全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(1): 1−10 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30270827, 30871519), 教育部高等学校创新引智计划(111计划)项目(B08025)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 陈佩度, E-mail: pdchen@njau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: cyping180@163.com
Received(收稿日期): 2008-06-26; Accepted(接受日期): 2008-09-01.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00001
基于 EST-PCR的簇毛麦染色体特异分子标记筛选及应用
曹亚萍 1,2 曹爱忠 1 王秀娥 1 陈佩度 1,*
1南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095; 2 山西省农业科学院小麦研究所, 山西临汾 041000
摘 要: 为定位、转移和利用簇毛麦有益基因, 通过花粉辐射, 获得一批包括小麦-簇毛麦易位染色体的异染色体系。
为了鉴定这批材料中的簇毛麦染色体身份, 根据水稻、小麦的 EST序列合成了 240对 STS引物, 其中 34对引物在普
通小麦中国春与簇毛麦间存在多态性; 进一步对亲本及簇毛麦二体异附加系进行 PCR 扩增分析, 标记 CINAU32-300
可追踪簇毛麦 1V 染色体, 标记 CINAU33-280、CINAU34-510、CINAU35-1100、CINAU36-380和 CINAU37-400可追踪簇
毛麦 2V染色体, 标记 CINAU38-250可追踪簇毛麦 3V染色体, 标记 CINAU39-950和 CINAU40-800可追踪簇毛麦 4V染
色体, 标记 CINAU41-745和 CINAU42-1050可追踪簇毛麦 5V 染色体, 标记 CINAU44-765和 CINAU45-495可追踪簇毛麦
7V 染色体。加上本室已开发的 2 个 6V 染色体特异标记, 用这些簇毛麦特异分子标记鉴定辐射诱导材料的部分回交
后代, 选育出小麦背景中只包含单条簇毛麦染色体的整套 1V至 7V染色体系, 同时有 18条易位染色体的簇毛麦身份
得到确定, 表明这些标记可以用来快速检测普通小麦背景中的簇毛麦染色体或染色体片段。
关键词: 小麦; 簇毛麦; EST-STS标记; 小麦-簇毛麦异染色体系; 小麦-簇毛麦易位染色体
Screening and Application of EST-based PCR Markers Specific to Indi-
vidual Chromosomes of Haynaldia villosa
CAO Ya-Ping1,2, CAO Ai-Zhong1, WANG Xiu-E1, and CHEN Pei-Du1,*
1 National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Cytogenetics Institute, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095,
China; 2 Wheat Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Linfen 041000, China
Abstract: To localize, transfer, and use interested genes of Haynaldia villosa, a series of wheat-H. villosa alien chromosome lines
including translocation lines induced by irradiation have been developed. To identify H. villosa chromosomes or chromosome
segments in these materials, 240 STS primer pairs were designed based on EST sequences of rice and wheat, and 34 of them could
amplify specific polymorphic bands between common wheat cv. Chinese Spring and H. villosa. These 34 STS primer pairs were
further used for screening markers specific to individual chromosomes of H. villosa using 1V to 7V disomic additional lines and
their parents. The results showed that the marker CINAU32-300 could be used to trace chromosome 1V, CINAU33-280,
CINAU34-510, CINAU35-1100, CINAU36-380 and CINAU37-400 to 2V, CINAU38-250 to 3V, CINAU39-950 and CINAU40-800 to 4V,
CINAU41-745 and CINAU42-1050 to 5V, CINAU44-765 and CINAU45-495 to 7V. These EST-STS markers combined with the two 6V
specific markers previously in our institute were used to identify the H. villosa chromosome and chromosome segments of back-
crossed generations derived from pollen irradiation. A set of 1V to 7V addition lines and 18 translocation chromosomes involved
in different H. villosa chromosomes were identified. Therefore, these chromosome-specific EST-STS markers could be used to
detect chromosomes and chromosome segments of H. villosa in common wheat background.
Keywords: Wheat; Haynaldia villosa; EST-STS marker; Wheat-H. villosa alien chromosome line; Wheat-H. villosa translocation
chromosome
簇毛麦(Haynaldia villosa, 又名 Dasypyrum villo-
sum, 2n = 14, VV)属小麦族簇毛麦属, 是小麦的一个
野生近缘种, 它不但抗小麦白粉病、锈病、全蚀病、
眼斑病及梭条花叶病毒病等[1-3], 而且还具有分蘖力
强、抗寒耐旱、密穗多花、籽粒蛋白质含量高等特
点[4-5]。簇毛麦抗白粉病基因 Pm21 已被成功转移到
小麦背景中, 并广泛应用于小麦育种。为了进一步
转移和利用簇毛麦其他优良基因, 以硬粒小麦-簇毛
2 作 物 学 报 第 35卷

麦双倍体 [6]为基础材料, 利用花粉辐射与有性杂交
相结合, 创造出大量的小麦-簇毛麦属间染色体易位[7],
对这些材料用中国春连续回交, 已得到普通小麦背
景中只包含单条簇毛麦染色体或单条小麦-簇毛麦
易位染色体的一些单株。早期准确鉴定这批单株簇
毛麦的染色质, 对于簇毛麦有益基因的定位及有目
标地创造遗传种质, 进而应用于育种研究, 都具有
重要的现实意义和应用价值。
有关簇毛麦特异标记已有一些报道, 但大多集
中于 6V染色体的短臂[8-13], 分布于 1V至 7V染色体
的仅有几对 SSR 标记[14-15], 利用这些标记来鉴定大
量的簇毛麦结构变异染色体是远远不够的; 而利用
普通小麦 7个部分同源群上的 EST序列开发簇毛麦
染色体特异 STS标记的研究更少[16]。EST是在人类
基因组计划实施过程中 , 由美国国立卫生研究院
Venter提出的发现基因的新战略, 其基本实验方法是
将mRNA反转录成 cDNA并克隆到载体构建成 cDNA
文库后, 大规模随机挑选 cDNA 克隆, 对其 3′或 5′
端进行一步法测序所获得的短的 cDNA 部分序列,
一般长度为 150~500 bp, 代表一个完整基因的一部
分。由于 EST来自转录区, 其保守性较高, 在家族和
种属间的通用性比来源于非表达序列的标记(如 SSR
标记)更高 , 特别适用于远缘物种间比较基因组研
究, 另外还具有开发简单、快捷、费用低等特点, 尤
其是以 PCR为基础的 EST-STS标记。本研究为了鉴
定花粉辐射得到的部分易位染色体中的簇毛麦染色
体片段, 基于作物的共线性关系, 利用水稻、小麦的
EST 序列合成 STS 引物, 筛选能准确鉴定簇毛麦各
条染色体的特异标记, 为簇毛麦的进一步研究和利
用提供更便捷有效的工具。
1 材料与方法
1.1 植物材料
普通小麦中国春(Triticum aestivum cv. Chinese
Spring, CS)、簇毛麦(H. villosa, 由南京植物园从英
国剑桥植物园引进)、硬粒小麦(T. durum, 由中国农
业科学院引种组从国际玉米小麦改良中心引进, 编
号“中引 1286”)、硬粒小麦-簇毛麦双倍体(T. durum-H.
villosa amphiploid, 由南京农业大学细胞遗传研究
所选育)和小麦-簇毛麦整套二体异附加系 DA1V至
DA7V(引自美国堪萨斯州立大学小麦遗传资源中
心), 均由南京农业大学细胞遗传研究所保存。
将 60Co-γ射线照射的硬粒小麦-簇毛麦双倍体花
粉, 授给已去雄的普通小麦品种中国春, 在 M1代检
测到大量的小麦—簇毛麦属间染色体易位。用中国
春作父本对这批材料连续回交, 结合簇毛麦基因组
原位杂交(genomic in situ hybridization, GISH)鉴定,
在各回交世代中选出在普通小麦背景中含单条簇毛
麦染色体的材料 22份, 以及含单条小麦—簇毛麦易
位染色体的材料 23份, 用本研究筛选出的分子标记
对其所含簇毛麦染色体或染色体片段的身份加以鉴
定。
1.2 引物
为筛选簇毛麦 1V至 7V各条染色体的 EST-STS
特异标记, 根据 EST 序列或 cDNA 克隆设计的引物
共 240对, 其中选用已定位于小麦 7个部分同源群的
EST序列 75个, 以及尚未定位的 cDNA序列 113个,
用 Primer 5.0软件设计引物 188对; 另选用部分已发
表的小麦 EST-STS引物 28对[18], 以及根据小麦与水
稻比较基因组学研究结果, 与小麦第 1至 7部分同源
群相对应的水稻 EST 序列设计的引物 24 对[17]。此
外, 本研究所还开发了分别位于 6V 染色体长臂和短
臂靠近顶端的 2个 EST-STS引物 6S-19和 6L-4(别同
德, 私人通讯)。以上引物均由上海英骏生物公司合
成。
1.3 基因组 DNA提取
参照 Sharp等[19]的方法, 用 1×TE溶解, 4℃保存
备用。
1.4 PCR和酶切反应
PCR体积为 10 μL, 包含约 10~20 ng模板 DNA,
1×buffer, 1.5 mmol L−1 MgCl2, 200 mmol L−1 dNTP,
左右引物终浓度各为 0.2 μmol L−1, 0.5 U Taq DNA
聚合酶(以上试剂均来自 Promega 公司)。PCR 程序
为 94℃变性 3 min; 94 30 s℃ 、55~58 (℃ 依引物而定)
40 s、72 1 min, 33℃ 个循环; 72℃延伸 10 min。
对在亲本间未扩增出多态的部分引物, 其 PCR
产物用 Hae III酶切。酶切反应在 20 μL体系中进行,
含 ddH2O 9.8 μL, PCR产物 8 μL, Hae III内切酶 3 U,
10×buffer 2 μL, 37℃酶切过夜。
1.5 产物检测
参照 Tixier 等 [20]的方法检测产物 , 其中所用
Marker 为 DL2000(Promega)。PCR 扩增产物或酶切
产物中加入聚丙烯酰胺凝胶电泳专用的 Loading
buffer 2 μL, 混匀, 取 3 μL样液用 8%聚丙烯酰胺凝
胶(39∶1)电泳检测结果。电泳时总电压为 180 V, 电泳
1.5 h左右, 银染后将胶放在凝胶成像仪上观察照相。
第 1期 曹亚萍等: 基于 EST-PCR的簇毛麦染色体特异分子标记筛选及应用 3


2 结果与分析
2.1 簇毛麦染色体特异分子标记的筛选
在检测的 240对引物中, 有 34对可以在中国春
与簇毛麦间扩增出多态性条带, 占总引物的 14.2%。
用这 34 对引物对亲本及普通小麦-簇毛麦 1V 至 7V
二体异附加系进行扩增分析, 筛选到簇毛麦多态条
带只出现在 1个异附加系中并且带纹稳定清晰的引物
13对(表 1), 占所用引物总数的 5.4%。
引物 CINAU32 在簇毛麦、中国春-簇毛麦双倍
体以及 1V异附加系中均扩增出相同的 300 bp条带,
而中国春和其他异附加系则无此带(图 1-a), 表明
CINAU32-300可作为簇毛麦 1V染色体的特异标记。
同样, 有 5 对(CINAU33、CINAU34、CINAU35、
CINAU36 和 CINAU37)、1 对 (CINAU38)、1 对
(CINAU39)、 2 对 (CINAU41、CINAU42)、 2 对
(CINAU44、CINAU45)引物在分别涉及簇毛麦 2V、
3V、4V、5V和 7V染色体异附加系中可扩增出与簇
毛麦相同的特异条带, 因此它们可分别作为簇毛麦
2V、3V、4V、5V和 7V染色体的特异标记(图 1-b~f)。
另外, 引物 CINAU40虽在中国春与簇毛麦间未扩增
出多态, 但其 PCR产物经Hae III酶切后显示出多态
性。用该引物扩增亲本及簇毛麦二体异附加系
DA1V至DA7A的DNA, 扩增产物经Hae III酶切后,
在 4V异附加系中显示出与簇毛麦相同的 800 bp条
带, 而中国春和其他 6 个异附加系均无此带(图 2), 表
明该引物也可以追踪簇毛麦的 4V染色体。

表 1 簇毛麦染色体专化 EST-STS标记
Table 1 Chromosome-specific EST-STS markers for H. villosa
标记
Marker
EST序列
EST sequence
小麦染色体定位
Chr. location
染色体
Chromosome
引物序列
Primer sequence(5–3)
退火温度
An. temp. ( )℃
CINAU32−300 NP001055700 1AL(0.61–1.00) 1VL
Forward: GCCCACATACAAACATCC
Reverse: GCAAATGCCTTCCTTGAG 55
CINAU33−280 BE443294 2BL(0.50–0.89) 2VL
Forward: GACCCAAGAGGCGTTGATTA
Reverse: CATGTGTGCCAAATTCAAGC 55
CINAU34−510 BE426764 2BL(0.50–0.89) 2VL
Forward: CATGATGCTGTAGGGCTGAA
Reverse: TCGCTGACAAGGCATTACAC 55
CINAU35−1100 BF478929 2BL(0.89–1.00) 2VL
Forward: AAGTGGAGCACCTGGATTTG
Reverse: ATGTGACCAGCTCCTTCGAT 55
CINAU36−380 BF292632 2BL(0.89–1.00) 2VL
Forward: ATTTGGATGAGGCAAAGGTG
Reverse: TCTGCTGGTCCTCTGATGTG 55
CINAU37−400 BE405017 2BL(0.89–1.00) 2VL
Forward: AGATTGGAAGCATGGTTTGC
Reverse: ACAGGGTCGTAGCCATTCAC 55
CINAU38−250 BJ216564 3BS(0.78–0.87) 3VS
Forward: CGACGACGTAGATCCAGATG
Reverse: TGCTCATGATCGTCATCTCC 55
CINAU39−950 CK158455 4V
Forward: AATGCATGTTGAACCTCGTGT
Reverse: TCAAGGAGATCGATGAGCATT 58
CINAU40−800 CK212529 4V
Forward: ACCCGTTGATCCCAAGAAGTA
Reverse: CGGTATCATCAGCCTCAACTC 58
CINAU41−745 BQ162207 5BL(0.79–1.00) 5VS
Forward: CTCCAAGAGCCCAGATAG
Reverse: AGGGTGGGGAGAAAGTTA 55
CINAU42−1050 CK207363 5A, 5B 5VL
Forward: CTCCTCGGAAGGTCTCAAGAT
Reverse: TACAACGCTTGGTTGGGTATC 58
CINAU44−765 CK214580 7A, 7D 7V
Forward: CTTTAGCCTCCTTCGCAACAT
Reverse: TCCTCATGGTTCTCAAGCACT 56
CINAU45−495 CK161204 7B 7V
Forward: GCAATATGCGGTGCCTATACT
Reverse: CCCAGCCAGTCTCTCACATAAT 58

2.2 用簇毛麦特异分子标记鉴定普通小麦-簇毛
麦异染色体系
目前国际上有 2套完整的簇毛麦异附加系, 其簇
毛麦来源与本研究所用簇毛麦不同, 农艺性状或优
异特性也会具有一定的差异, 因此, 有必要建立一
套完整的簇毛麦异附加系或异代换系。从中国春/硬
粒小麦—簇毛麦(60Co-γ 射线照射花粉)//中国春的回
交后代中, 选用经 GISH 鉴定在普通小麦背景中含有
单条簇毛麦染色体的 22个单株(表 2), 分别用对 1V至
7V 有特异扩增产物的引物(CINAU32、CINAU33、
CINAU38、CINAU39、CINAU42、6S-19和 CINAU44)
进行 PCR扩增分析, 这 22个植株均可扩增出并且只
有 1条分别对应于 1V至 7V染色体的特异带, 其中
4株可扩增出 1V染色体的特异带, 2 株可扩增出 2V
4 作 物 学 报 第 35卷



图 1 引物对亲本及小麦-簇毛麦异附加系 DNA的扩增
Fig. 1 Amplification of DNA of parents and wheat-H. villosa addition lines with primers
a: primer CINAU32; b: primer CINAU35; c: primer CINAU38; d: primer CINAU39; e: primer CINAU41; f: primer CINAU45.
M: DL 2000; 1: Chinese Spring; 2: H. villosa; 3: T. durum-H. villosa amphiploid; 4: T. durum; 5–11: Add1V to Add7V;
12: ddH2O. Arrow indicates amplified bands specific for H. villosa individual chromosomes.

染色体的特异带, 2株可扩增出 3V染色体的特异带,
2株可扩增出 4V染色体的特异带, 5株可扩增出 5V
染色体的特异带, 3株可扩增出 6V染色体的特异带,
4株可扩增出 7V染色体的特异带(表 2, 图 3), 表明
这些材料包含簇毛麦的整套染色体。进一步用中国
春作父本进行回交再自交, 结合分子标记和分子细
胞学鉴定, 从其后代中可选育出整套中国春背景下
纯合的簇毛麦异附加系或异代换系。
2.3 用簇毛麦特异分子标记鉴定小麦-簇毛麦易
位染色体
从中国春/硬粒小麦-簇毛麦(60Co-γ 射线照射花
粉)//3×中国春BC3代中, 选用经GISH鉴定在普通小
麦背景中只包含单条小麦-簇毛麦易位染色体的 23
份材料, 将其中 23条易位染色体按易位类型、簇毛
麦染色体片段所处位置(先短臂后长臂)和片段大小
(由小到大)顺序排列, 分别编号为 T01至 T23(图 4)。
用本研究得到的和已有的簇毛麦特异引物扩增亲本
和 23个小麦-簇毛麦易位系的DNA, 鉴定T01至T23
所涉及的簇毛麦染色体身份。用定位于簇毛麦 4V染
色体的引物 CINAU39 在簇毛麦和含 T22 的易位系



图 2 引物 CINAU40 (4V)扩增产物经 Hae III酶切后的电泳图
Fig. 2 Electrophoresis of Hae III digested PCR products with
primer CINAU40 (4V)
M: DL 2000; 1: Chinese Spring; 2: H. villosa; 3–9: Add1V to
Add7V; 10: ddH2O. Arrow indicates a specific band of about 800 bp
in Add4V and H. villosa.
第 1期 曹亚萍等: 基于 EST-PCR的簇毛麦染色体特异分子标记筛选及应用 5


表 2 普通小麦-簇毛麦异染色体系鉴定
Table 2 Identification of wheat-H. villosa alien chromosome lines
编号
Code
材料
Material
标记
Marker
染色体
Chromosome
编号
Code
材料
Material
标记
Marker
染色体
Chromosome
1 cyp01-8-7 CINAU44-765 7V 12 cyp28-3-9 CINAU44−765 7V
2 cyp02-38-7 CINAU42-1050 5V 13 cyp28-3B-9 CINAU44−765 7V
3 cyp13-2-1 CINAU33-280 2V 14 cyp31-1-17 6S-19−381 6V
4 cyp13-6-1 CINAU42-1050 5V 15 cyp31-2-24 CINAU42−1050 5V
5 cyp13-6-2 CINAU42-1050 5V 16 cyp31-2-27 CINAU42−1050 5V
6 cyp16-5-3 CINAU32-300 1V 17 cyp37-1-7 6S-19−381 6V
7 cyp16-5-9 CINAU44-765 7V 18 cyp01-1 CINAU39−950 4V
8 cyp16-5B-5 CINAU32-300 1V 19 cyp19-2 CINAU39−950 4V
9 cyp17-2-15 CINAU38-250 3V 20 cyp17-8-2-15 6S-19−381 6V
10 cyp26-2-15 CINAU33-280 2V 21 cyp22-1-1-7 CINAU32−300 1V
11 cyp28-3-2 CINAU38-250 3V 22 cyp41-3-15-12 CINAU32−300 1V




图 3 特异引物对簇毛麦染色体系 DNA的扩增
Fig. 3 Amplification of DNA of wheat-H. villosa alien chromosome lines with specific primers
a: primer CINAU32; b: primer CINAU33; c: primer CINAU38; d: primer CINAU39; e: primer CINAU42; f: primer 6S-19; g: primer
CINAU44. Hv indicates H. villosa. Arrows indicate amplified bands specific for H. villosa individual chromosomes.
6 作 物 学 报 第 35卷



图 4 易位小麦-簇毛麦易位染色体
Fig.4 Wheat-H. villosa translocation chromosomes involved in translocation lines
簇毛麦基因组 DNA探针用 Fluorescein-12-dUTP标记, 普通小麦染色体呈红色, 簇毛麦染色体呈绿色。T01~T06：外源小片段易位染
色体; T07：簇毛麦型插入易位染色体; T08：小麦型插入易位染色体; T09~T17：整臂易位染色体; T18~T23：外源大片段易位染色体。
H. villosa genomic DNA labeled with Fluorescein-12-dUTP. Wheat chromosomes display red color, H. villosa chromosomes show green color.
T01–T06: small alien segment translocation; T07: intercalary translocation with H. villosa segment; T08: intercalary translocation with wheat
segment; T09–T17: whole arm translocation; T18–T23: large alien segment translocation.

中扩增出簇毛麦 950 bp的特异带, 而中国春和其他
易位系均未扩增出此带, 表明 T22 所含外源为簇毛
麦的 4V染色体片段(图 5-a); 用定位于簇毛麦 7V染
色体的引物 CINAU45 分别在含 T08 和 T19 易位染
色体的单株中扩增出与簇毛麦相同的 495 bp的特异
带, 中国春和其他易位系均未扩增出此带, 表明这 2
条易位染色体涉及的外源染色体片段均为 7V 染色体
片段(图 5-b)。采用这种方法, 共鉴定出 18条易位染
色体的簇毛麦身份, 涉及到簇毛麦除3V 以外的所有
染色体(表 3)。从其自交后代中, 可望得到纯合的涉
及不同簇毛麦染色体片段的小麦-簇毛麦易位系。
3 讨论
小麦背景中簇毛麦染色体的鉴定有多种方法 ,
形态标记简单直观, 但其数目太少, 只有 2V染色体
短臂上簇生刚毛比较稳定, 其他如穗轴易断、红粒
等都不稳定; 染色体 C-分带技术对整条簇毛麦染色
体的鉴别较有效, 但对特征带纹不明显或缺少带纹
的染色体片段就难于鉴别; 荧光原位杂交技术能准
确鉴定是否含有簇毛麦染色体或染色体片段, 但无
法确定是哪一条染色体或哪个染色体片段; 有关簇
毛麦的生化标记也有报道, 但同样存在稳定性不够
和操作复杂等困难。以上各种检测普通小麦背景中
簇毛麦染色质的方法, 其多态性形成的分子基础均
是基因组DNA的变异, 并且各检测方法有其相应的
局限性。而分子标记是建立在 DNA水平上的遗传标
记, 所揭示的多态性直接反映基因组 DNA间的差异,
不受发育阶段和环境的影响, 其分子水平上的多态
性大大超过上述各种遗传标记所反映的差异, 目前
被广泛采用。
南京农业大学细胞遗传研究所从 20世纪 70年代
起致力于将簇毛麦优异基因导入普通小麦的研究, 培
育出的含有抗白粉病基因 Pm21的 6VS/6AL易位系已
在小麦育种中得到广泛应用, 因而对与 Pm21 连锁的
特异标记筛选研究较多。Qi等[8]筛选到可以追踪 Pm21



图 5 特异引物 CINAU39(a)和 CINAU45(b)对簇毛麦易位染色体系 DNA的扩增
Fig. 5 Amplification of DNA of wheat-H. villosa translocation chromosome lines with specific primer CINAU39 (a) and CINAU45 (b)


表 3 普通小麦-簇毛麦易位染色体的鉴定
Table 3 Identification of wheat-H. villosa translocation chromosomes
TC No. 材料
Material
易位染色
体类型
Translocation
type
易位染色体
TC
CINAU 27
1VS
CINAU 23
1VL
CINAU 32
1VL
Xwmc 25
2VS
CINAU 33
2VL
CINAU 39
4V
CINAU 40
4V
CINAU 41
5VS
6S-19
6VS
6L-4
6VL
CINAU 44
7V
CINAU 45
7V
T01 cyp22-1-1-6 SAST W·W-2VL +
T02 cyp35-2-7-21 SAST
T03 cyp01-8-10-6 SAST W·W-2VL +
T04 cyp37-1-6 SAST
T05 cyp41-3-15-8 SAST
T06 cyp03-2-5-10 SAST W·W-6VS +
T07 cyp17-8-2-3 Ti-V
T08 cyp32-2-1-25 Ti-W 7VS·W-7VL + +
T09 cyp41-3-15-2 WAT 6VS·W +
T10 cyp22-1-1-12 WAT 1VS·W +
T11 cyp13-6B-2-4 WAT 5VS·W +
T12 cyp25-6-1-5 WAT 6VS·W +
T13 cyp32-2-9-1 WAT 6VS·W +
T14 cyp25-6-11-21 WAT 1VS·W +
T15 cyp02-38-5-19 WAT W·6VL +
T16 cyp25-6-16-8 WAT W·1VL + +
T17 cyp13-6-8 WAT 6VS·W +
T18 cyp08-4-2-24 LAST
T19 cyp09-58-9-24 LAST 7VS·7VL-W + +
T20 cyp28-3-12-1 LAST 2VS·2VL-W +
T21 cyp16-5-1 LAST 6VS·6VL-W +
T22 cyp34-28-1-4 LAST 4VS·4VL-W + +
T23 cyp17-68-11 LAST 2VS·2VL-W +
SAST: 外源小片段易位染色体; Ti-V: 簇毛麦型插入易位染色体; Ti-W: 小麦型插入易位染色体; WAT: 整臂易位染色体; LAST: 外源大片段易位染色体。TC：易位染色体。
SAST: small alien segment translocation; Ti-V: intercalary translocation with H. villosa segment; Ti-W: intercalary translocation with wheat segment; WAT: whole arm translocation; LAST: large
alien segment translocation. TC: translocation chromosome.

8 作 物 学 报 第 35卷

的 RAPD标记 OPH17-1400; Liu等[9]进一步将其转化
为与 Pm21连锁的 SCAR(sequence characterized appli-
ed region)标记 SCAR-1400和 SCAR-1265。Cao等[10]根
据一个抗白粉病基因的序列开发出能鉴定 6VS的共
显性分子标记 NAU/XiBao15-902(即 CINAU15-902),
Chen 等[11]根据小麦 LRR(leucine-rich repeat)序列开
发出另一个能鉴定 6VS 的共显性分子标记 NAU/
XiBao16-1085(即 CINAU16-1085), 这两个分子标记均
位于6V短臂近中部(FL0.45–0.58)。王春梅等[12]选用
11个 RGA(Resistance Gene Analogy)和 17对 STS引
物筛选出分别位于6V短臂 0.58~0.70和 0.00~0.45区
段的 CINAU17-1086和 CINAU18-723 2 个标记。李辉
等[13]用 120 个随机引物对 6D/6V 代换系 Pm930640
进行 RAPD 分析, 获得 5 个 6VS 的特异标记。其
次 , 针对簇毛麦其他染色体的特异性分子标记也
有研究, Zhang等[14]筛选出一套簇毛麦的 SSR 标记,
Xwmc49-252、Xwmc25-120、Xgdm36-200、Xgdm145-110、
Xwmc233-247、Xwmc256-105 和 Xgwm344-100, 可分
别鉴定簇毛麦 1V 至 7V 染色体 ; 刘守斌等 [15]筛
选出 1 对可追踪簇毛麦 1V 染色体的特异 SSR 标记
Xgwm498-110; 王春梅等 [16]根据已定位于普通小麦
第一部分同源群的 EST序列设计 STS引物, 筛选出
5对簇毛麦 1V染色体特异标记, 均位于着丝点附近。
据初步统计, 基于 PCR的簇毛麦各条染色体特
异分子标记共有 27个(表 4), 其中 RAPD标记 6个,
集中于 6V染色体短臂; SCAR标记 6对, 集中于 6V
染色体短臂; SSR标记 10对, 分布于 1V至 7V染色
体; EST-STS标记 5对, 集中于 1V染色体。可见, 要
想鉴定辐射得到的一批小麦-簇毛麦易位染色体, 各
种标记的密度远未达到令人满意的程度。本研究针
对这一现状, 利用 EST-STS 通用性好、稳定性高的
特点, 筛选到 13 对分布于 1V 至 7V 染色体的 STS
标记, 对已开发或筛选的簇毛麦分子标记是一个有
益的补充。因已得到的 6V染色体标记较多, 本研究
未对其作针对性筛选。
用目前已有簇毛麦特异引物鉴定 23 条小麦-簇
毛麦易位染色体, 明确了 18 条中簇毛麦染色体身份,
未鉴定清楚的易位染色体分别为 T02、T04、T05、
T07和 T18, 其中前 3个为簇毛麦小于一个臂的顶端
易位染色体; T07从形态上看似为大片段插入易位染
色体, 但染色体 C-分带和减数分裂配对分析表明该
染色体为等臂易位染色体, 所含簇毛麦染色体片段
为着丝粒到 FL0.50区段; 只有 T18为簇毛麦大片段
易位染色体。这 5 条易位染色体的簇毛麦片段均未
涉及到已有簇毛麦特异引物的扩增位点, 表明本研
究尽管已加密了簇毛麦各条染色体特异分子标记 ,
但现有标记对鉴定簇毛麦整臂易位和大片段易位效
果较好, 还不足以鉴定簇毛麦小片段易位。
对一条染色体易位片段的准确鉴定, 至少要有
4 个位点的标记, 即分别位于长臂和短臂靠近着丝
粒的 2个标记和靠近顶端的 2个标记。虽已得到 41
个簇毛麦特异标记, 但大多集中于 6V染色体(14个,
占 34.1%)、1V染色体(8对, 占 19.5%)和 2V染色体
(7 对, 占 17.1%), 其他染色体特异标记较少。目前,
EST 数据快速增加, 截至 2008 年 6 月, 在 NCBI 上
登记的小麦 EST 序列已达到 105 万多条, 这为簇毛
麦 EST-STS标记的进一步开发和利用提供了巨大资
源。本研究得到的定位于 2VL和 3VS上的簇毛麦特
异标记, 即是根据普通小麦 2BL和 3BS上的 EST序
列开发而来的。基于作物的共线性关系, 利用普通
小麦不同位点的 EST 序列设计引物, 可迅速加密簇
毛麦相应位点的特异分子标记。
南京农业大学细胞遗传研究所利用硬粒小麦-
簇毛麦双倍体花粉辐射得到大量的小麦-簇毛麦属
间染色体易位, 随着回交世代的增加, 后代中簇毛
麦易位染色体逐渐单一化, 一批在普通小麦背景中
只包含单条小麦-簇毛麦易位染色体的材料需要鉴
定。采用更多涉及不同簇毛麦染色体不同部位的分
子标记, 将大大加速涉及各条簇毛麦染色体不同区
段易位染色体系的选育和鉴定, 进而加速簇毛麦易
位文库的构建, 促进簇毛麦有用基因的物理定位和
开发利用。
4 结论
根据水稻、小麦的 EST序列设计 STS引物, 筛
选出涉及簇毛麦 1V至 7V染色体的 13对特异标记。
与早期得到的簇毛麦特异标记相补充, 在中国春/硬
粒小麦-簇毛麦(60Co-γ 射线照射花粉)//中国春后代
中鉴定出簇毛麦整套 1V 至 7V 异染色体系以及 18
条易位染色体的簇毛麦身份, 为簇毛麦各条染色体
特异分子标记的进一步加密以及更多小麦-簇毛麦
易位染色体的鉴定提供了新的研究工具。


第 1期 曹亚萍等: 基于 EST-PCR的簇毛麦染色体特异分子标记筛选及应用 9


表 4 簇毛麦各条染色体基于 PCR的特异分子标记
Table 4 Molecular markers specific to individual chromosomes of H. villosa based on PCR
标记
Marker
标记类型
Type
小麦染色体定位
Chr. location
染色体
Chromosome
引物序列
Primer sequence(5–3)
参考文献
Reference
Xwmc49−252 SSR 1BS 1V
Forward: CTCATGAGTATATCACCGCACA
Reverse: GACGCGAAACGAATATTCAAGT Zhang et al.
[14]
CINAU27−620 EST-STS
1AS (0.47–0.86)
1BL (0.00–0.32)
1DS (0.00–0.48)
1VS Forward: TTGTTGCTGCCTGTGAAAAC Reverse: ACCAGTTAGCGTTGCCAGAT Wang et al.
[16]
CINAU24−1050 EST-STS 1BL (0.00–0.32) 1VL
Forward: CTCCTCCTCCTCTCCCACTT
Reverse: TGAATTGAATGTCCATTTTGATG Wang et al.
[16]
CINAU26−500 EST-STS 1BL (0.00–0.32) 1VL
Forward: ACACTGCAATTCGTCAAGCA
Reverse: TGGCAAATCCAAAGACACAG Wang et al.
[16]
CINAU23−1700 EST-STS
1BL (0.00–0.32)
1DL (0.18–0.41) 1VL
Forward: AAGCCAGGAAATTTGTGGTG
Reverse: CAAGGGATATTGCGAGGAAA Wang et al.
[16]
CINAU25−1650 EST-STS
1AL (0.17–0.61)
1BL (0.00–0.32)
1DL (0.41–1.00)
1VL Forward: GAAGAAGATGTTCGGCTTCG Reverse: GGGAACAAGAAACTGCAGGA Wang et al.
[16]
Xgwm498−110 SSR 1B 1VL
Forward: GGTGGTATGGACTATGGACACT
Reverse: TTTGCATGGAGGCACATACT Liu et al.
[15]
Xwmc25−120 SSR 2BS, 2DS 2VS
Forward: TCTGGCCAGGATCAATATTACT
Reverse: TAAGATACATAGATCCAACACC Zhang et al.
[14]
Xgwm469−180 SSR 6DS 2V
Forward: CAACTCAGTGCTCACACAACG
Reverse: CGATAACCACTCATCCACACC Zhang et al.
[14]
Xgdm36−200 SSR 1B, 3DS, 6DS 3V
Forward: ATGCAAAGGAATGGATTCAA
Reverse: CAAATCCGCATCCAGAAAAT Zhang et al.
[14]
Xgdm145−110 SSR 4AL, 7DS 4VL
Forward: TGAAGGACAAATCCCTGCAT
Reverse: TCCCACCTTTTTGCTGTAGA Zhang et al.
[14]
Xwmc233−247 SSR 5DS 5V
Forward: GACGTCAAGAATCTTCGTCGGA
Reverse: ATCTGCTAAGCAGATCGTGGTT Zhang et al.
[14]
CINAU15−902 SCAR 6VS
Forward: AGATCCAACACCAGTTCAAG
Reverse: ATGTTATGGAGGCTTGTGTC Cao et al.
[10]
CINAU16−1650 SCAR 6VS
Forward: GTAGACAGTGCCGCTATTTC
Reverse: CAACTCATGTGTCCAGTTCA Chen et al.
[11]
CINAU17−1086 SCAR 6VS
Forward: TGTCTTGTAGGTATCGAAGAGTG
Reverse: ATTAGTGTCTTGTAGGGTATCCTATGT Wang et al.
[12]
CINAU18−723 SCAR 6VS
Forward: TAGTTCCCTGACGCTGCTTT
Reverse: TGTTGACCGCTCATACGTTC Wang et al.
[12]
OPH17−1400 RAPD 6VS CACTCTCCTC Qi et al.[8]
SCAR1400 SCAR 6VS
Forward: CACTCTCCTCAAACCTTGCAAG
Reverse: CACTCTCCTCCACTAACAGAGG Liu et al.
[9]
SCAR1265 SCAR 6VS
Forward: GTTTGTTCACGTTGAATGAATTC
Reverse: CACTCTCCTCCACTAACAGAGG Liu et al.
[9]
OPAN03−1700 RAPD 6VS AGCCAGGCTG Li et al.[13]
OPAI01−700 RAPD 6VS GGCATCGGCT Li et al.[13]
OPAL03−750 RAPD 6VS CCCACCCTTG Li et al.[13]
OPAD07−480 RAPD 6VS GGCAAACCCT Li et al.[13]
OPAG15−580 RAPD 6VS CCCACAGCA Li et al.[13]
Xgdm107−510 SSR 2DS 6VS
Forward: AGCAACAAACGCGAGAGC
Reverse: TGACACCCGGTTGTTGG Zhang et al.
[14]
Xwmc256−105 SSR 6AL 6V
Forward: CCAAATCTTCGAACAAGAACCC
Reverse: ACCGATCGATGGTGTATACTGA Zhang et al.
[14]
Xgwm344−100 SSR 7A, 7BL 7V
Forward: CAAGGAAATAGGCGGTAACT
Reverse: ATTTGAGTCTGAAGTTTGCA Zhang et al.
[14]

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