全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(6): 905−910 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2009AA101106)和作物遗传与种质创新国家重点实验室开放基金(ZW2007004)资助。
*
通讯作者(Corresponding authors): 杨守萍, E-mail: spyang@njau.edu.cn, Tel: 025-84396463; 盖钧镒, E-mail: sri@njau.edu.cn, Tel: 025-84395405
第一作者联系方式: E-mail: hanlitao0210@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2009-12-21; Accepted(接受日期): 2010-03-19.
7DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00905
大豆细胞质雄性不育系MADS-box基因的分离分析
韩利涛 姜 伟 杨守萍* 喻德跃 盖钧镒*
南京农业大学 / 国家大豆改良中心 / 作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095
摘 要: 采用 cDNA-AFLP差异显示技术对大豆细胞质雄性不育系 NJCMS2A与其保持系 NJCMS2B间基因差异表达
进行研究, 结果从 NJCMS2A花蕾中分离到一个差异表达片段, 对该差异片段进行克隆、测序和序列比对分析, Blast
检索结果显示它与大豆基因组中 Gm13上 g29510.1 cDNA片段的同源性达 98.7%, 与大豆中一个 MADS-box基因的
同源性达 98%, 氨基酸序列比对结果表明它与大豆中一个MADS-box蛋白有 96%的同源性, 与豌豆中MADS-box M7
蛋白有 83%的同源性 , 与苦瓜中 MADS-box2 蛋白有 88%的同源性 , 与海岛棉典型的 MADS-box 基因编码的
AGAMOUS 蛋白保守区有 83%的同源性 , 进一步对其氨基酸序列进行结构和功能预测显示该差异片段具有
MADS-box转录因子的典型结构域 K-box, 证明其编码蛋白为一MADS-box转录因子, 半定量 RT-PCR分析结果显示
其在 NJCMS2A花蕾中表达量很高, 而在 NJCMS2B花蕾中表达量很低, 推测该差异片段可能与大豆细胞质雄性不育
有关。
关键词: 大豆; 细胞质雄性不育; cDNA-AFLP; MADS-box转录因子
Isolation and Analysis of MADS-box Gene from Soybean (Glycine max L. Merr.)
Cytoplasmic Male Sterile Line
HAN Li-Tao, JIANG Wei, YANG Shou-Ping∗, YU De-Yue, and GAI Jun-Yi∗
National Center for Soybean Improvement / National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement / Nanjing Agricultural Univer-
sity, Nanjing 210095, China
Abstract: CMS (cytoplasmic male sterility) plays an important role in the utilization of crop heterosis. It is of important signifi-
cance on theory and practice to study the genetic base and mechanism of CMS. To reveal the molecular mechanism of soybean
cytoplasmic male sterility, we analyzed the gene differential expression between the soybean cytoplasmic male sterile line
NJCMS2A and its maintainer line NJCMS2B by the cDNA-AFLP differential display method. A differentially expressed fragment
from the flower buds of NJCMS2A was cloned and sequenced. The Blast results showed that the differentially expressed fragment
shared 98.7% homology with g29510.1 cDNA fragment on Gm13 of soybean genome, and 98% homology with a MADS-box
gene of soybean. The Blast results of the amino acid sequences indicated that the differentially expressed fragment shared 96%
homology with a MADS-box protein of Glycine max, 83% homology with the MADS-box M7 protein of Pisum sativum, 88%
homology with the MADS-box 2 protein of Momordica charantia, and 83% homology with AGAMOUS protein of Gossypium
barbadense. The structure and function prediction of the amino acid sequence showed that the protein encoded by the differen-
tially expressed fragment was the transcription factor of the MADS-box gene which contained a typical K-box domain. The re-
sults of semi-quantitative RT-PCR showed that the expression quantity of the differentially expressed fragment in the flower buds
of NJCMS2A was much higher than that of NJCMS2B. According to the above results, it was inferred that the differentially ex-
pressed fragment was probably related to the soybean cytoplasmic male sterility.
Keywords: Soybean; Cytoplasmic male sterility; cDNA-AFLP; MADS-box transcription factor
cDNA-AFLP 技术是 Bachem 等 [1]发明的用于
mRNA 表达差异分析的一种方法, 具有反应条件严
谨、退火温度高、重复性好等特点, 已被广泛用于
许多植物种属基因的差异表达研究。Habu 等[2]利用
cDNA-AFLP程序, 比较普通牵牛花白花、红花两个
品系的花芽 mRNA, 获得了 2 个差异表达 cDNA 片
906 作 物 学 报 第 36卷

段。Van Der Bizen 等[3]利用 cDNA-AFLP技术分离
了寄生虫侵染拟南芥相互作用诱导的一些基因片
段。Qin等[4]分离了几个新的线虫侵染土豆过程中特
异表达的基因片段。凌杏元等[5]利用线粒体 RNA合
成 cDNA 进行选择扩增, 比较野生型水稻不育系、
保持系和 F1杂种线粒体RNA差异, 找到一条可能与
育性有关的差异表达条带, 并进行了验证。吴敏生
等[6]为揭示杂种优势的基本原理, 利用 cDNA-AFLP
技术对玉米自交系和杂种一代的差异表达基因的表
达量变化进行了研究。借助 cDNA-AFLP 分析技术,
王永勤等[7]从白菜两用系花蕾中分离得到了 4 个在
不同发育时期特异表达的基因 BCMF1、BCMF2、
BCMF3、BCMF4, 其中基因 BCMF2、BCMF3、
BCMF4分别与编码拟南芥多聚半乳糖醛酸酶、大白
菜果胶甲酯酶和油菜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的
基因有关。
MADS-box 基因家族是一类非常重要的调节基
因家族, 具有特定的保守结构域, 通过其保守结构
域与特定的 DNA序列结合来调控基因的表达[8]。植
物的 MADS 基因家族成员庞大, 对拟南芥和水稻全
基因组范围的研究发现分别有 107个和 71个基因家
族成员[9-10]。在植物的许多发育阶段, MADS-box家
族基因都扮演了重要的角色, 包括开花时间控制(如
FLC、SOC1、SVP), 分生组织特征决定(如 CAL、AP1、
FUL), 花器官决定(如 AG、AP1、AP3、SEP1~3), 果
实成熟(如 SHP1、FUL), 胚发育(AGL15), 营养器官
如叶(AGL16)和根(AGL19)的发育等[11-14]。
细胞质雄性不育(CMS)是一种受细胞核和细胞
质遗传物质双重控制的母性遗传性状, 它不仅是杂
种优势广泛利用的基础, 还为细胞质遗传和核质互
作研究提供了极好的材料。大豆是重要的蛋白脂肪
兼用作物, 产量一直是大豆生产的制约因素, 杂种
大豆可显著提高单产和抗逆性, 因而, 应用杂种优
势是发展我国大豆生产的重要途径之一。本研究通
过 cDNA-AFLP 差异显示技术从大豆细胞质雄性不
育系中分离得到一个 MADS-box 转录因子基因, 根
据所得片段序列设计引物, 对该基因在不育系和保
持系花中的表达进行 RT-PCR 扩增, 对扩增到的基
因片段进行克隆和序列分析 , 以进一步探讨该
MADS-box 转录因子基因的表达与大豆细胞质雄性
不育的关系。
1 材料与方法
1.1 材料和处理
以大豆细胞质雄性不育系 NJCMS2A 与其保持
系 NJCMS2B为材料。NJCMS2A是以两个栽培大豆
杂交组合(N8855×N1628)F2不育株为母本, N1628为
轮回亲本连续回交多代, 得到的细胞质雄性不育系,
N1628(NJCMS2B)为其同型保持系[15]。
2007年和 2008年夏将不育系NJCMS2A与其保
持系 NJCMS2B 种植于南京农业大学国家大豆改良
中心江浦试验站。在大豆开花期随机选取不育系
NJCMS2A 与其保持系 NJCMS2B 各 10 株, 按单株
分别取其大、中、小花蕾和成熟花, 经液氮速冻后
于−80℃冰箱中保存备用。
1.2 总 RNA的提取与双链 cDNA的合成
采用 RNAsimple Total RNA Kit总 RNA提取试
剂盒(离心柱型, 天根生化科技有限公司)提取不育
系 NJCMS2A 与其保持系 NJCMS2B 的花蕾和成熟
花的总 RNA, 利用 M-MLV RTase cDNA Synthesis
Kit试剂盒(宝生物工程大连有限公司)合成 cDNA双
链, 具体方法参考试剂盒说明书。
1.3 双链 cDNA纯化浓缩、限制性双酶切和接头
序列
采用苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为 25∶24∶1)溶
液纯化双链 cDNA, 无水乙醇沉淀后浓缩, 加适量
的灭菌蒸馏水稀释, 依据 A260值将双链 cDNA 含量
调整至相同浓度。以常规方法进行 Mse I和 Pst I限
制性双酶切, 其中, Mse I接头序列为 5′-GACGATG
AGTCCTGAG-3′(正向)和 5′-TACTCAGGACTCAT-3′
(反向), Pst I 接头序列为 5′-CTCGTAGACTGCGTAC
ATGCA-3′(正向)和 5′-CATCTGACGCATGT-3(反向)。
1.4 cDNA-AFLP预扩增和选择性扩增
参照 Bachem 等[16]所述方法, 将完成限制性双
酶切和连接接头的产物进行 10×稀释, 然后预扩增。
预扩增 PCR程序为 94℃, 2 min; (95℃, 30 s; 56℃, 30
s; 72℃, 60 s), 30个循环; 72℃, 10 min。于 4℃保存预
扩增产物。预扩增的引物序列为 P+0 (5′-GACTGC
GTACATGCAG-3′), M+C(5′-GATGAGTCCTGAGTA
AC-3′), 分别与 Mse I和 Pst I的接头序列相匹配。选
用 16条 M引物和 14条 P引物进行选择性扩增, 每
条M引物分别与 P引物进行组合, 共有 224对组合。
cDNA-AFLP选择性扩增程序为 95℃, 2 min; [94℃,
30 s; 65℃, 30 s (每循环−0.7℃); 72℃, 60 s], 13个循
环; (95℃, 30 s; 56℃, 30 s; 72℃, 60 s), 25个循环;
72℃, 10 min。
1.5 cDNA-AFLP 产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳及
银染显影
采用常规技术进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色
第 6期 韩利涛等: 大豆细胞质雄性不育系 MADS-box基因的分离分析 907


和显影 , 用凝胶成像仪 (Pharmacia Biotech Image
Master)进行图像扫描, 记录实验结果。
1.6 差异条带 DNA二次扩增和克隆
从聚丙烯酰胺凝胶上切下重复性好、稳定一致
的差异条带, 以 90℃处理 20 min, 12 000×g 离心 5
min后, 吸取上清液 2 μL作为二次 PCR扩增的模板。
PCR 体系及程序与前述选择性扩增相同, 其中, 二
次扩增时选用的引物, 与 cDNA-AFLP 中鉴定该特
异表达的引物一致。PCR产物经 1.0%琼脂糖凝胶电
泳检测后, 与 pMD19-T 载体(宝生物工程大连有限
公司)连接, 转化感受态大肠杆菌菌株 DH5α, 提取
单菌落克隆质粒, 进一步用菌液 PCR 对克隆片段进
行检测, 确认与目的片段大小一致后送上海英骏生
物技术有限公司测序, 获得 EST序列。
1.7 基因片段的引物设计
根据所得片段序列, 采用 primer premier 5.0引
物设计软件设计引物, 其 FP 引物序列为 5-CATTA
GCCTCAGAAGCAG-3, RP 引物序列为 5-GACCC
ATCCATGTCAGTT-3。
1.8 RT-PCR
采用两步法进行 RT-PCR, 程序如下: (1) 采用
天根生化科技有限公司的 TIANScript cDNA第一链
合成试剂盒, 参考试剂盒说明书合成 cDNA第一链。
(2) 在 PCR 管中依次加入 cDNA 1 μL、10×PCR
buffer 2 μL、25 mmol L−1 MgCl2 1.5 μL、10 mmol L−1
dNTPs mix 0.4 μL、10 pmol L−1引物 FP 1 μL、10 pmol
L−1引物 RP 1 μL、5 U μL−1 Taq 0.2 μL, 以 ddH2O调
节至 20 μL。PCR程序为 94℃, 2 min; (95℃, 30 s;
56℃, 30 s; 72℃, 60 s), 30个循环; 72℃, 10 min; 保
持 4℃。
1.9 序列分析
对所得到的序列在大豆基因组库中进行同源性
比对, 并在 NCBI的 Blastx在线进行同源性比对, 采
用 InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Inter-ProScan/
index.html)在线进行结构域和功能位点预测。
2 结果与分析
2.1 花蕾总 RNA的检测
利用混合花蕾取样法分别对大豆细胞质雄性不
育系 NJCMS2A 与其保持系 NJCMS2B 不同发育时
期的花蕾和成熟花进行取样, 提取其总 RNA, 经琼
脂糖凝胶电泳(图 1)和微量紫外分光光度计检测。图
1显示, 总 RNA中的 28S rRNA与 18S rRNA亮度比
约为 2∶1, 紫外分光光度计检测结果显示 A260/A280
约为 2.0, A260/A230≥2.0, 表明所提取的总 RNA纯度
较高, 质量较好。



图 1 NJCMS2A与 NJCMS2B的总 RNA琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis profile of total RNA from
NJCMS2A and NJCMS2B
1: NJCMS2A花蕾; 2: NJCMS2A成熟花; 3: NJCMS2B花蕾;
4: NJCMS2B成熟花。
1: NJCMS2A flower buds; 2: NJCMS2A flowers; 3: NJCMS2B
flower buds; 4: NJCMS2B flowers.

2.2 以 cDNA-AFLP分离得到差异片段
采用 224 对引物对大豆细胞质雄性不育系
NJCMS2A与其保持系NJCMS2B的差异表达进行分
析, 选择在NJCMS2A与NJCMS2B之间存在明显差
异的条带进行回收、克隆。经过 cDNA-AFLP 分析
发现应用引物组合 P11/M2在NJCMS2A中得到一个
差异表达片段, 图 2中聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示
在 NJCMS2A 花蕾和成熟花中有一条高表达的条带,
而在 NJCMS2B 花蕾和成熟花中则没有看到有条带,
将该差异片段所处的 PAGE 胶用干净刀片切下, 转
入离心管, 加入 20 µL ddH2O, 用枪头捣碎, 90℃煮
20 min, 稍微离心, 取 2 µL 上清液作为模板进行 2
次 PCR扩增。



图 2 引物组合 P11/M2聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
Fig. 2 Polyacrylamide gel electrophoresis profile of primer
combination P11/M2
1: NJCMS2A花蕾; 2: NJCMS2A成熟花; 3: NJCMS2B花蕾;
4: NJCMS2B成熟花。
1: NJCMS2A flower buds; 2: NJCMS2A flowers; 3: NJCMS2B
flower buds; 4: NJCMS2B flowers.

2.3 差异片段序列分析
对NJCMS2A花蕾中扩增的差异片段进行回收、
克隆和测序, 得到一个 396 bp的 cDNA片段。将该
差异片段的序列在大豆基因组库中进行同源性比对,
发现其与 Gm13 上 g29510.1cDNA 片段的同源性达
98.7%, 利用 NCBI 数据库进行在线比对, 发现其与
大豆中一个 MADS-box 基因的同源性达 98%, 与日
本百脉根的一个 MADS-box 基因的同源性达 88%,
908 作 物 学 报 第 36卷

与一个槐属的典型 MADS-box基因 agamous的同源
性达 91%, 与耀花豆属中一个典型MADS-box基因
agamous 的同源性达 90%, 从以上比对结果可以看
出, 该差异片段与 MADS-box 基因保守区有很高的
同源性。利用 InterProScan进行预测, 发现该差异片
段具有 MADS-box 蛋白典型的 K-box 结构域(图 3),
表明该差异片段为一个 MADS-box基因片段。
2.4 同源比对与进化分析
以该差异片段编码的氨基酸序列在 NCBI 上进
行同源性比对, 发现其与多个物种的 MADS-box 蛋
白或转录因子有较高的相似度 , 如与大豆中一个
MADS-box 蛋白有 96%的同源性 , 与豌豆中
MADS-box M7 蛋白有 83%的同源性 , 与苦瓜中
MADS-box 2 蛋白有 88%的同源性, 与海岛棉典型
的 MADS-box 基因编码的 AGAMOUS 蛋白保守区
有 83%的同源性。与该差异片段同源性较高的部分
植物的 MADS-box 基因的氨基酸序列的系统进化树
见图 4。



图 3 差异片段的保守结构域和功能位点预测
Fig. 3 Prediction of conserved domain and function sites of the differential fragment



图 4 部分同源性较高的植物 MADS-box转录因子氨基酸序列的系统进化树
Fig. 4 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of MADS-box transcription factors in some plant species

第 6期 韩利涛等: 大豆细胞质雄性不育系 MADS-box基因的分离分析 909


2.5 差异片段在 NJCMS2A与 NJCMS2B中表达
的 RT-PCR验证
用 RT-PCR 检测差异片段时 , 分别用不育系
NJCMS2A与其保持系 NJCMS2B的花蕾 cDNA和成
熟花 cDNA 作为模板 , cDNA 反转录前首先确保
RNA的起始量一致。因为模板的浓度不同将反映在
PCR 产物在琼脂糖凝胶上条带亮度的不同, 所以在
进行扩增前, 用 actin 引物调节模板浓度, 使模板量
一致, 然后进行 RT-PCR扩增。从图 5可以明显看出,
该差异片段在 NJCMS2A 花蕾中表达量最高, 明显
高于 NJCMS2B 花蕾中的表达量, 而且在成熟花中
的表达都比在花蕾中低, 在 NJCMS2B 的成熟花中
表达最低。



图 5 RT-PCR琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig. 5 Agarose gel electrophoresis profile of RT-PCR
1: NJCMS2A花蕾; 2: NJCMS2A成熟花; 3: NJCMS2B花蕾;
4: NJCMS2B成熟花; M: 分子量标准 DL2000。
1: NJCMS2A flower buds; 2: NJCMS2A flowers; 3: NJCMS2B
flower buds; 4: NJCMS2B flowers; M: molecular marker DL2000.
3 讨论
Coen 等[17]提出了花发育的 ABC 模型, 认为控
制花器官发育的基因按功能可以分为 A、B、C3类,
这些基因单独或共同作用控制各轮花器官的发育。
随着分子遗传学的深入研究发现, 花的发育受多个
途径的调控, 并且形成一个复杂的网络。经典的花
发育的 ABC模型也被不断地改进和完善, 最终发展
为 ABCDE 模型, 花器官发育的充分条件也得到相
对全面的阐释[18-19]。目前, 已发现的参与花发育调
控网络的转录调控因子中有很大一类属于 MADS-
box基因家族, 该类基因广泛存在于动物、植物和真
菌中。
胡瑞波等[20]研究表明, Glyma13g29510 为一个
参与花器官建成的 Type II MADS-box基因, 被命名
为 GmMADS1。GmMADS1基因为 C类基因 agamous
(AG), 在拟南芥中 agamous 基因集中在雄蕊和心皮
中表达, AG 突变体的花中, 第 3 轮的雄蕊被花瓣取
代, 第 4轮的心皮被另一朵 AG小花取代, 表明拟南
芥 AG 基因的主要功能是促进雄蕊和心皮的发育,
并且抑制 AP1基因在花的第 3 轮和第 4 轮表达[21]。
本研究所得差异片段与大豆Gm13上 g29510.1cDNA
片段的同源性很高, 且在不育系 NJCMS2A 中表达
量很高, 而在保持系NJCMS2B中表达量很低, 推测
该基因与大豆细胞质雄性不育可能有关。
Murai等[22]、Meguro等[23]和 Hama等[24]分析粗
厚山羊草(Ae. crassa)细胞质的异质小麦农林 26的雄
蕊心皮化现象时发现, 该现象由 B 类 MADS-box 基
因表达模式的改变引起。孙清萍等[25]研究红莲型水
稻不育系花粉发育不同时期 MADS-box 基因家族的
表达差异, 发现 MADS-box 基因的表达明显受到细
胞质的影响, 认为 MADS-box 基因家族参与了水稻
细胞质不育和育性恢复的核质互作。袁自强等[26]在
研究水稻 MADS-box 基因与形态发生的关系时, 运
用 RT-PCR 方法从水稻珍汕 97B 的幼穗中分离和克
隆了两个 MADS-box 基因 nmads1 和 nmads3, 分子
杂交发现处在同一发育阶段的水稻幼穗中核质互作
雄性不育系珍汕 97A比其保持系珍汕 97B多一个特
异表达的 nmads1 璘的基因产物。周琳 等[27]在 YS型
小麦温敏雄性不育系中找到一个可能与育性转换相
关的 MADS-box 转录因子序列, 该基因在不育系的
幼穗中表达量较高, 在相应保持系的幼穗中表达量
较低, 表明其表达与小麦雄性不育的育性转换有关,
该基因的大量表达导致不育。本研究从大豆细胞质
雄性不育系 NJCMS2A 花蕾 cDNA 中克隆到的
MADS-box 基因片段, 在不育系 NJCMS2A 花蕾中
表达量很高, 而在保持系 NJCMS2B 花蕾中表达量
很低, 推测大豆细胞质雄性不育系 NJCMS2A 的不
育性可能与该 MADS-box基因的大量表达有关。
4 结论
分离得到一个差异表达片段, 它与 MADS-box
基因保守区有很高的同源性 , 证明是一个 MADS-
box 基因的转录因子, 在不育系 NJCMS2A 花蕾中
表达量很高, 而在保持系 NJCMS2B 花蕾中表达量
很低, 推测该差异片段可能与大豆细胞质雄性不育
有关。
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