全 文 ：利用实时荧光 PCR技术检测风信子黄腐病菌
邵秀玲 1　甘琴华 1　赵文军2　厉 艳1　王英超 1　庞国兴 3
(1.山东出入境检验检疫局　青岛　266002　2.中国检验检疫科学研究院　北京　3.青岛出入境检验检疫局)
基金项目:国家质检总局植物病原检测基金资助(2005IK066)。
收稿日期:2009-02-23, 2009-05-31修回
DetectionandidentificationofXanthomonashyacinthibyreal-timefluorescentPCR.ShaoXiuling1 , Gan
Qinhua1 , ZhaoWenjun2 , LiYan1 , WangYingchao1 , PangGuoxing3(1.ShandongEntry-ExitInspectionandQuar-
antineBureau, Qingdao266002 China;2.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine, Beijing100029, China;
3.QingdaoEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau, Qingdao266002, China)
Abstract　Onepairofspecificprimersandoneprobewithspecificstablesite-mutationweredesignedbasedon
theconservedsequenceofgenomeDNAofXanthomonashyacinthi.TaqManreal-timefluorescentPCRmethod
wasestablishedfordetectionforthisbacterium.IncludingXanthomonashyacinthi, othersevenplantpathogen
bacteriaweredetected.Inresult, onlyXanthomonashyacinthicouldbedetected.ComparedwithroutinePCR.
Real-timefluorescentPCRwasmorespecificandsensitive.Thismethodwassuitabletoquickdiagnosisofdisea-
sesandportquarantine.
Keywords　Xanthomonashyacinthi, TaqManprobe, real-timefluorescentPCR, detection
摘要　风信子黄腐病菌是我国禁止入境的病原细菌之一 ,我国目前尚无该病的发病报道。本研究根
据风信子黄腐病菌基因组 16S-23SribosomalRNAintergenicspacer保守序列 ,设计并合成了 1对特异性引
物和 1条具有稳定点突变特异性探针进行实时荧光 PCR检测 ,风信子黄腐病菌有很强的荧光信号 ,供试的
其它 7种病原细菌菌株均没有荧光产生 。与常规 PCR相比 ,实时荧光 PCR检测特异性强 ,灵敏度高 ,适合
病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。经优化反应条件 ,建立了稳定的风信子黄腐病菌实时荧光 PCR检
测方法。
关键词　风信子黄腐病菌　TaqMan探针　实时荧光 PCR　检测
中图分类号　S432.42;S435.111.49
　　风信子黄腐病菌 (Xanthomonashyacinthi
(Wakker)Vauterinetal)是各国限制入境的有害生
物之一 ,也是我国进境检疫性有害细菌之一。该菌
是风信子上最重要的病害 ,病菌存活于鳞球茎内 ,
并可从球茎传播至叶片 ,早春病害可通过风雨在农
田内传播 ,另外 ,农机具的耕作刀具的使用都可以
导致病菌从病株传播到健康植株上。风信子黄腐
病菌的寄主范围较广 ,主要危害百合科风信子属
(Hyacinthus)、蔓穗草 (Scilasp.)、葡萄风信子
(Muscaribotryoides)、条纹海葱 (Puschkiniascil-
loides)等 ,接种寄主有聚铃花(S.hispanica)、亚美尼
亚麝香兰 (Muscariarmeniacun)等 [ 1] 。风信子黄腐
病菌在田间的传播速度相当快 ,引起严重的经济损
失。 1997年新西兰报道由此病造成的风信子种球
损失达到 71万株 。农田种植方法及储藏时的特殊
处理可相当程度地减少病菌的传播 ,热处理可以杀
死球茎内的细菌 ,早春喷洒药物对预防细菌的发生
有较好的效果[ 2] 。据报道 ,风信子黄腐病最早发生
在荷兰 ,其他发生地有日本 、瑞典 、丹麦 、德国等 ,以
荷兰发生比较严重 ,我国到目前为止尚未发现 。
随着大量观赏植物的引进及种植 ,该病害传人
我国的风险日渐加大。本文应用实时荧光 PCR方
法检测风信子黄腐病菌 ,目的是建立快速 、灵敏的
检测方法 ,对风信子的球茎或叶片是否感染该病进
行检测 ,并可用于田间病害监测 。
1　材料和方法
1.1　供试材料
将标准菌株在 523培养基上复壮培养 2 ～ 3d,
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用无菌水制成浓度为 108 ～ 109cfu/mL的菌悬液备
用 ,实验参试菌株及样品见表 1。
表 1　供试材料
病菌或样品 菌株来源 菌株代号
风信子黄腐病菌X.hyacinthi ATCC12612 Xh
水稻白叶枯病菌X.oryzaepv.oryzae 南京农大 Xo
甘蓝黑腐病菌 X.campestrispv.campestris 南京农大 Xcc
柑橘溃疡病菌X.axonopodispv.citri 华中农大 Xa
密执安棒形杆菌诡谲亚种
Clavibactermichiganensissubsp.insidisus
CGMCC1.1908 X1
番茄溃疡病菌
C.michiganensissubsp.michiganensis
CGMCC1.1909 X2
方氏棒形细菌C.fangi CGMCC1.2000 X3
甜菜叶斑病病原细菌 Curtobacterium
flaccumfacienspv.beticola
CGMCC1.2354 X4
　注:ATCC:美国典型微生物菌种保藏中心;CGMCC:中国普通微
生物菌种保藏管理中心。
1.2　特异性引物和探针的设计
引物 FP:5 -TCACCTCCTTTTGAGCAT
GACA-3 , RP:5 -AACTCTCTGAATGCA
GGTGACTTG-3 ,由风信子黄腐病菌基因的保守
序列获得 [ 2] ,预期 PCR产物为 69bp。在引物对扩
增片段区间找出风信子黄腐病菌稳定性点突变区 ,
应用引物和探针设计软件 PrimerExpres设计风信
子黄腐病菌特异探针:5 -CTACGCCTGTCAG-
GCGTCCTC-3 。探针采用化学合成标记方法 , 5
端标记荧光染料为 Carboxyfluorescein(FAM), 3端
标记淬灭荧光染料为 Tetramethy-carbo-xyrho-
damine(TAMRA)。引物和探针合成分别由英骏生
物公司和大连宝生物有限公司完成 。
1.3　风信子黄腐病菌及对照菌基因组 DNA提取
将风信子黄腐病菌及对照菌制成菌悬液 ,参考
天根生物公司细菌基因组 DNA提取试剂盒方法进
行。用 Eppendof紫外分光光度计测定 DNA的浓
度和纯度 。
1.4　阳性样品基因组 DNA提取
挑取叶长 10 ～ 15 cm的健康的风信子种球 ,用
Xh菌悬液进行接种 , 8 ～ 12d后观察。挑取接种发
病的风信子组织作为阳性样品 ,阳性样品基因组
DNA的提取参考 SAAS-SCIQ-CBSR植物基因组
DNA提取试剂盒方法进行。
1.5　扩增条件
PCR体系为 25 μL:其中 2倍 PCRMasterMix
12.5 μL, 引物 (10 μmol/L)各 1 μL, 探针 (10
μmol/L)1 μL,模板 1 μL, ddH2O8.5 μL。 PCR反
应的参数为:94 ℃, 3 min;30 ～ 40个循环;94 ℃,
15s;62 ℃, 30s;72℃, 30 s;最后 72℃延伸 5min。
1.6　Real-TimePCR检测
将样品在 ABIPRISM7900上扩增 ,反应结束
后 ,打开分析软件 ,仪器自动给出每个样品的 Ct
值 。记录 Ct值 ,分析检测结果。
2　结果与分析
2.1　风信子黄腐病菌 Real-TimePCR检测的特
异性
利用引物 FP和 RP及探针 ,对 8个供试菌株进
行实时荧光 PCR检测 ,其中 Xh设置 3次重复 ,设
置 7种阴性对照菌株 ,只有风信子黄腐病菌有强的
荧光信号增加 ,曲线呈平滑 S型 , Ct值为 17 ～ 19,
表现为阳性扩增 ,而其它细菌及水对照均没有荧光
信号均匀增加的 S型曲线 ,表现为阴性 。图 1说明
探针对风信子黄腐病菌有很强的特异性 ,可以把风
信子黄腐病菌与其它细菌菌株分开。
图 1　实时荧光 PCR的特异性扩增
1～ 3:Xh;4～ 11:Xo、Xcc、Xa、X1、X2、X3、X4、ddH2O
将图 1的 PCR扩增产物作电泳观察(图 2),水
稻白叶枯病菌(Xo)、柑橘溃疡病菌(Xa),番茄溃疡
病菌(X2)3种在 69bp左右位置也有扩增带 ,而其
它 4种阴性对照菌株与水对照无扩增条带 ,这说明
探针对风信子黄腐病菌有很强的特异性 ,尽管加入
的引物能把非特异性模板扩增出来 ,但探针能与风
信子黄腐病菌的模板特异性地完全结合 ,在实时荧
光 PCR仪上有荧光增强信号。
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图 2　实时荧光 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
1:Xh;2 ～ 9:Xo、Xcc、Xa、X1、X2、X3、X4、ddH2O
2.2　风信子黄腐病菌 Real-TimePCR检测的灵
敏度
将已测定浓度的风信子黄腐病菌 DNA连续稀
释成 0.1μg/μL、10 ng/μL、1ng/μL、0.1 ng/μL、10
pg/μL、 1 pg/μL、 0.1pg/μL、 10 fg/μL、 1fg/μL、
0.1fg/μL,分别加入到含有引物和探针的反应体系
中 ,在退火温度 62℃条件下扩增 。
图 3　实时荧光 PCR灵敏度检测
　　1:0.1 μg/μL;2:10 ng/μL;3:1 ng/μL;4:
0.1 ng/μL;5:10 pg/μL;6:1 pg/μL;7:0.1 pg/
μL;8:10 fg/μL;9:1 fg/μL;10:0.1 fg/μL;
11:ddH2O
结果表明(图 3),在 DNA含量 0.1 ng/μL时 ,
实时荧光 PCR仍可检测到风信子黄腐病菌 ,其稀
释限点应为 0.1 ng/μL。模板浓度与■Rn有一定
的线性关系 ,在一定的浓度范围内 ,模板浓度越高 ,
荧光信号越强 。
2.3　风信子黄腐病菌阳性样品的 Real-TimePCR
检测
挑取发病的风信子组织作为阳性样品 ,用 Bc
标准菌株做阳性对照 ,健康的香石竹叶片做阴性对
照 ,分别提取阳性样品 、阴性样品的植物基因组
DNA,提取 Xh标准菌株的细菌基因组 DNA, ddH2O
做空白对照 ,进行实时荧光 PCR检测 ,验证检测体
系的重复性 、稳定性与特异性 ,结果见图 4。
图 4　实时荧光 PCR检测样品
1:阳性样品;2:阳性对照;3:阴性样品;4:空白对照
结果表明 ,阳性样品和阳性对照表现出明显的
荧光信号 ,阴性样品和空白对照均没有荧光信号 。
实时荧光 PCR方法能够对感染病菌的植物组织直
接进行检测 ,而不需要进行植物病原细菌的分离纯
化 ,简化了步骤 ,适合于风信子黄腐病菌的快速检
测鉴定 ,同时进一步证明了该方法提供的引物 、探
针特异性强 ,重复性 、稳定性好 。
3　讨论
本研究成功地设计并且合成风信子黄腐病菌
实时荧光 PCR引物和探针 ,在国内首次建立了风
信子黄腐病菌的实时荧光 PCR检测体系 。用 ABI
Prism7900扩增仪检测 ,整个检测过程只需 2 h,无
需 PCR后处理和分析 ,大大地简化检测鉴定步骤 ,
提高检测速度 ,也降低污染 [ 3] 。本研究建立的检测
风信子黄腐病菌的 TaqMan探针实时荧光 PCR方
法 ,具有快速 、简便且特异 、灵敏的特点 ,为口岸快
速检测风信子黄腐病菌奠定了基础。
参考文献
1　李怀方 , 刘风权 ,郭小密.园艺植物病理学.北京:中国农业大学
出版社 , 2001.
2　VanDoomJ, HolingerTC, OudegaB.AnalysisofthetypeIVfim-
brial-subunitgenefimAofXanthomonashyacinthi:applicationin
PCR-mediateddetectionofyelowdiseaseinhyacinthis.ApplEnvi-
ronMicrobiol, 2001, 67(2):598～ 607.
3　张驰宇 ,张高红 ,杨敏.四步法消除 SYBRGreenI实时定量 RT
-PCR中引物二聚体的影响.中国生物化学与分子生物学报 ,
2004, 20(3):387 ～ 392.
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