全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(6): 911−917 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(30871523)和国家转基因植物研究与产业化专项(2008ZX08002-001)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 张增艳, E-mail: zhangzy@mail.caas.net.cn, Tel: 010-82108781
第一作者联系方式: E-mail: samuelzxy@126.com **共同第一作者
Received(收稿日期): 2009-12-29; Accepted(接受日期): 2010-03-29.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00911
小麦 TaPIM1基因的克隆及其转基因烟草的抗病性分析
周贤尧 1,2 董 娜 1,3,** 刘红霞 1 张怀渝 2 张增艳 1,*
1 中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部作物遗传育种重点开放实验室, 北京
100081; 2 四川农业大学植物遗传育种省级重点实验室, 四川雅安 625014; 3 河南科技学院, 河南新乡 453003
摘 要: TaPIM1是从小麦中克隆获得的 1个病原诱导的小麦MYB基因, 编码由 323个氨基酸残基组成的蛋白 TaPIM1。
TaPIM1具有 R2R3类 MYB转录因子的典型结构, 即 2个保守的 MYB DNA结合域(R2和 R3)、核定位位点和酸性激
活区。TaPIM1 的全长氨基酸序列与已克隆 MYB 蛋白的一致性仅为 43.69%以下, 为植物 MYB 转录因子家族 R2R3
亚群的一个新成员。小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)侵染可快速诱导抗病小麦中
TaPIM1 基因的上调表达, 说明 TaPIM1 可能参与小麦对纹枯病菌、根腐病菌的防御反应。将 TaPIM1 基因构建到由
组成型强启动子 CaMV35S控制的双子叶转化载体 pBI121上, 通过农杆菌介导法将其转入烟草 W38品系。通过卡那
霉素抗性筛选和 PCR 检测, 鉴定出转 TaPIM1 基因烟草 T0代株系 M66、M102、M110 等 12 个株系。对转基因烟草
T1代株系进行 PCR、RT-PCR分析和青枯病菌抗性分析, 结果表明, TaPIM1超量表达的转基因烟草株系 M66、M102
和M110对青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的抗性显著高于未转基因烟草对照, TaPIM1正向调控烟草对某些病原菌
的防御反应。
关键词: 小麦; MYB转录因子; 转基因烟草; 青枯病抗性
Cloning of Wheat TaPIM1 Gene and Analysis of Disease Resistance in TaPIM1
Transgenic Tobacco
ZHOU Xian-Yao1,2, DONG Na1,3,**, LIU Hong-Xia1, ZHANG Huai-Yu2, and ZHANG Zeng-Yan1,*
1 National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Crop Genetic and Breeding, Ministry of Agriculture/
Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2 State Key Laboratory of Plant Breeding and Genetics,
Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China; 3 Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China
Abstract: In plants, MYB transcription factors play various roles in developmental processes and in responses to biotic and
abiotic stresses. In this paper, a pathogen-induced MYB gene of wheat, TaPIM1, was isolated from cDNAs of wheat leaves inocu-
lated with Rhizoctonia cerealis. TaPIM1 gene encodes a protein TaPIM1 consisting of 323 amino acids. TaPIM1 protein contains
two MYB DNA binding domains (R2, R3), two nuclear localization sites and two transcription activation domains. The entire
sequence of TaPIM1 protein shares a low identity of below 43.69% with other plant MYB proteins. TaPIM1 is a new member of
R2R3 type of MYB transcription factors of transcription families. The transcript of TaPIM1 was obviously upregulated after chal-
lenge with fungal pathogens Rhizoctonia cerealis or Bipolaris sorokiniana, respectively. The gene transformation vector
pBI-35S:TaPIM1 was constructed, in which the TaPIM1 was driven by the CaMV 35S promoter. The vector pBI-35S:TaPIM1 was
transferred into tobacco cultivar W38 by Agrobacterium-mediated transformation method. Twelve TaPIM1 transgenic tobacco
lines, such as M66, M102 and M110, were obtained through screening. The T1 plants of these transgenic lines were subjected to
PCR, RT-PCR analyses and evaluated for Ralstonia solanacearum resistance. The results showed that three transgenic lines, in-
cluding M66, M102, and M110, overexpressed TaPIM1 and showed significantly enhanced resistance to R. solanacearum com-
pared with the host tobacco W38 plants. The resistance degree was correlated with the transcript level of the TaPIM1 in these
transgenic lines. These results suggested that TaPIM1 may positively modulate defense response to certain pathogens.
Keywords: Wheat; MYB transcription factor; Transgenic tobacco; Resistance to Ralstonia solanacearum
912 作 物 学 报 第 36卷
近年来, 由于耕作制度和气候条件等因素的改
变, 我国小麦生产区的土传真菌病害呈加重发生态
势。如由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)等引起的
小麦纹枯病已成为我国长江流域麦区、黄淮麦区的
主要病害之一, 一般造成减产 10%~30%, 严重地块
减产超过 50%。据全国农业技术推广总站报道 ,
2005—2008 年, 我国每年遭受纹枯病为害的麦田面
积约 670~800万公顷, 经济损失在数十亿元以上[1]。
由平脐蠕孢菌 Bipolaris sorokiniana (有性态为禾旋
孢腔菌 Cochliobolus sativus)等引起的小麦根腐病在
世界各国均有发生[2], 在我国以东北、西北麦区、黄
淮北片和华北麦区尤为严重, 一般减产 10%~30%。
选育和推广抗病小麦品种是控制上述病害最经济、
有效和安全的措施, 然而, 由于高抗纹枯病、高抗根
腐病的小麦种质匮乏、基础研究薄弱, 常规育种进
展缓慢。揭示小麦对纹枯病、根腐病的防御机制, 发
掘重要的抗病相关基因, 开辟抗纹枯病、根腐病的
小麦分子育种新途径非常重要。
尽管对小麦抗病反应机制知之甚少, 但是对拟
南芥等模式植物的抗病反应机制的大量研究表明 ,
植物为抵御各种病原微生物的侵袭 , 发展出多层
次、有效的抗病系统, 其中诱导防御反应即是植物
高级的主动防御反应。针对不同类型病原菌的侵袭,
植物采用不同的信号途径、防御反应, 调控最适的
防御基因的表达。抵抗活体营养型(biotrophic)真菌
和细菌的防御主要依赖于水杨酸(SA)信号途径, 对
腐生营养型 (necrotrophic) 真菌的抗性反应主要通
过茉莉酸、乙烯信号通路[3], 然而这些信号途径间存
在着复杂、精细的交互作用。一些植物 ERF、WRKY
和 MYB 等类型的转录因子, 在植物抗病反应信号
传递、防御基因调控中起着重要的作用[4]。目前, 已
对多种植物的 ERF、WRKY等转录因子在植物抗病
防御反应中的功能和作用机制开展了研究。如从小
麦中分离与抗病相关的 ERF 基因 [5-6]。关于植物
MYB转录因子功能的研究, 多集中于对色素合成、
生物钟、细胞形态建成、花粉发育、次级代谢、棉
纤维发育等生命活动的调控, 近年来从拟南芥分离
的抗病相关的 MYB 基因 AtBOS1(AtMYB108), 可抑
制 Botrytis cinere和 Alternaria brassicicolad等腐生
型病原真菌的生长[7]。
本研究利用 AtBOS1 同源的小麦 EST 序列作为
起始序列, 采用 RACE和 RT-PCR技术, 从纹枯菌处
理的抗病小麦品种山农 0431中, 分离病原诱导的小
麦 MYB转录因子编码基因 TaPIM1, 对其序列特征和
表达特性进行分析。并通过农杆菌介导法将 TaPIM1
基因转入烟草, 以研究转基因烟草的抗病功能。
1 材料与方法
1.1 植物材料及其处理
抗病小麦种质山农 0431, 由山东农业大学李斯
深教授馈赠; 小麦品种中国春(CS)由本课题组保存;
小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)由江苏省农业科
学院马鸿翔研究员提供; 烟草品种 W38, 由本实验
室保存 ; 小麦根腐菌(Bipolaris sorokiniana)由中国
农业科学院作物科学研究所李洪杰研究员提供。采
用 Zhang等[5]的方法, 在小麦二叶期接种纹枯病菌、
根腐菌, 于接种 0、3、6、12、24和 48 h收集材料,
以提取 RNA。
1.2 总 RNA提取与 cDNA的合成
利用Trizol Kit (Invitrogen)及其说明书提供的方
法提取小麦叶片总 RNA。cDNA 的合成按照第一链
cDNA合成试剂盒(Invitrogen)的操作说明进行。
1.3 TaPIM1全长 cDNA序列
根据拟南芥 AtBOS1(AtMYB108)即 At3g06490的
序列, 从 NCBI 数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
nucleotide/)中搜索到同源的小麦EST序列CN011324.1。
根据 CN011324.1 序列设计一对引物 MYB-40U/
MYB-L (表 1), 以纹枯病菌处理 12 h的山农 0431的
cDNA为模板进行 PCR扩增。扩增产物经克隆、测
序, 获得 5′端序列。按照 RACE 试剂盒(Invitrogen)
说明, 采用巢式 PCR 策略进行 3′ RACE, 扩增产物
经克隆, 测序, 获得 3′端序列。根据拼接的 TaPIM1
全长 cDNA 序列设计 1 对该基因特异性引物 MQC-
F/MQC-R (表 1), 以小麦纹枯菌处理的山农 0431的
cDNA 为模板进行 PCR 扩增、克隆、测序。获得含
TaPIM1全长开放阅读框(ORF)的 cDNA序列。
测序结果用 DNAMAN 和 DNAStar 软件分析,
核苷酸序列和推测的氨基酸序列在 NCBI 网站进行
BLAST分析。
1.4 转录表达分析
用小麦 actin (引物WACT-F/WACT-R)作为内标
基因使 cDNA 模板的起始浓度一致(即均一化), 然
后利用 TaPIM1 特异性引物(WMP-77U/WMP-491L)
进行 RT-PCR、实时荧光定量 RT-PCR(Q-RT-PCR)
分析。Q-RT-PCR反应体系为 1×SYBR premix Ex Taq,
1×ROX Reference DYE, 0.4 µmol L−1每条引物, 5 μL
第 6期 周贤尧等: 小麦 TaPIM1基因的克隆及其转基因烟草的抗病性分析 913
表 1 TaPIM1基因克隆与表达分析所用引物
Table 1 Sequences of primers in isolatiin and expression TaPIM1
引物
Primer
序列
Sequence (5′–3′)
用途
Application
AP GGCCACGCGTCGACTAGTACT17 3RACE第一轮扩增通用引物
AUAP GGCCACGCGTCGACTAGTAC 3RACE第二轮扩增通用引物
MYB-40U ACTCGCGTACGTCTTCCTGA 扩增目标基因 5 端序列
MYB-L TCCAGACTTGCCTGACGAC 扩增目标基因 5 端序列
M3R-1 ACGGACAACGAGGTCAAGAA 3RACE 第一轮扩增的基因引物
M3R-2 CAGAAGCACGCCAAGCAG 3RACE 第二轮扩增的基因引物
MQC-F ACTCGCGTACGTCTTCCTGA 目标基因全长序列扩增
MQC-R GCGCTCTAGTTAAGTTCATCGTC 目标基因全长序列扩增
WMP-77U CGGTGACGACAGAGGTAGC RT-PCR分析
WMP-491L CATCCAGACTTGCCTGACGA RT-PCR分析
WACT-F CACTGGAATGGTCAAGGCTG 小麦 RT-PCR分析
WACT-R CTCCATGTCATCCCAGTTG 小麦 RT-PCR分析
YC-ActF CGCCCTTCCTCATGCAAT 烟草 RT-PCR分析
YC-ActR TTAACATCGCGGACAATTTCC 烟草 RT-PCR分析
diluted cDNA, 扩增在 ABI PRISMR 7000L仪器上进
行, 扩增程序: 94℃预变性 3 min; 94 5 s, 60 31 s, ℃ ℃
48 个循环。采用 2−ΔΔCT方法[8]计算处理不同时间点
相对于未处理的目标基因的相对表达量。
1.5 转化载体的构建
将 TaPIM1基因的完整 ORF构建到双子叶植物
表达载体 pBI121上, 获得测序正确的克隆即为转化
载体 pBI121-TaPIM1。该载体中 TaPIM1基因的表达
受强组成型启动子 CaMV35S 调控, 此外还含有卡
那霉素抗性选择基因 npt II。
将 pBI121-TaPIM1质粒转入农杆菌 C58C1感受
态细胞。挑取单菌落用 YEP 培养基培养到对数期,
用 MS 培养基重悬到 A600为 0.5~0.6, 进行下一步的
侵染转化。
1.6 农杆菌介导法转化烟草及其再生苗的获得
采用圆盘法[9-10]转化烟草, 用含 pBI121-TaPIM1
质粒的农杆菌液侵染无菌烟草W38叶片; 将长至1 cm
以上的不定芽切下并转移到含卡那霉素的生根培养
基(1/2MS+NAA 0.1 mg L−1 +卡那霉素 50 mg L−1、羧苄
青霉素 500 mg L−1)上, 诱导生根, 获得再生的转基
因烟草苗。
1.7 转基因烟草 TaPIM1基因的分子分析
用 SDS 法小量提取转基因烟草叶片基因组
DNA。利用 TaPIM1 特异引物 WMP-77U 和 WMP-
491L对转基因烟草 T0和 T1代植株进行 PCR检测。
以烟草叶片第一链 cDNA 为模板, 烟草 actin
(引物 YC-ActF和 YC-ActR)做内对照将样品 cDNA浓
度均一化, 然后利用 TaPIM1 特异性引物 WMP-77U/
WMP-491L 进行半定量 RT-PCR 扩增, 以分析转基
因烟草中 TaPIMP1相对表达量。
1.8 转 TaPIM1基因烟草植株的抗病性鉴定
在消毒无菌烟草叶片的第 2 与第 3 叶脉之间,
用注射器接种青枯菌(R. solanacearum)悬液(浓度为
每毫升 107孢子)。接种后的叶片置接种盘内的 3 层
无菌滤纸上, 用保鲜膜将盘包裹, 25℃暗培养 6 d,
观察发病情况。叶片感染型(infection type, IT)分 5
级: 0级, 无明显症状; 1级, 注射区褪绿变黄; 2级,
注射区形成黄色坏死斑; 3级, 注射区形成褐色坏死
斑; 4级, 注射区坏死斑明显扩展或叶片萎蔫[11]。病
情指数=Σ(各级病株数×病级)/(调查总株数×最高级
值)×100。
将待接种的烟草叶片用自来水清洗后, 沥干水
分; 称取 3 g感染 TMV的烟草叶片加入 18 mL磷酸
缓冲液在研钵中研成匀浆, 用毛笔蘸匀浆均匀地刷
于已涂有 SiO2的烟叶表面, 10 min后用自来水冲洗
干净, 放于室温观察, 5 d后记载发病情况。
2 结果与分析
2.1 TaPIM1全长 cDNA克隆和和序列分析
用拟南芥 AtMYB108 (GenBank 登录号为 At3g
06490)序列搜索NCBI中 EST数据库, 找到与 AtMYB
108 同源的一条小麦 EST 序列(GenBank 登录号为
914 作 物 学 报 第 36卷
CN011324.1), 但是该 EST序列只是读码框 5′端的一
部分。根据这条小麦 EST 序列设计引物, 以纹枯病
菌处理的山农 0431 cDNA 为模板扩增出 553 bp 的
cDNA 片段, 序列分析结果表明该片段与小麦 EST
CN011324.1 的第 39~592 位脱氧核苷酸序列的一致
性达到 99.%, 与 AtMYB108同源, 即获得 TaPIM1基
因 5′端的第 1~553位脱氧核苷酸序列。采用 3′ RACE
和巢式 PCR 扩增策略, 克隆、获得 TaPIM1 基因第
481~1 117位脱氧核苷酸序列。将上述获得序列进行
体外拼接, 获得一个 1 156 bp的序列, 其第 85~1 056
位脱氧核苷酸为完整的开放阅读框(ORF), 编码 323
个氨基酸。利用设计的引物进行 RT-PCR扩增, 得到
期望长度的产物, 经克隆、测序分析, 其序列与体外
拼接的全长 cDNA序列 100%一致, 可认为已克隆到
目标基因, 将其命名为 TaPIM1 (GenBank 登录号为
EF587267.1)。
TaPIM1基因 ORF所编码的蛋白 TaPIM1, 分子
量为 35.5 kD, 等电点为 6.04。如图 1所示, TaPIM1
蛋白具备 R2R3类 MYB转录因子的典型特征, 包含
2个 MYB-DNA-binding结构域(R2和 R3)、2个酸性
转录激活区(一个位于自氨基端的第 15~60位氨基酸;
另一个位于自氨基端的第 288~320位氨基酸)和 2个
碱性核定位信号区(一个位于自氨基端的第 80~89位
氨基酸; 另一个位于自氨基端的第 142~150 位氨基
酸), R2 结构域位于自氨基端的第 47~94 位氨基酸,
R3结构域位于自氨基端的第 100~145位氨基酸。氨
图 1 TaPIM1与其他 MYB蛋白全长氨基酸序列的同源性比较
Fig. 1 Alignment of full-length amino acid residues among TaPIM1 and other MYB proteins
黑色示 100%同源性, 深灰色示 75%同源性, R2R3结构域用下画线表示。
Black and dark-gray boxes represent 100% and 75% similarity, respectively. R2R3 domain in MYB protein was underlined.
第 6期 周贤尧等: 小麦 TaPIM1基因的克隆及其转基因烟草的抗病性分析 915
基酸序列同源比对分析结果表明, TaPIM1的 R2、R3
保守域序列与其他 MYB 转录因子的具有较高的序
列一致性, 但其全长序列的一致性却非常有限, 如与
OsJAMYB的一致性最高, 仅为 43.69%, 与 AtMYB78
(NP-199773)、OsCPM7(BAB18296)、AtMYB108(NP-
187301)和AtMYB2(BAA03534)全长序列的一致性分别
为 41.78%、41.34%、40.11%和 38.39%, 与 GenBank中
登录的其他小麦MYB蛋白, 如 TaMYB1(DQ353858)、
TaMYB2(AB252145)和 TaMYB3(AB252146)序列的
一致性也较低, 分别为 21.06%、23.08%和 26.32%。
因此, TaPIM1 是植物 MYB 转录因子家族的一个新
成员。
2.2 TaPIM1基因的表达分析
TaPIM1的转录表达受小麦根腐菌、纹枯病菌诱
导上调表达。在正常情况下, TaPIM1表达量较低, 在
接种小麦根腐菌、纹枯病菌后表达量升高。接种小
麦根腐菌 6 h后 TaPIM1的表达出现第一次高峰, 较
接种前提高 2 倍, 随后表达下降, 在接种 48 h 出现
第二次表达高峰, 较接种前提高 10 倍(图 2-A); 而
TaPIM1对小麦纹枯病菌响应稍弱, 在纹枯病菌接种
12 h后出现诱导表达高峰(图 2-B), 较接种前提高约
图 2 受小麦根腐菌(A)、纹枯病菌(B)诱导小麦中 TaPIM1表达模式
Fig. 2 Expression patterns of TaPIM1 in wheat challenge with
B. sorokiniana (A) or R. cerealis (B)
相对表达量指某一接种点相对于未处理(0 h)的目标基因表达变
化倍数。误差棒指 3次重复间平均标准误。
Relative expression of the target gene indicates the changing fold of
the transcript over the control (0 h). The error bars indicate average
SE of three biological replicates.
2倍, 说明 TaPIM1可能参与小麦对根腐菌、纹枯病
菌的防卫反应。
2.3 转 TaPIM1基因烟草的分子检测
用 TaPIM1 特异引物进行 PCR 检测表明, 阳性
对照(转 TaPIM1 基因载体质粒 DNA)和转基因植株
中扩增出了大小相同的特异性片段, 而阴性对照植
株(未转基因烟草、转基因受体 W38)中没有扩增出
相应片段, 说明 TaPIM1已转入这些烟草植株。经过
卡那霉素筛选和 PCR 检测, 得到转 TaPIM1 基因阳
性烟草 T0株系 12 个。在这些转基因株系 T1代植株
中仍可扩增出 TaPIM1 特异性片段(图 3), 说明该基
因能在转基因烟草中遗传。
图 3 转 TaPIM1基因烟草 T1代植株的 PCR检测
Fig. 3 PCR analysis of TaPIM1 transgenic tobacco T1 plants
WT: 野生型烟草; P: pBI121-TaPIM1; 1~9: 转基因植株。
WT: wild type; P: pBI121-TaPIM1; 1–9: transgenic wheat plants.
抗病的转基因烟草植株 M110、M66、M102 中
TaPIM1 转录水平明显高于未转基因烟草 W38 植株
对照, 且 TaPIM1 基因表达量与抗病性提高呈正比
(图 4)。
图 4 野生型和抗病转基因烟草株系中 TaPIM1表达量的半定量
RT-PCR分析
Fig. 4 Expression of TaPIM1 in wild type and resistant trans-
genic tobacco plants
WT: 野生型烟草; M110、M66、M102: 转基因植株。
WT: wild type tobacco plant; M110, M66, and M102: transgenic
tobacco plants.
916 作 物 学 报 第 36卷
2.4 转 TaPIM1基因烟草植株的抗病性
转 TaPIM1 基因烟草 T1代植株 M110、M66 和
M102 对青枯病菌表现出较好的抗性, 叶片不发病
或在接种的两条叶脉间形成坏死斑, 但病斑并不扩
展(图 5), 其中 M110 和 M66 对青枯病的平均 IT 分
别为 0.5级和 0.8级, 病情指数 14.17和 18.33; M102
株系对青枯病的平均 IT为 2.1级, 病情指数 52.5, 而
未转基因烟草 W38的病情指数 97.5, 叶片上病斑严
重扩散, IT为 4级(图 5), 不同株系的 TaPIM1表达量
高低与其抗性程度成正比, 说明转入 TaPIM1 基因在
烟草内的有效表达, 可增强烟草对青枯病的抗性。
图 5 转 TaPIM1基因烟草 T1代和受体对照的青枯病抗性
Fig. 5 Resistance to R. solanacearum inTaPIM1 transgenic
tobacco
WT: 野生型烟草; M110、M66、M102: 转基因植株。
WT: wild type tobacco plant; M110, M66, and M102: transgenic
tobacco plants
与转基因烟草受体 W38 相比, 转 TaPIM1 基因
植株对 TMV 的侵染没有表现明显抗性提高, 说明
TaPIM1基因的超量表达不能增强烟草的 TMV抗性。
3 讨论
植物转录因子在植物生长发育和对生物胁迫、
非生物胁迫应答中发挥着重要作用[12-18]。近年来研
究发现, 拟南芥 MYB 蛋白 AtMYB108, 可抑制 B.
cinere和 A. brassicicolad等土传病原真菌的生长, 还
参与抗逆反应[7]。还发现水稻 MYB蛋白 OsJAMYB
参与宿主抵御真菌侵染的反应[18]; 但目前未见与抗
性相关的小麦 MYB 类转录因子的克隆以及功能研
究的报道。为研究抗土传病原菌相关的小麦 MYB
转录因子, 本文利用与拟南芥 AtMYB108 同源的小
麦 EST序列和 RT-PCR、RACE技术, 从小麦中分离
出 1个抗性相关的 MYB转录因子编码基因 TaPIM1
的全长 cDNA 序列 , 其编码蛋白 TaPIM1 具有
R2R3-MYB转录因子的典型结构特点, 是植物MYB
转录因子家族的一个新成员。TaPIM1蛋白与其他植
物抗性相关的MYB蛋白(如 OsJAMYB、AtMYB108)
进化关系比较密切, 与其他小麦 MYB 蛋白进化关
系远, 说明植物 MYB 的功能分化可能发生在植物
物种分化之前。
本研究结果表明, TaPIM1基因的表达能够被小
麦根腐病菌、纹枯病菌快速诱导, 可能参与小麦对
根腐菌、纹枯病菌的防御反应。为了快速分析
TaPIM1 基因的功能, 创制了转 TaPIM1 基因烟草株
系。TaPIM1基因超量表达可以显著增强转基因烟草
株系 M102、M66、M110 对烟草青枯病的抗性, 证
明 TaPIM1可正向调控植物对某些病原菌的防御反应。
然而, TaPIM1基因在小麦中是否正向调控寄主对根
腐病菌、纹枯病菌的防御反应还有待进一步研究。
4 结论
从小麦中克隆出 1 个抗性相关的 MYB 转录因
子编码基因 TaPIM1的全长序列。TaPIM1蛋白是植
物 MYB转录因子家族的一个新成员。TaPIM1基因
的表达能够被小麦根腐菌、纹枯病菌快速诱导。创
制了转 TaPIM1 基因烟草, TaPIM1 超量表达提高了
转 TaPIM1基因烟草植株叶片对青枯病菌的抗性。
References
[1] Chen L, Zhang Z Y, Liang H X, Liu H X, Du L P, Xu H J, Xin Z
Y. Overexpression of TiERF1 enhances resistance to sharp eye-
spot in transgenic wheat. J Exp Bot, 2008, 59: 4195–4204
[2] Kumar J, Schäfer P, Hückelhoven R, Langen G, Baltruschat H,
Stein E, Nagarajan S, Kogel K. Bipolaris sorokiniana, a cereal
pathogen of global concern: cytological and molecular approaches
towards better control. Mol Plant Pathol, 2002, 3: 185–195
[3] Glazebrook J. Contrasting mechanisms of defense against
biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu Rev Phytopathol,
2005, 43: 205–227
[4] López M A, Bannenberg G, Castresana C. Controlling hormone
signaling is a plant and pathogen challenge for growth and sur-
vival. Curr Opin Plant Biol, 2008, 11: 420–427
[5] Zhang Z Y, Yao W L, Dong N, Liang H X, Liu H X, Huang R F.
A novel ERF transcription activator in wheat and its induction
kinetics after pathogen and hormone treatments. J Exp Bot, 2007,
58: 2993–3003
[6] Dong N(董娜), Zhang Z-Y(张增艳), Xin Z-Y(辛志勇). Isolation
and expression analysis of a pathogen-induced ERF gene in Triti-
cum aestivum L. Sci Agric Sin (中国农业科学), 2008, 41(4):
946–953 (in Chinese with English abstract)
[7] Mengiste T, Chen X, Salmeron J, Dietrich R. The BOTRYTIS
SUSCEPTIBLE1 gene encodes an R2R3 MYB transcription fac-
tor protein that is required for biotic and abiotic stress responses
in Arabidopsis. Plant Cell, 2003, 15: 2551–2565
第 6期 周贤尧等: 小麦 TaPIM1基因的克隆及其转基因烟草的抗病性分析 917
[8] Livak K, Schmittgen T. Analysis of relative gene expression data
using real-time quantitative PCR and the 2−∆∆CT method. Methods,
2001, 25: 402–408
[9] Hoekema P, Hirsch P, Hooykaas R, Schilperoort A. A binary
plant vector strategy based on separation of vir and T-region of
the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature, 1983, 303:
179–180
[10] Zhang H B, Zhang D B, Chan J, Yang Y H, Huang Z J, Huang D
F, Wang X C, Huang R F. Tomato stress-responsive factor TSRF1
interacts with ethylene responsive element GCC box and regu-
lates pathogen resistance to Ralatonia solanacearum. Plant Mol
Biol, 2004, 55: 825–834
[11] Yang Y-C(杨友才), Zhou Q-M(周清明), Zhu L-S(朱列书). On
tobacco varieties resistance and resistance heredity to bacterial
wilt (Ralastonia solanacearum). J Hunan Agric Univ (Nat Sci
Edn)(湖南农业大学学报·自然科学版), 2005, 31(4): 381–383 (in
Chinese with English abstract)
[12] Wang X-Q(王希庆), Chen B-J(陈柏君), Yin L-P(印丽萍). The
plant MYB transcription factors. Biotechnol Bull (生物技术通
报), 2003, (2): 22–25 (in Chinese with English abstract)
[13] Eulgem T, Somssich I. Network of WRKY transcription factors in
defense signaling. Curr Opin Plant Biol, 2007, 10: 366–371
[14] Huang Z-J(黄泽军), Huang R-F(黄荣峰), Huang D-F( 昉黄大 ).
ERF transcription factors and their roles in plant defense re-
sponses. Acta Phytopathol Sin (植物病理学报), 2004, 34(3):
193–198 (in Chinese with English abstract)
[15] Zhang G, Chen M, Chen X, Xu Z, Guan S, Li L C, Li A, Guo J,
Mao L, Ma Y. Phylogeny, gene structures, and expression pat-
terns of the ERF gene family in soybean (Glycine max L.). J Exp
Bot, 2008, 59: 4095–4107
[16] Zuo K J, Qin J, Zhao J Y, Ling H, Zhang L D, Cao Y F, Tang K X.
Over-expression GbERF2 transcription factor in tobacco en-
hances brown spots disease resistance by activating expression of
downstream genes. Gene, 2007, 391: 80–90
[17] Liang H, Lu Y, Liu H, Wang F, Xin Z, Zhang Z. A novel activa-
tor-type ERF of Thinopyrum intermedium, TiERF1, positively
regulates defence responses. J Exp Bot, 2008, 59: 3111–3120
[18] Lee M W, Qi M, Yang Y. A novel jasmonic acid-inducible rice
myb gene associates with fungal infection and host cell death.
Mol Plant Microbe Interact, 2001, 14: 527–535