全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(8): 1389−1397 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08002-002), 北京市自然科学基金项目(5102016), 北京市科技新星计划项目
(2007B056, 2008B035)和北京农林科学院院青年基金项目资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 赵昌平, E-mail: zhaochangping401@vip.sohu.com, Tel: 13601096398
第一作者联系方式: E-mail: yiyun_xiang@163.com, Tel: 15101151522 **共同第一作者
Received(收稿日期): 2010-12-11; Accepted(接受日期): 2011-03-06; Published online(网络出版日期): 2011-05-12.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110512.1815.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01389
小麦 TaCRF2基因的克隆及其在烟草中的初步功能验证
郭丽香 1,2 高世庆 2,** 唐益苗 2 王永波 2 刘美英 3 张 朝 3 徐 蓓 1,2
赵昌平 2,*
1 首都师范大学生命科学学院, 北京 100048; 2 北京市农林科学院杂交小麦工程技术研究中心, 北京 100097; 3 中国科学技术大学研究
生院化学系, 安徽合肥 230026
摘 要: 通过 RT-PCR方法从小麦 cDNA中扩增获得 1个锌指蛋白基因 TaCRF2, 该基因的 cDNA长度为 843 bp, 序
列分析表明它编码 1 个含有 280 个氨基酸的蛋白质。在线软件预测该蛋白质的相对分子质量为 30.97 kD, 等电点为
7.03, 且在 C-末端含有 1个典型的 RING-H2型锌指蛋白结构域, 在 N-末端含有 2个跨膜结构域。氨基酸序列比对发
现, TaCRF2与水稻中 1个 RING型锌指蛋白(ABF95226)的相似度为 82%。亚细胞定位分析显示, 该蛋白分布在细胞
核和细胞膜上。real-time RT-PCR表达特性分析显示, TaCRF2基因的表达受干旱、高盐和外源 ABA的强烈诱导, 低温对
该基因的表达量影响不明显。初步功能验证发现过表达 TaCRF2基因增强了转基因烟草对干旱和高盐胁迫的耐性。
关键词: 烟草; 小麦; RING-H2型锌指蛋白; TaCRF2基因; 干旱胁迫; 盐胁迫
TaCRF2 Gene Isolation from Triticum aestivum and Primary Function Valida-
tion in Tobacco (Nicotiana tabacum L.)
GUO Li-Xiang1,2, GAO Shi-Qing2,**, TANG Yi-Miao2, WANG Yong-Bo2, LIU Mei-Ying3, ZHANG Zhao3,
XU Bei1,2, and ZHAO Chang-Ping2,*
1 College of Life Sciences, Capital Normal University, Beijing 100048, China; 2 Beijing Hybrid Wheat Engineering and Technology Research Center,
Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China; 3 Department of Chemistry, Graduate School of University of Science
and Technology of China, Hefei 230026, China
Abstract: Wheat, like other crops, suffers from drought, salt, low-temperature and other abiotic stresses, seriously resulting in
yield decline. It is an effective way for crop breeding to improve resistance via molecular biology techniques. Zinc finger protein,
an important transcription factor commonly found in plant, can regulate the expression of multiple stress-inducible genes and
enhance comprehensive resistances effectively. In this study, a RING-H2 zinc finger protein gene, designated as TaCRF2, was
isolated from Triticum aestivum by RT-PCR. Its cDNA was 843 bp and encoded a putative protein of 280 amino acids with a pre-
dicted molecular mass of 30.97 kD and an isoelectric point (PI) of 7.03. A typical RING-H2 finger domain was found at the
C-terminal region of TaCRF2 protein, and two transmembrane domains were found at the N-terminal region. Alignment of amino
acid sequence showed that TaCRF2 was 82% identical to Oryza sativa putative RING zinc finger protein ABF95226. Subcellular
localization analysis showed that the TaCRF2 was expressed in both nuclear and cytoplasm membrane. real-time PCR showed that
the transcript of TaCRF2 was strongly induced by drought, salinity and cold to some extent. The TaCRF2 gene was transformed
into tobacco cultivar Wisconsin 38 (W38) by Agrobacterium mediated under the control of the CaMV 35S promoter. Under
drought, salt and low-temperature stresses, transgenic tobacco lines carrying TaCRF2 gene developed the strong primary root,
more lateral root and smaller yellow leaves, and performed higher tolerance to these stresses than the wide-type tobaccos, The
primary function verification showed that overexpression of TaCRF2 gene in tobaccos enhanced their tolerance to drought and
salinity stresses. This study will help further research of wheat RING-H2 type zinc finger protein reactions in the role of stress
resistance, and bring wheat resistance breeding excellent candidate genes.
Keywords: Tobacco; Triticum aestivum; RING-H2 zinc-finger protein; TaCRF2 gene; Drought stress; Salinity stress
1390 作 物 学 报 第 37卷

高盐、干旱和低温等非生物逆境胁迫是影响植
物生长发育和产量的重要限制因子。高等植物为了
抵抗这些逆境, 在长期的进化过程中, 形成了许多
复杂的防御机制。这种防御机制往往是通过一系列
感知和传导逆境信号的分子来实现的 , 如转录因
子、酶和离子通道等[1]。转录因子(transcription factor,
TF), 又称反式作用因子(trans-acting factor), 是指能
够与基因启动子区域中顺式作用元件 (cis-acting
element)发生特异性相互作用的结合蛋白 , 该蛋白
通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用
激活或抑制特定基因的转录, 在抗逆基因表达调控
中起着重要作用[2]。研究表明, 锌指蛋白作为一类转
录因子广泛地参与基因表达的调控。锌指蛋白最初
于 1983年在非洲爪蟾卵母细胞的转录因子 TFIIIA
中被发现[3-4], 是迄今在真核生物基因组中分布最广
的一类蛋白。它的得名是由于其结构特征, 几个保
守的氨基酸(一般为 Cys和 His)与一个或多个锌离子
结合, 形成一个在蛋白质中相对独立的区域。锌指
基序无论在结构还是功能上都是多样的, 它不仅可
以结合 DNA 和 RNA, 还能与 DNA-RNA 杂交双链
分子以及其他锌指蛋白或自身结合, 也可以通过和
膜的结合来起作用[5]。根据保守基序的特点, 可以将
锌指蛋白分为 C2H2 型、C8 型、C6 型、C3HC4 型
(RING型)、C2HC型、C2HC5型(LIM型)、C4型、
C3H型和 C4HC3型 9类[6]。
RING 型锌指目前被界定为一种新的锌指结构
域, 分离得到的第一个 RING 型锌指蛋白基因为人
类 Really Interesting New Genes 1(RING1), 它参与多
种信号转导途径和调控途径[7]。RING型锌指蛋白又
分为 RING-HC(C3HC4)和 RING-H2(C3H2C3)两个
亚类[8]。RING-HC本身含有 40~60个氨基酸残基, 其
保守序列为 Cys-X2-Cys-X(9–39)-Cys-X(1–3)-His-
X(2–3)-Cys-X-Cys-X-Cys-X-Cys, 其中 X 代表任意
氨基酸[9]。RING-H2基序与 RING-HC的不同在于第
4个半胱氨酸残基变为组氨酸残基 [10]。目前 , 在动
物、植物和微生物等各种生物体中已经分离得到了
许多 RING 型锌指蛋白。一些 RING 型锌指蛋白被
认为参与转录调控的某些过程和蛋白与蛋白的相互
作用[11]。研究显示, 许多 RING 型锌指具有泛素连
接酶 E3 活性, 可以和泛素结合酶 E2 特异性反应,
从而促进泛素化。为了保护自身的结构不被破坏 ,
细胞内的蛋白降解必须具有高度的选择性 , 因此 ,
RING型锌指的泛素连接酶 E3活性介导的泛素化对
于细胞具有至关重要的作用[12]。
小麦是世界上主要的粮食作物[13], 随着世界人
口的不断增长, 保持粮食产量与世界人口同步增长
是对人类的一个重要挑战。小麦和其他的作物一样
容易受干旱、高盐、低温等非生物胁迫的危害从而
严重降低产量[14]。因此, 提高小麦的抗逆性对于农
业生产具有重要的意义。分子生物学技术的迅速发
展和广泛应用, 使基因工程技术成为作物抗逆育种
的一条有效途径。锌指蛋白作为一种重要的转录因
子普遍存在于植物中, 可以同时调控多个逆境诱导
基因的表达, 因此, 通过增强一个相关锌指蛋白转
录因子的作用, 就可以促使多个功能基因发挥作用,
从而使植物的抗逆性状获得综合改良的效果。
目前, 对植物中锌指蛋白家族的研究主要集中
在 C2H2型, 对 RING型锌指的研究比较少, 尤其是
对小麦中 RING-H2型锌指的研究更鲜有报道。本研
究利用同源克隆的方法, 从小麦中克隆到了 1 个新
的 RING-H2型锌指蛋白基因。通过对该基因进行序
列分析、亚细胞定位研究、real-time RT-PCR表达特
性分析以及在模式植物烟草中进行逆境胁迫下的耐
性鉴定, 以明确该基因的生理生化特点和功能, 从
而为深入解析小麦中 RING-H2 型锌指蛋白的功能
及其在小麦抗逆分子育种中的应用奠定理论和实践
基础, 同时为小麦抗逆分子育种提供优良抗逆候选
基因。
1 材料与方法
1.1 植物材料与逆境胁迫
取小麦(Triticum aestivum L.)品种京花 9号的种
子(由北京市农林科学院杂交小麦工程技术研究中
心提供), 以 70%酒精表面消毒, 蒸馏水冲洗 3 次后
浸种培养到露白 (2~3 d), 播种在花盆中置室温培
养。待 10 d 左右, 将小麦幼苗从花盆中移出, 洗净
根部(注意避免对其造成机械损害), 用吸水纸吸干
水分, 取出一部分用锡箔纸包裹好于液氮中速冻作
为对照, 其余进行相关胁迫处理。盐胁迫处理是将
洗净小麦的根部于 250 mmol L–1 NaCl溶液中分别
处理 1、2、5、10 和 24 h; 干旱胁迫处理是将洗净
的小麦幼苗置于吸水纸上分别放置上述时间段 ;
ABA处理是将洗净的小麦根部于 50 μmol L–1 ABA
溶液中分别处理上述 5个时间段 ; 对于冷处理 , 是
在 4℃冰箱将根部置蒸馏水分别处理上述时间。另
外, 在常温下取部分根在蒸馏水中分别浸泡上述时
第 8期 郭丽香等: 小麦 TaCRF2基因的克隆及其在烟草中的初步功能验证 1391


间段作为对照。每次胁迫处理后的材料用锡箔纸迅
速包好置液氮中速冻, –80℃冰箱保存备用。
1.2 总 RNA的提取和 cDNA第一链的合成
按 Trizol试剂盒(购自北京天根生化科技有限公
司)使用说明, 提取上述胁迫处理的小麦京花 9 号的
总 RNA。取 2 μg总 RNA用于 cDNA第一链的合成
(具体方法参见 TaKaRa相关试剂盒说明书)。
1.3 TaCRF2的克隆与序列测定
以小麦 cDNA文库中的一段 EST序列为信息探
针, 搜索位于 GenBank 的小麦 EST 库, 通过同源比
对, 寻找与之部分序列完全一致的 EST 序列用于构
建 EST 重叠群, 并根据最终拼接序列设计 1 对特异
性 PCR 引物 F: 5′-CACCATGAGCTTTGTGTTCCG
G-3′, R: 5′-TTACACCATGTCATCCATTTCACCG-3′
(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。利
用该对引物 , 以上述制备好的小麦京花 9 号的
cDNA为模板进行 PCR扩增。PCR条件(利用 DOWN
程序)为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 45 s, 64 (℃ 开始
下降)退火 45 s, 72℃延伸 1 min, 共 12个循环, 每个
循环降 0.7 ; 94℃ ℃变性 45 s, 58℃退火 45 s, 72℃延
伸 1 min, 共 30个循环; 最后 72℃延伸 10 min。用
1%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物, 目的条带经
胶回收(方法参见Axygen胶回收试剂盒说明书)纯化
后连接到 pMD18-T Simple载体(购自 TaKaRa公司)
上, 转化到大肠杆菌 TOP10 (购于北京天根生化科
技有限公司)中扩大培养提取质粒, 送北京三博远志
生物有限公司测序。
1.4 目标基因序列生物信息学分析
用 DNAStar 和 DNAMAN 软件进行序列分析,
预测目标 cDNA 编码的蛋白质, 将氨基酸序列提交
到 NCBI 上进行 Blast, 分析序列的开放阅读框和保
守域, 用 ClustalX 和 MEGA4 软件对蛋白序列进行
多重比对和进化分析。利用在线工具 TMHMM
V2.0、SignalP V3.0、SMART V4.0[15]等分析 TaCRF2
蛋白是否含有跨膜区、信号肽。利用 Calculation of
protein isoelectric point预测蛋白的分子质量和等电
点。
1.5 TaCRF2编码蛋白的亚细胞定位分析
利用 Primer 5.0 软件, 设计 1 对特异性引物
5′-CCCAAGCTTATGAGCTTTGTGTTCCGGTGC-3′
(含 Hind III 酶切位点)和 5′-CGCGGATCCCACCAT
GGCATCCATTTCG-3′(含 BamH I 酶切位点), 扩增
得到的 PCR产物连到 pMD18-T Simple载体上转化
到大肠杆菌 TOP10 中进行测序(测序由北京三博远
志生物有限公司完成)。将 TaCRF2基因的编码区测
序结果正确的克隆以及 163GFP 空载体用 Hind III
和 BamH I双酶切后进行过夜连接。连接产物转化到
大肠杆菌 TOP10 中, 阳性克隆经酶切和测序验证,
获得融合载体 163GFP-TaCRF2。利用基因枪轰击
法[16]将融合载体转化到洋葱表皮细胞中, 用激光共
聚焦显微镜观察, 以不含目的基因的 163GFP 空载
体作对照, 重复实验 3次。
1.6 TaCRF2基因的表达特性分析
将不同胁迫处理的 RNA 样品反转录成 cDNA,
稀释 20 倍后作为 real-time RT-PCR 的模板。在
TaCRF2 的非保守区设计引物(F: 5′-GCACCAGATG
TCTCCGAACT-3′和 R: 5′-TCATAGAAGGAGCATG
TGGG-3′), 对不同处理的样品进行 real-time RT-PCR,
分析该基因对干旱、高盐、低温和外源 ABA等处理
的应答表达情况, 以小麦京花 9号的 Actin基因做内
参对照(F: 5′-TACTCCCTCACAACAACCG-3′和 R:
5′-AGAACCTCCACTGAGAACAA-3′)。根据 SYBR
Green试剂盒(购自 TaKaRa公司)操作说明配制反应
体系, 每个样品设 3 个重复。反应体系含 2×SYBR
Premix Ex Taq 10 μL, 稀释 20倍的 cDNA 2 μL, 正、
反引物(10 μmol L–1)各 0.5 μL, ddH2O 7 μL, 总体积
为 20 μL。反应程序为 95℃预变性 30 s; 95℃变性 5 s,
60℃退火 20 s, 共 40 个循环。在 Roche Light Cy-
cler480 实时定量 PCR 仪上进行操作。采用 2–ΔΔCt
算法[17]分析实验结果, 其中 ΔΔCt=(待检样品目的基
因平均 Ct值–待检样品看家基因平均 Ct值)Timex–(对
照组目的基因平均 Ct 值–对照组看家基因平均 Ct
值)Time0。Timex 和 Time0 分别代表处理的不同时间点
(胁迫处理 1、2、5、10和 24 h)和对照(胁迫处理 0 h)。
1.7 目标基因转化烟草
为了分析过表达 TaCRF2 对转基因烟草在干旱
和高盐胁迫下的耐受性影响, 利用 Primer 5.0 软件,
设计 1 对特异性引物 5′-CCCCCGGGATGAGCTT
TGTGTTCC-3′ (含 Sma I酶切位点)和 5′-CTAGACTA
GTTTACACCATGGCATCCATTTC-3′ (含 Spe I酶切
位点), 扩增 TaCRF2 的开放阅读框。PCR 产物连到
pMD18-T Simple 载体上转化到大肠杆菌 TOP10 中
进行测序 (测序由北京三博远志生物有限公司完
成)。将测序结果正确的克隆以及空载体 pBI35S 用
Sma I和 Spe I双酶切后过夜连接。连接产物转化到
大肠杆菌 TOP10 中, 阳性克隆经酶切和测序验证,
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获得融合载体 pBI35S-TaCRF2。通过农杆菌介导
法[18]将目标基因转化到烟草中。提取在 1‰ Kan筛
选培养基上长势较好的烟草叶片的DNA做模板, 设
计引物(F: 5′-ATGAGCTTTGTGTTCCGGTGCAG-3′;
R: 5′-TTACACCATGGCATCCATTTCGCT-3′), 通过
PCR 的方法筛选阳性植株, 本实验共筛选出 9 个抗
性转基因烟草株系, 编号为 A、B、C、D、E、F、G、
H、I。同时检测未转基因的野生型烟草作为对照。
1.8 转基因烟草对干旱和高盐的耐受性检测
为了测试转基因烟草对干旱和高盐胁迫的耐受
性, 将在 1/2MS 培养基中生长大小一致的转基因阳
性烟草幼苗分别转接到含有 5% PEG 和 300 mmol
L–1 NaCl的 1/2MS培养基中于 25 , 16 h℃ 光照、8 h
黑暗的培养间进行胁迫处理。对未转基因的野生型
烟草进行同样的处理作为对照。定期观察转基因烟
草和野生型烟草在胁迫培养基上的生长状况, 比较
转基因烟草在叶片的保绿性和根的生长状况上的差
别并拍照记录。
2 结果与分析
2.1 TaCRF2基因的克隆及序列分析
利用设计的 1对特异性 PCR引物, 从小麦京花
9号幼苗的 cDNA中扩增出了 1条 843 bp的 PCR产
物 , 命名为 TaCRF2。TaCRF2 的测序结果通过
DNAStar和DNAMAN的分析, 在NCBI上作氨基酸
序列的 BLAST, 确定其为基因全长, 包括完整的开
放阅读框 , 共编码 280 个氨基酸 (图 1-A)。利用
Calculation of protein isoelectric point 和 TMHMM
Server V. 2.0预测该蛋白质的相对分子质量为 30.97
kD, 等电点为 7.03, 在接近 C-端的第 36~53 和第
63~82位之间有 2个跨膜区(图 1-C)。
利用 SMART V4.0软件分析发现, TaCRF2蛋白
氨基酸序列第 221~261 位之间含有 1 个保守的结构
域(图 1-B)。该结构域是 1 个环指结构域 (RING
finger), 一般由 40~60个氨基酸组成, 是 1个富含半
胱氨酸的基序, 可以与 2 个锌离子以 1 种特异的交
叉联结体系结合。由于锌离子的螯合作用, 此区域
形成了 1 个公共的疏水核心, 而在保守的连接区之
间变化的序列则提供了蛋白相互识别、相互作用的
特异性[19]。
2.2 TaCRF2蛋白的系统进化树分析
从拟南芥和水稻基因组数据库中搜索到具有
RING finger保守域序列的基因 12个, 利用 ClustalX
2.0和MEGA 4软件构建系统进化树, 结果显示共分
为 3组(图 2)。第 1组包括来自水稻的 6个和来自拟
南芥的 1个锌指蛋白, 分别为 OsRHC1、OsRHC6、
OsRHC19、OsRHC21、OsRHC25、OsRHC28 和
AtSHA1; 第 2 组包括 2 个拟南芥的锌指蛋白, 分别
为 AtPRT1 和 AtCOP1; 第 3 组包括 2 个水稻的和 1
个拟南芥的锌指蛋白, 分别为 OsRHC22、OsRHC29
和 AtSDIR1, TaCRF2 归为这一组, 与 AtSDIR1、
OsRHC29的亲缘关系最近。
2.3 TaCRF2在洋葱表皮中的亚细胞定位分析
利用基因枪法将绿色荧光蛋白(GFP)基因转到
洋葱表皮细胞中 , 获得高效瞬时表达。结果表明 ,
TaCRF2 基因在细胞核和细胞膜上均有表达(图 3)。
一般转录因子为核定位蛋白, RING型锌指蛋白作为
一种转录因子也大都定位在核中, 既定位在核中又
定位在细胞膜上的情况报道较少, 推测该基因在核
外也有分布, 可能与其有 2个跨膜域有关。
2.4 TaCRF2基因的表达特性分析
将提取的各种胁迫处理材料的 RNA 作为模板,
采用 real-time PCR的方法检测了 TaCRF2基因的表
达特性(图 4)。发现干旱处理 5 h时, TaCRF2基因的
表达量开始显著增高 , 随着干旱胁迫时间的增加 ,
表达量逐渐增高, 24 h 时达到最高; 高盐和脱落酸
处理后, TaCRF2基因的表达情况与干旱处理的基本
相同, 从图中可以看出, 该基因受脱落酸的诱导表
达显著; 低温胁迫后, 该基因的表达量变化不明显,
但可以发现随着胁迫时间的增加, 该基因的表达量
有增加的趋势; 水处理后, 该基因的表达量基本没有
变化, 排除了水胁迫对该基因的表达可能产生的影
响。以上结果显示, TaCRF2基因主要受干旱、高盐和
脱落酸的诱导, 同时对低温也有所响应。表明 TaCRF2
基因受多种胁迫因子的诱导途径, 可能涉及多种逆境
胁迫信号传导, 其中对 ABA的胁迫反应显著, 说明该
基因可能参与了依赖 ABA的信号传导途径。
2.5 目标基因转化烟草及阳性植株的筛选
利用 Primer 5.0 软件设计的带酶切位点的特异
性引物扩增目的片段, 构建 pBI35S-TaCRF2 植物表
达载体。利用农杆菌介导法将该重组质粒转化到烟
草中, 1‰ Kan培养基上筛选出长势较好的烟草进行
PCR 检测, 结果显示, 检测的 9 个抗性烟草株系全
部扩增出了与目的基因片段大小一致的特异性条带,
均为阳性植株, 未转基因的野生型烟草叶片中没有
扩增出此特异条带(图 5)。
第 8期 郭丽香等: 小麦 TaCRF2基因的克隆及其在烟草中的初步功能验证 1393





图 1 TaCRF2序列及其编码产物的分析
Fig. 1 Analysis of TaCRF2’s sequence and its coding product
A: TaCRF2氨基酸序列及推测的保守域, 下画单线部分表示跨膜区; 下画双线部分表示 RING finger保守域; B: TaCRF2的结构域;
C: TaCRF2蛋白的跨膜区。
A: the sequence and its conserved regions of TaCRF2, transmembrane helices are highlighted in underline, and the RING finger signature is
highlighted in double underline; B: the structural domain of TaCRF2; C: the transmembrane helices of TaCRF2.
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图 2 TaCRF2系统进化树分析
Fig. 2 Phylogenetic analysis of TaCRF2


图 3 TaCRF2蛋白在洋葱表皮细胞中的定位分析
Fig. 3 Subcellular localization analysis of TaCRF2 fusion protein in onion epidermal cells
图中从左到右显示了绿色和明场重叠通道、绿色通道以及明场通道, 其中 A1~A3代表 163GFP的定位, B1~B3代表 TaCRF2~163GFP
融合蛋白的定位。
Channel overlays of green and bright field channel, green channel, and bright field channel are shown. Free GFP was expressed in the whole
cell (A1–A3) whereas GFP-TaCRF2 fusion protein was localized both in the nuclear and cell membrane (B1–B3).

2.6 转基因烟草对干旱和高盐的耐受性分析
选取 A、B、C、D四个转基因烟草 T0代株系进
行干旱和高盐的耐受性分析, 结果显示, 与野生型
烟草相比, 转 TaCRF2 基因的烟草对高盐和干旱处
理产生了一定的耐性。如图 6所示, 5% PEG处理 41
d后, 3个转基因株系有根部生长而对照没有生根现
象 , 转基因株系的长势优于对照。300 mmol L–1
NaCl处理 29 d后, 4个转基因株系的根部均有所生
长, 而野生型的烟草则没有生根(图 7)。结果还表明,
无论转 TaCRF2 基因的烟草还是野生型烟草在盐胁
迫培养基上的生长形态均与干旱胁迫培养基上的有
所不同 , 前者叶片较大 , 植株矮而粗壮; 后者叶片
较小但植株较高。
3 讨论
本研究利用同源克隆方法从小麦京花 9 号
cDNA中扩增获得了 1个 RING-H2型 TaCRF2锌指
蛋白基因, 系统进化树分析结果显示, RING型锌指
蛋白分为 3 组, TaCRF2 分属于第 3 组。与 TaCRF2
进化关系密切的 AtSDIR1[20]是泛素连接酶, 在泛素
降解途径中起着关键作用, 因此, 推测TaCRF2亦属
于一种泛素连接酶, 通过蛋白与蛋白的相互作用行
使抗逆功能。近年来的诸多相关研究结果都表明
RING 型锌指结构参与特定的泛素化事件, 这可能
意味着所有的 RING 型锌指蛋白在各种各样的生物
领域都行使泛素连接酶 E3活性[21]。
第 8期 郭丽香等: 小麦 TaCRF2基因的克隆及其在烟草中的初步功能验证 1395



图 4 TaCRF2基因在小麦中的表达特性分析
Fig. 4 Expression analysis of TaCRF2 in wheat


图 5 转基因株系的 PCR鉴定
Fig. 5 PCR identification of transgenic lines
M: marker; 1~9: A~I株系; 10: 阴性对照; 11: 水对照。
M: marker; 1–9: lines of A–I; 10: negative control; 11: water con-
trol.

亚细胞定位实验显示, TaCRF2没有特定的核定
位功能, 在细胞核和细胞膜上均有表达。锌指蛋白
作为一种转录因子大多定位在核中[22], 也有分别定
位于细胞质[23]和细胞膜[20]的, 对于既在核中又在细
胞质膜中表达的情况报道的较少。Liu 等[24]于 2007
年从水稻中克隆到的一个 RING 型锌指蛋白基因
OsCOIN 亦是在细胞核中和细胞质膜上都有表达。

图 6 转基因烟草株系耐旱性鉴定
Fig. 6 Drought-tolerance identification of transgenic tobacco
lines
A1和 A2分别为野生型烟草干旱胁迫初始和处理 41 d后; B1和
B2分别为转 TaCRF2基因烟草干旱胁迫初始和处理 41 d后。
A1 and A2 are the prior to treatment and 41 days after drought
stress in wide-type tobaccos, respectively; B1 and B2 are the prior
to treatment and 41 days after drought stress in transgenic tobaccos,
respectively.
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图 7 转基因烟草株系耐盐性鉴定
Fig. 7 Salt-tolerance identification of transgenic tobacco lines
A1和 A2分别为野生型烟草干旱胁迫初始和处理 29 d后; B1和
B2分别为转 TaCRF2基因烟草干旱胁迫初始和处理 29 d后。
A1 and A2 are the prior to treatment and 29 days after drought
stress in wide-type tobaccos, respectively; B1 and B2 are the prior
to treatment and 29 days after drought stress in transgenic tobaccos,
respectively.

序列分析表明, TaCRF2 含有跨膜结构域, 这或许是
导致其既在核中又在细胞膜中分布的原因。之前的
许多研究表明, RING型锌指蛋白常含有跨膜域, 这
可能与其参与的泛素降解途径有关。
real-time RT-PCR 结果表明 , 该基因受外源
ABA、干旱和高盐的强烈诱导表达, 低温对其表达
量的影响不明显 , 但也有使其增长的趋势。外源
ABA 能够诱导 TaCRF2 过表达, 暗示了该基因可能
在依赖 ABA的信号转导途径中起作用。研究显示许
多干旱诱导表达基因同时也会被外源 ABA 和高盐
诱导表达, 约 10%的干旱诱导表达基因还会被低温
诱导表达[25]。我们的研究结果显示, TaCRF2基因的
表达同时受干旱、高盐和冷胁迫的影响, 这种表达
谱表明 TaCRF2 可能涉及多种胁迫信号传导, 在信
号转导途径中扮演了一个极其复杂的角色。还有研
究表明, RING型锌指蛋白基因亦受高温[7]和乙烯[26]
的诱导表达, 说明 RING 型锌指蛋白不仅在非生物
胁迫应答中起作用, 在生物胁迫应答中可能也有重
要作用, 因为在生物胁迫应答中乙烯信号途径是重
要的信号传导途径[27]。对于 TaCRF2 是否也受高温
和乙烯的诱导表达, 有待进一步的研究。
转 TaCRF2 基因的烟草株系耐胁迫性的初步鉴
定试验结果显示, 该基因在烟草中的过表达在一定
程度上增强了转基因烟草对干旱和盐胁迫的耐受
性。RING型锌指蛋白不仅能提高植物的抗逆性, 对
某些植物的生长 [28]和种子发育 [29]也起着至关重要
的作用。本实验有利于进一步研究小麦 RING-H2型
锌指蛋白在抗逆反应中的作用, 并为小麦抗逆育种
提供优良的候选基因。
4 结论
小麦京花 9号 TaCRF2基因为 RING-H2型锌指
蛋白基因。该基因受外源 ABA、高盐和干旱的强烈
诱导表达 , 低温胁迫下表达量的变化不显著 ;
TaCRF2 编码的蛋白质主要定位在细胞核上; 初步
功能分析表明过表达 TaCRF2 基因的转基因烟草增
强了对干旱和高盐的耐受性。
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