmQM蛋白的二级结构, 发现它存在 7个 α螺旋,
含 11个 β折叠和 10个 β转角。
2.2 玉米中 ZmQM的差异表达分析
采用 RT-PCR 方法, 分析了 ZmQM 基因在黄早
四和黄早四 Ht2 接种玉米大斑病菌 1 号小种后的表
达水平。与清水处理后的黄早四和黄早四 Ht2 及玉
米大斑菌处理后的黄早四相比, ZmQM 基因在接种
玉米大斑菌 12 h后的黄早四 Ht2中表达量明显上调
(图 4-A), 且在接种病原菌 12~24 h 达到高峰, 48 h
出现下降趋势, 72 h 后回复到与未接种对照植株基
本一致的表达水平(图 4-B)。据此推测, ZmQM基因
在黄早四 Ht2 抗玉米大斑病菌 1 号小种过程中发挥
重要作用, 并且在接种后 12~24 h之间作用最强。

图 4 用 RT-PCR分析 ZmQM基因的差异表达
Fig. 4 RT-PCR analysis of differential expression of gene
ZmQM in maize
HZS: Huangzaosi; HZSHt2: HuangzaosiHt2. A: differential ex-
pression of gene ZmQM in HZS and HZSHt2;
B: differential expression of gene ZmQM in HZSHt2 at different
times after inoculation with race 1 of E. turcicum.
3 讨论
自 1991年 QM/RPL10基因报道以来, 已经从人
类和许多动植物中克隆到了 QM/RPL10 基因, 并对
其生物学性质与功能进行了研究, 发现 QM 蛋白具
有核糖体蛋白以外的许多功能, 如参与细胞生长、
分化、发育和凋亡等基本生命活动[12-13]。在植物中,
Rivera等[14]首次从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中克
隆了 QM 基因, 迄今已从多种植物中克隆了 QM 基
因 , 但其功能仍在研究之中。在酵母 (Saccharomy
cescerevisiae)中过量表达番茄 (Lycopersicon escu-
lentum)的类 QM 蛋白, 可以调节细胞间脯氨酸的含
量, 从而保护酵母细胞免受由过氧化氢、除草剂百
草枯(Paraquat)和高温引起的活性氧积累而造成的
伤害[15]。茶树(Camellia sinensis)中 QM基因的转录
水平在受到干旱胁迫和脱落酸处理后下调, 但受到
赤霉素处理后上调, 表明 QM 基因对茶树的生长起
促进作用 [16]。Rocha 等 [17]认为 QM 蛋白作为由
NIK(核穿梭蛋白互作激酶)介导的抗病毒信号途径
下游的效应器发挥作用, 当 QM 基因缺失或突变后,
寄主植物对菜豆金色花叶病毒属病毒的抗性明显减
弱。ZmQM 作为一种类 QM 基因, 在玉米中可能参
与黄早四Ht2对玉米大斑病菌 1号小种的抗性反应。
综上所述, QM基因在植物的抗逆反应中可能担负着
重要的功能, 即 QM 基因可能是一类新的抗逆相关
基因。
本研究中发现 , ZmQM 蛋白比玉米中已克隆
QM 蛋白(GenBank 登录号为 NP_001105355)和大多
数其他物种的 QM 蛋白 N 端多出了 25 个氨基酸残
基, 这使 ZmQM蛋白(不稳定系数 II = 44.61>40)与
其他 QM蛋白相比较稳定性降低。另外, 在 25个氨
基酸残基中还存在 2 个蛋白酶 C 磷酸化位点 TRR
(3~5)、SFR (9~11), 但这 25个氨基酸残基的存在是
否赋予了 ZmQM 蛋白的其他功能还有待进一步研
究。
RT-PCR分析表明, 在接种玉米大斑病菌 1号小
种 12 h后, 黄早四 Ht2中 ZmQM基因表达量比黄早
四明显上调。由于玉米大斑病菌 1号小种对具有 Ht1
基因和不含任何 Ht 基因的玉米(如黄早四)具有毒力,
侵染后在叶片上形成典型的病斑, 并产生大量的分
生孢子, 但对具有 Ht2 基因的玉米无毒力, 只引起
褪绿坏死斑[18]。因此, ZmQM 基因可能与 Ht2 基因
调控的抗性表达密切相关, 即 ZmQM 基因可能通过
自身的表达量来调控 Ht2 基因的表达, 或 ZmQM 基
因的表达量受 Ht2 基因的反调控。ZmQM 基因在由
Ht2 介导抗病反应中的位置及与其他 Ht2 相关基因
的关系还有待进一步深入研究。
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4 结论
从玉米自交系黄早四 Ht2 中分离和克隆了 QM
同源基因, 命名为 ZmQM, 其 cDNA全长 967 bp, 开
放阅读框为 738 bp, 编码 245 个氨基酸, 比大多数
的 QM 蛋白 N 端多 25 个氨基酸残基。ZmQM 基因
在接种后的黄早四 Ht2 中表达量上调, 而上调时间
出现在接菌后 12~24 h。推测 ZmQM 基因在黄早四
Ht2抗玉米大斑病菌 1号小种过程中发挥重要作用。
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