全 文 ：利用实时荧光定量 PCR技术检测樱桃叶
斑驳病毒
凌 薇1，2 马云霞2 朱水芳2 高必达1*
(1．湖南农业大学生物安全科学技术学院 湖南长沙 410128;2． 中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所)
基金项目:公益性行业科研专项项目(200810632)
通讯作者:E － mail:bdgao@ yahoo． com． cn
收稿日期:2011 － 01 － 20
The quantitative detection of Cherry Mottle Leaf Virus by Real － Time PCR． Ling Wei1，2，Ma Yunxia2，Zhu
Shuifang2，Gao Bida1* (1． College of Bio － safety Science and Technology，Hunan Agricultural Unirersity，Chan-
gsha 410128，China;2． Institute of Animal and Plant Quarantine，Chinese Academy of Inspection and Quaran-
tine)
Abstract Cherry mottle leaf virus (CMLV)is one of the most important diseases on cherry in South America． In
this research，we successfully synthesized the sequences of CMLV 6741 ～ 7322 nt genes (Genbank AF170028． 1)
and constructed positive standard plasmids of this nucleic fragment on the vector pBluescript II SK (+)． Accord-
ing to the result of the real － time PCR，23 copies /μL of the plasmid was detected as the detection limit of the real
－ time PCR，and 100 times more sensitive than conventional PCR． Therefore，the FQ － PCR method provides an
important technical support for the detection and prevention of Cherry mottle leaf virus．
Key words Cherry mottle leaf virus，Real － Time PCR，TaqMan probe
摘要 樱桃叶斑驳病毒(Cherry mottle leaf virus，CMLV)是南美洲樱桃上重要的病害之一。本研究针对
Genbank上公布的该病毒的核酸序列，人工合成了 CMLV(AF170028． 1)6741 ～ 7322 nt 的核酸序列并连接
载体，构建了阳性标准质粒，进行实时荧光定量 PCR(Fluorescence quantitative，FQ － PCR)检测。实验结果
表明，本研究设计的利用 FQ － PCR检测 CMLV的引物及探针特异性良好，经灵敏度检测，最低检测浓度为
23 copies /μL，比普通 PCR检测灵敏度高 100 倍。该 FQ － PCR 检测方法为樱桃叶斑驳病毒的防控提供了
重要的技术支持。
关键词 樱桃叶斑驳病毒;荧光 PCR;TaqMan探针
中图分类号 Q7;S41
樱桃叶斑驳病毒(Cherry mottle leaf virus，CM-
LV)于 1920 年在 Oregon 被首次发现［1］，可侵染樱
桃、观赏性樱花、桃、杏等植物，危害十分严重，可通
过凹凸瘿螨(Eriophyes inaequalis)传播［2］，是樱桃上
最重要的病害之一。该病毒属于纤毛病毒属(Ge-
nus Trichovirus) ，被划分为黄化病毒群(Closterovir-
us group)第 II亚群［3］，病毒粒子为纤维状结构，大
小约为 10． 2 nm ×760 nm［4］。由于该病毒防治难度
大，根除困难，因此建立快速、准确的检测方法，对
于防治该病毒的为害和传播、保障作物的生产安全
具有重要的现实意义。
CMLV 病毒的检测方法主要基于血清学方法
和核酸技术。James D．和 Mukerji S．成功制备了特
异性较好的单克隆及多克隆抗体［5］，但血清学方法
容易出现假阳性，不利于病害的有效诊断。核酸基
础上的检测技术比血清学方法更加灵敏、快捷，
James D． 和 Jelkmann W． 建立了一种反转录 PCR
(RT － PCR)体系检测 CMLV ［6］，目前 RT － PCR 技
术已广泛应用于植物病毒的检测。FQ － PCR 技术
是在普通 PCR的基础上加入了一条 TaqMan 探针，
其 5端标记有荧光分子，3端标有淬灭基团。PCR
反应过程中，探针可与模板 DNA特异性结合，在 5
端外切酶活性的作用下将荧光分子切下，便可以检
测到荧光信号。荧光 PCR 技术提高了检测的特异
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性和灵敏度，有利于植物病毒的快速检测。
本文针对 CMLV的外壳蛋白(CP)基因片段设
计了用于 FQ － PCR 检测的引物和探针，建立了
CMLV的荧光 PCR 检测体系，提供了快速、灵敏地
检测樱桃叶斑驳病毒的方法。
1 材料与方法
1． 1 材料
MEGAscript Kit 购自 ABI 公司;Trizol 购自
Invitrogen 公司;pBluescript II SK (+)载体购自
Fermentas公司;Reverse Transcriptase XL (AMV)、
Ex Taq 酶、DNA Marker DL 2000 和 2 × Premix Ex
TaqTM (Perfect Real Time)均购自 Takara 公司;试
验所用荧光 PCR仪为 LightCycler 1． 0 Real － Time
PCR System (Roche公司) ;普通 PCR 仪为 Veriti
96 － Well Thermal Cycler(ABI公司)。
1． 2 方法
1． 2． 1 CMLV标准质粒的构建
本研究根据 Genbank 公布的 CMLV 全基因序
列(AF170028． 1) ，人工合成了该序列 6741 ～ 7322
nt的 DNA 片段，长度为 582bp。将该人工合成的
DNA片段克隆到 pBluescript II SK (+)载体上，提
取质粒，通过测序验证其片段的正确性，测定其浓
度并进行拷贝数换算，作为 CMLV 检测用阳性标准
品(拷贝数计算公式是:拷贝数 = (amount × 6． 022
× 1023)/ (length × 1 × 109 × 650) ，其中 amount 是
指 OD 所测含量，length 代表模板 DNA 的长度)。
将标准品 10 倍梯度稀释，以终浓度为 1． 17 × 108、
1． 17 × 107……1． 17 × 101 copies /μL 的 8 个质粒标
准品构建标准曲线。
1． 2． 2 引物及探针的设计与合成
根据已克隆的 CMLV DNA 片段序列，在该序
列两端设计并合成一对引物 CMLVCP － 5F /CM-
LVCP －3R，用于扩增人工合成片段的全序列。在
该片段保守区内设计 FQ － PCR 引物及探针 CMLV
－ CP － 5F /CMLV － CP － 3R /CMLV － CP － P，委托
大连宝生物技术有限公司合成(表 1)。
经 NCBI BLAST 比对，荧光 PCR 扩增片段与
CMLV (AF170028． 1)同源性为 100%，与桃树花叶
病毒(DQ117581． 1、DQ117579． 1)同源性分别为
87%和 86%，且引物及探针区域均有核苷酸差异，
与其他的生物序列均无同源性。因此可认为，本实
验设计的荧光 PCR的引物及探针特异性较好。
表 1 探针及引物序列
引物 /探针 序列 扩增片段
CMLV － CP － 5F 5 － CAAGGGACGTCGGACTCAACG －3 111 bp
CMLV － CP － 3R 5 － TATCAACCCAACAATCGTCCTCG － 3
CMLV － CP － P 5(FAM)－ TCCGACGGGTGCGGAAGCGTTAGTG(TAMRA)－ 3
CMLVCP － 5F 5 － CCATCGATATGTCGGCGCGATTGAATC － 3 582 bp
CMLVCP － 3R 5 － GTGTCGACCTAAACACAGAGATTTGTCG －3
1． 2． 3 普通 PCR的灵敏度检测
以标准质粒各浓度梯度:1． 17 × 108 ～ 1． 17 ×
101 copies /μL为模板，进行普通 PCR 灵敏度检测。
普通 PCR反应体系为:10 × Buffer 2． 5 μL，dNTP 0． 5
μL，10 μmol /L引物各 0． 5μL，Ex TaqTM 0． 3 μL，质粒
模板 2 μL，反应程序为:94 ℃预变性 3 min;然后
94℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，33
个循环;72 ℃后延伸 10 min。扩增产物经 1%的琼
脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察及分析结果。
1． 2． 4 FQ － PCR灵敏度检测
用同 1． 2． 3 相同的各个梯度作为模板，进行
FQ － PCR灵敏度检测。FQ － PCR反应体系为:2 ×
Premix Ex TaqTM 10 μL，10 μmol /L引物及探针各 1
μL，质粒模板 2 μL，加 ddH2O 至总体积为 20 μL。
反应程序为:92 ℃ 3 min;然后 92 ℃ 5 s，60 ℃ 30
s，40 个循环;降至 40 ℃结束反应。
1． 2． 5 FQ － PCR特异性检测
取接种桃树花叶病毒(Peach mosaic virus，
PMV)15d 的樱桃幼芽 0． 1 g，用 Trizol 法提取总
RNA。取 1 μL 的总 RNA 样品作为模板进行反转
录。反转录体系为:模板 RNA 2 μL，5 × Reverse
Transcriptase Buffer 2 μL，dNTP Mixture (10 mmol /L
each)1 μL，RNase Inhibitor 0． 5 μL，CMLVCP － 3R
0． 5 μL，AMV Reverse Transcriptase 1 μL，加 DEPC
水定容至 10 μL，42℃水浴 1h。
以上述反转录产物作为模板，使用 PMV 的特
异引物及探针进行 FQ － PCR 检测，验证接种的桃
树是否受 PMV 感染;然后分别以 CMLV 的质粒和
PMV的反转录产物为模板，使用本研究设计的引物
及探针进行 FQ － PCR 检测，以确认本研究设计的
引物及探针的特异性是否能够将 CMLV和 PMV 区
分开来。
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1． 2． 6 FQ － PCR检测模拟样品
将 CMLV质粒标准品用 Spe I线性化酶切后酚
仿抽提纯化，以已纯化的线性质粒作为模板进行体
外转录。体外转录体系(20 μL) :ATP 2 μL，CTP 2
μL，GTP 2 μL，UTP 2 μL，10 × Reaction Buffer 2 μL，
Enzyme Mix 2 μL，模板 8 μL，置于 37 ℃水浴 2 h。
称取健康的樱桃幼芽 0． 1 g，用 Trizol法提取植
物总 RNA，将其与上述的体外转录产物以 9:1 比例
混合，以混合样品作为田间模拟样品进行检测。即
取 1 μL模拟样品进行反转录(反转录体系同 1． 2．
5) ，将反转录产物直接用于 FQ － PCR检测，模拟田
间已感染 CMLV的樱桃植物样品的检测实验，以验
证该 FQ － PCR 检测体系在实际样品检测中的有
效性。
FQ － PCR检测体系及反应程序同 1． 2． 4。
2 结果与分析
2． 1 质粒标准品序列分析
对已制得的标准品质粒进行序列测定，经 NC-
BI BLAST 比对可知，所克隆的序列与 Genbank 公
布的 CMLV 6741 ～ 7322 nt 的序列有 100%的一致
性，证明人工合成的目的 DNA 片段已成功重组入
质粒载体中。
2． 2 普通 PCR及 FQ － PCR 的灵敏度及特异性检
测结果
以制备的标准品作为模板，进行普通 PCR检测，
结果表明可检测的标准品最低浓度为 1． 17 × 103
copies /μL，最低可检测 2340个 CMLV拷贝(图 1)。
图 1 以质粒为模板进行普通 PCR 扩增的灵敏度
检测图
M． DNA Marker DL 2000;1 ～ 8． 1． 17 × 108 ～ 1． 17 × 101 copies /μL
同样以制备的标准品作为模板，进行 FQ －
PCR检测，结果 FQ － PCR最低可检测至 1． 17 × 101
copies /μL的标准品浓度，即建立的实时荧光检测
方法在 40 个循环内检测极限为 23 个拷贝，比普通
PCR高约 100 倍(图 2)。
利用 PMV的特异探针、引物进行 FQ － PCR检
图 2 以标准质粒为模板进行 FQ － PCR 扩增的灵
敏度检测图
测 PMV 接种叶提取物，检测出浓度为 5． 43 × 106
copies /μL(图 3) ，但使用本研究设计的探针和引物
的检测结果却只有 3． 92 × 102 copies /μL，且能把
CMLV和 PMV 区分开(图 4) ，由此证明，本研究设
计的探针和引物的特异性良好。
图 3 利用 PMV特异性引物探针检测曲线图
图 4 本研究设计的引物探针特异性检测结果曲线图
2． 3 FQ － PCR标准曲线的构建
根据质粒标准品各梯度 1． 17 × 108 ～ 1． 17 ×
101copies /μL的 FQ － PCR 检测结果构建标准曲
线，x 轴为各梯度初始浓度的 log 值，y 轴为 FQ －
PCR反应的 Ct 值(图 5)。标准曲线的斜率为 －
3． 1379(－ 3 ～ － 3． 5 之间) ，扩增效率(En)为
1． 082977(0． 9 ～ 1． 2 之间) ，拷贝数对数与 Ct 值之
间的相关系数(R2)为 0． 9991(＞ 0． 99) ，因此该灵
敏度检测反应能够满足实验的可信度要求。
2． 4 FQ － PCR检测模拟样品
以初始浓度约为 1． 17 × 1010 copies /μL 的标准
质粒作为阳性对照，所制备的模拟田间样品的反转
录产物作为待检样品，设置空白对照，进行 FQ －
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PCR检测。由扩增曲线可知，阳性样品与待检样品
均有荧光信号，空白对照没有荧光信号(图 6) ，所
建立的 FQ － PCR方法可成功检测阳性样品及待检
样品，由此可证明该方法可检测实际 CLMV 侵染发
病的樱桃植株，而不受其体内抑制物质的影响或影
响较小。
图 5 FQ － PCR灵敏度检测标准曲线图
图 6 模拟田间发病样品的 RNA检测图片
3 讨论
本研究中根据 Genbank 登录的樱桃叶斑驳病
毒序列，人工合成了 CLMV 6741 ～ 7322 nt 的序
列，并构建了 CLMV 标准质粒。设计了 FQ － PCR
检测用引物及探针，用 CMLV质粒标准品进行灵敏
度检测时，最低可检测 23 个拷贝，达到了对模拟
CLMV引起发病的樱桃样品的精确检测，并且对
FQ － PCR反应进行了可靠性分析，表明所建立的
CLMV检测体系可用于该病毒的定量检测。
樱桃叶斑驳病毒与桃树花叶病毒(Peach mosa-
ic virus，PMV)十分相似，二者有相似的形状和大
小，很难从形态学上加以辨别，且这 2 种病毒有一
些相同的寄主［7，8］，因此需要一个准确的检测方法
将它们进行区分。特异性实验结果证明本研究设
计的引物及探针能够成功将该 2 种病毒区分开来。
本实验建立了一个高效、准确检测 CMLV 的
FQ － PCR体系，构建的标准曲线可用于该病毒的
定量检测。由于病毒毒源的限制，我们成功构建了
CMLV标准质粒进行 FQ － PCR 检测，根据先前报
道，该方法可以代替 CMLV 标准菌株进行 FQ －
PCR检测研究［9，10］。尽管此方法还有待在实际样
品检测中加以验证与应用，但为准确、灵敏、快捷地
检测 CLMV提供了可能，有助于防止 CMLV传播扩
散，为防治樱桃叶斑驳病毒提供重要的基础和技术
支持。
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