全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(12): 2085−2091　 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家重点基础研究发展计划(863计划)项目(2006AA10Z153, 20060AA00105)
作者简介: 余渝(1973–), 男, 副研究员, 在读博士研究生。
*
通讯作者(Corresponding author): 林忠旭(1978–), 男, 副教授。Tel: 027-87283955, Fax: 027-87280016;
E-mail: linzhongxu@mail.hzau.edu.cn
Received(收稿日期): 2008-05-06; Accepted(接受日期): 2008-07-15.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.02085
草棉 EST-SSRs的遗传评价
余 渝 1,2 王志伟 1 冯常辉 1 张艳欣 1 林忠旭 1,* 张献龙 1
(1 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 湖北武汉 430070; 2 新疆农垦科学院棉花所, 新疆石河子 832000)
摘 要: 根据 GenBank中公布的 247条草棉 EST序列, 搜索 SSR并进行引物设计。其中的 25条序列含有 27个 SSR,
1~6碱基重复类型都存在, 二碱基和三碱基重复的频率较高。为了明确在 A、D和 AD基因组中的可转移性, 依据 25
条序列共设计 25 对 EST-SSR 引物, 其中 22 对引物扩增出清晰可辨的 DNA 条带, 产生 92 个多态性片段, 平均每对
引物产生 3.64 个多态性片段。引物的多态性信息含量(PIC)在 0.49~0.91 之间, 平均为 0.81。6 对引物在 BC1种间作
图群体[(鄂棉 22 × Pima3-79) ×鄂棉 22]中表现多态性, 产生 7 个多态性位点, 其中 5 个为共显性, 2 个为显性。除
HAU230b 标记在 BC1分离群体中不符合孟德尔式分离比例, 其余引物表现正常分离。6 个位点被整合到陆地棉和海
岛棉种间 BC1遗传连锁图谱上的 6条染色体: 有 4个位于 A亚基因组的 4条染色体上(Chr.6、10、11和 12), 2个位
于 D亚基因组的 2条染色体(Chr.19和 20)。
关键词: 草棉; 表达序列标签; 简单序列重复; 多态性信息含量; 遗传作图
Genetic Evaluation of EST-SSRs Derived from Gossypium herbaceum
YU Yu1,2, WANG Zhi-Wei1, FENG Chang-Hui1, ZHANG Yan-Xin1, LIN Zhong-Xu1,*, and
ZHANG Xian-Long1
(1 National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei; 2 Cotton Institute, Xinjiang
Academy Agricultural and Reclamation Science, Shihezi 832000, Xinjiang, China)
Abstract: Gossypium herbaceum (A genome) is generally regarded as the most closely relative of the progenitor at subgenomes
of allotetraploid cotton, of which the evolution is necessary to study. In order to investigate the contribution of G. herbaceum to
the tetraploid genome, EST-SSRs were isolated from 247 EST sequences of G. herbaceum documented in GenBank.
Twenty-seven perfect SSRs were identified from twenty-five unique ESTs. These SSRs contained 1−6 bp nucleotide motifs with
high frequency for 2-bp and 3-bp nucleotide motifs. A total of 25 primers were developed and 22 of them could amplify 24 cotton
accessions including 7 diploids of A genome, 11 diploids of D genome and 6 allotetraploids of AD genome; only HAU217 could
specifically amplified A genome and the other 21 primers could amplified both A and D genomes. The number of polymorphic
fragments generated by each primer ranged from 1 to 9 with an average of 3.64. The PIC values ranged from 0.49 to 0.91 with an
average of 0.81. Among the 25 EST-SSR primers, six primers revealed polymorphism between Emian 22 and Pima 3-79, and
yielded seven polymorphic loci (five were codominant and two dominant) in the BC1 [(Emian22 × Pima3-79) × Emian22] popula-
tion. Only HAU230b showed distorted segregation in the BC1 population. Six polymorphic loci were integrated into six chromo-
somes of our interspecific BC1 backbone genetic linkage map among which, four loci were mapped on four chromosomes of A
sub-genome (Chr. 6, 10, 11, 12), and two loci on two chromosomes of D sub-genome (Chr. 19 and 20).
2086 作 物 学 报 第 34卷

Keywords: Gossypium herbaceum; EST; SSR; Polymorphism information content (PIC); Genetic map
棉花属于锦葵科棉属。棉属约有 50个种, 仅有
4 个栽培种, 它们是具有 A 基因组的二倍体草棉(非
洲棉)和中棉(亚洲棉)及具有 AD 基因组的四倍体陆
地棉和海岛棉[1]。草棉和中棉在人类历史上曾经广
泛种植, 目前在世界范围内仍有种植[2]。前人研究认
为陆地棉和海岛棉 A亚基因组起源于草棉, 而 D亚
基因起源于雷蒙德氏棉 [3], 所以草棉和中棉基因组
的研究是关注的焦点。
简单重复序列 (SSR), 具有分布广泛、高多态
性、可重复性、遵循孟德尔式遗传规律的特征, 因
而被广泛地应用于分子标记遗传分析[4-5]。SSR同时
存在于植物基因组的表达区和非表达区[6-7]。与基因
组 SSR 标记相比, 从表达序列标签(EST)中开发的
SSR(EST-SSR)更加经济简便, 并且 EST-SSR可在不
同的物种间具有很高的可转移性, 其功能经常是可
以预测的[8]。EST-SSR在很多植物中都被研究, 特别
是经济利用价值高的作物更加受到人们的关注[9-10]。
目前 4个栽培棉种和雷蒙德氏棉的 EST序列都
已在 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)
中公布, 成为棉花 EST-SSR 开发的重要资源, 已经
从陆地棉 [10-12]、中棉 [13-14]、雷蒙德氏棉 [15]和海岛
棉[8]中开发了 EST-SSR。但草棉的 EST 序列较少,
GenBank中只有 247条。本研究利用草棉的 EST序
列, 探讨 EST-SSR 开发的可能性并对其进行遗传评
价。
1 材料与方法
1.1 EST序列的来源和预处理
从 GenBank 中以 FASTA 格式下载了 247 条草
棉 EST序列。利用 CAP3软件[16]对序列进行去重和
拼接, 共获得了 233个非重复序列, 包含 8个 contigs
和 225个 singletons, 用于 SSR的搜索和引物设计。
1.2 EST-SSR引物的开发
利用可同时进行 SSR模体识别和引物设计的在
线工具 SSR Primer (http://hornbill.cspp.latrobe.edu.
au/cgi-binpub/ssrprimer/indexssr.pl)搜索重复基序为
1~6的精密型 SSR并同时获得 SSR侧翼区域的引物。
SSRs 的查找标准为单核苷酸重复≥25, 二核苷酸重
复≥14 bp, 三核苷酸重复≥15 bp, 四核苷酸重复
≥16 bp, 五核苷酸重复≥20 bp, 六核苷酸重复≥24
bp。引物设计的主要参数参照 Zhang等[8]的报道, 引
物被命名为“HAU+数字编号”(HAU 是 Huazhong
Agricultural University的缩写)。
1.3 植物材料和 SSR分析
用 24 份不同棉花材料(含 A 基因组的中棉品种
6份和草棉资源 1份, D基因组的野生棉资源 11份,
AD基因组四倍体棉花 6份)扩增草棉 EST-SSR引物
(表 1)。依据 Paterson等[17]的方法提取棉花叶片基因
组总 DNA, 参照 Lin等[18]的方法分析 SSR。标记的
定位采用的作图群体是含有 141 个单株的陆地棉鄂
棉 22 和海岛棉 Pima3-79 种间 BC1群体[(鄂棉 22 ×
Pima3-79) × 鄂棉 22]。
1.4 草棉 EST-SSR的遗传评价
用多态性信息含量 (PIC)[19-20]来估计草棉
EST-SSR的等位基因的变异。
∑
=
−=
k
i
iPPIC
1
21
其中 Pi表示第 i个等位基因出现的频率, k是此
标记的所有等位基因的总数。
对在种间 BC1作图群体中表现多态性的引物首
先进行卡方测验检测其是否遵循孟德尔分离比例。
然后利用软件 MapMaker3.0b[21]将其整合到 BC1 遗
传连锁图上。计算中用到 Group (LOD = 5, r = 0.4)、
Three point、Order、Try、Map和 Ripple等命令, 并
用 Kosambi 作图函数 [22]将重组频率转换为图距
(cM)。根据其他已报道的图谱上位置确定的 SSR标
记 (http://www.mainlab.clemson.edu/cmd/Downloads.
shtml)将 HAU引物所在的连锁群与相应的染色体对
应起来。
2 结果与分析
2.1 EST-SSR引物的特征
在 233条非重复的草棉 EST序列中, 25条序列
含有可用于引物设计的 SSR, 得到 25 对 SSR 引物
(表 2)。共搜索到 27 个 SSR, 其中有 2 条 EST 含 2
个 SSR: 单核苷酸重复 1个、二核苷酸重复 10个、
三核苷酸重复 10 个, 四核苷酸重复 4 个, 五核苷酸
重复 1个和六核苷酸重复 1个(表 2)。对于重复基序
类型, 二核苷酸中的 GA/TC 出现频率最高, 其他类
型出现的频率基本相当; 对于重复次数, 重复 4 次
占有较高的频率; SSR的总长度变化于 14~39 bp之
间, 其中 15 bp的最多(表 2)。
第 12期 余 渝等: 草棉 EST-SSRs的遗传评价 2087


表 1 用于引物评价的 24份棉花材料
Table 1 24 cotton accessions used for primer evaluation
编号
No.
材料名称
Accession
基因组
Genome
所属棉种
Cotton species
1 安徽阜阳新集大花 Anhuifuyangxinjidahua A2 G. arboreum
2 长顺代化小花 Changshundaihuaxiaohua A2 G. arboreum
3 下寨小花 3 Xiazaixiaohua 3 A2 G. arboreum
4 罗甸官田小棉花 Luodianguantianxiaomianhua A2 G. arboreum
5 华中紫杆中棉 Huazhongziganzhongmian A2 G. arboreum
6 贵州中棉 Guizhouzhongmian A2 G. arboreum
7 阿非利加棉 G. africanum A1 G. herbaceum
8 瑟伯氏棉 G. thurberi D1 G. thurberi
9 三裂棉 G. trilobum D8 G. trilobum
10 拟似棉 G. gossypioides D6 G. gossypioides
11 哈克尼西棉 G. harknessii D2-2 G. harknessii
12 戴维逊氏棉 G. davidsonii D3-d G. davidsonii
13 克劳斯基棉 G. klotzschianum D3-k G. klotzschianum
14 旱地棉 G. aridum D4 G. aridum
15 松散棉 G. laxum D9 G. laxum
16 辣根棉 G. armourianum D2-1 G. armourianum
17 雷蒙德氏棉 G. raimondii D5 G. raimondii
18 裂片棉 G. lobatum D7 G. lobatum
19 黄褐棉 G. mustelinum (AD)4 G. mustelinum
20 达尔文棉 G. darwinii (AD)5 G. darwinii
21 鄂棉 22 Emian 22 (AD)1 G. hirsutum
22 TM-1 (AD)1 G. hirsutum
23 Pima 3-79 (AD)2 G. barbadense
24 Pima 90 (AD)2 G. barbadense

表 2 草棉 EST-SSR引物的特征
Table 2 Characteristics of EST-SSR primers from G. herbaceum
引物名
Primer
GenBank登录号
GenBank accession
SSR模体
SSR motif
上游引物
Forward primer
(5′−3′)
下游引物
Reverse primer
(5′−3′)
产物大小
Product
size (bp)
Tm
(℃)
HAU206 CA994123,CA994072 (TC)10 CTGACCCTCCATCAATCTCT TACCTTCTTTCGCATCATCA 248 56.8
HAU207 CA994075,CA994063,CA994056 (TC)15 AGTTCTGCTTCCACTTCTGG TGATGCCAATTCAAAAACAC 263 57.1
HAU208 CK640436 (ATAC)5 CACTTCACAACTCGTCCTTG CCTCAGAAGGAGAAACTGGA 210 56.9
HAU209 CK640421 (TTAT)4 GCTTTTACCATCCACTGCTT ATAACAGGGGGTGATCTCAA 274 56.9
HAU210 CA994179 (AT)7 AGCTGTGGAGGTATGGAAGA TTATAACTTTGGGGGTTGGA 167 57.1
HAU211 CA994144 (TCA)5 TGATGATATGCCTGAACCAG ATGCTTCCTTCGTATTGAGG 207 57.0
HAU212 CA994139 (A)25 AAAGTTCACTCCGGAAGTTCT GAGCAGATGATTCGACCTTT 262 57.0
HAU213 CA994139 (ACCA)4 GTTGGAGATGGGATTAGGTG TGGGAAGCCTTAGTTTTCAG 151 57.0
HAU214 CA994135 (ATA)5 ATGATCTCCGAAATCTGGAA TTCATTGCTATCAAGCCAGA 299 57.1
HAU215 CA994115 (TAT)5 CTGGTGCTGGAAGGTTAGTT CAAATGAAAATGAGCTGTGC 290 56.9
HAU216 CA994107 (TTC)6 CTCTAGAACTGACCGCCATT CTCTCCCGTCGTAATGTCTT 110 56.9
HAU217 CA994064 (ACAG)6 AACAGTTGGTAATCCGGAAA GCTTATTGCTTGTCATCACG 238 57.0
HAU218 CA994054 (TGA)5 GCTGTTGTTAAACCCAAAGG CGGAATTATCAGGAGAGGAA 238 57.0
HAU219 CA994047 (AGA)5 CTTAAGCTCAAGGCATCCAT TACCGCACTCAAGTCAAGAA 226 57.1
HAU220 CA994042 (TG)7+(AG)12 CATGTGCATGTGTGTCTCTG CATGTTTGAGGTGGAAACAA 287 57.0
HAU221 CA994039 (AG)10 TGCGTATACACCACAAGGTT CCATTTAATGCCAGTTGTGA 247 56.8
HAU222 CA994028 (GA)8 CAAGCAGATGAACAGTGAGG CGGCAATATAAGTGGTGACT 141 56.1
HAU223 CA994024 (GA)8 CAGGACAATCAAACCCTCTC TGATTTCATCTTGCACCATC 184 57.1
HAU224 CA994023 (AAGAA)5+ (GAA)5 CGGATTAAATGGTCTCAACC TGACAGCGGTAAGTTGATTG 283 57.2
HAU225 CA994022 (ACA)5 GGTGCCGGATTTTAACTATG CGATCAGCCTTTGATTTCTT 153 57.1
HAU226 CA994021 (TGC)5 ATGGTGTTTGCAAAGATGTG AGTAAGCTTGGCGAATGAAA 297 57.3
HAU227 CA994001 (AC)9 CATGAACCTGAGCACACAAT TTATGGCATGAACAACTTGG 175 57.1
HAU228 CA993997 (AAAGGA)4 CCTTCTTGCTCACAGGAAAT CCATCAGCAAGCTTCTTTTT 244 57.1
HAU229 CA993996 (GA)11 ACTGATTAAGCCGGAGTTTG TTGTTCATTTCCCAGTTGTG 267 57.0
HAU230 CA993995 (ATT)13 TGAACTAGCTTGGCTGAATG CAGCATGGAAATCCTAATCC 210 56.9
2088 作 物 学 报 第 34卷

2.2 EST-SSR引物的 PIC值
用 25 对 EST-SSR 引物扩增 24 份 A、D 和 AD
基因组的棉花材料, 22对(88%)引物可以扩增出清晰
可辨的DNA条带, 产生 92个多态性片段, 平均每对
引物产生 3.64个多态性片段。引物产生的多态性片
段的数目变幅为 1~9, 引物 HAU216 得到多态性片
段最多, 为 9个(图 1)。引物 HAU214未得到特异性
产物, 2 对引物(HAU227 和 HAU228)在任何一份材
料中均无扩增产物。引物 HAU217只在 A染色体组
扩增, 其他引物既能在 A 染色体组, 也能在 D 染色
体组扩增。根据 22 对引物在 24 份材料中扩增得到
的等位基因变异的信息来计算各引物的 PIC值。PIC
值变化于 0.49~0.91, 平均为 0.81。引物 HAU216的
PIC值最大, 为 0.91; 引物HAU213的最小, 为 0.49(表
3)。这些引物在 3个基因组中差异显著, 可以用于不
同基因组的区分和进化研究(图 1)。


图 1 引物 HAU216对 24份棉花材料的扩增
Fig. 1 Amplification of HAU216 in 24 cotton accessions
1~24: 对应于表 1中列出的材料。
The lane numbers of 24 accessions corresponded with the numbers given in Table 1.

表 3 草棉 EST-SSR引物的 PIC值
Table 3 PIC value of EST-SSR primers from G. herbaceum
引物
Primer
PIC值
PIC value
引物
Primer
PIC值
PIC value
引物
Primer
PIC值
PIC value
引物
Primer
PIC值
PIC value
HAU206 0.76 HAU216 0.91 HAU219 0.71 HAU225 0.89
HAU207 0.86 HAU217 0.69 HAU220 0.84 HAU226 0.90
HAU208 0.82 HAU218 0.87 HAU221 0.88 HAU229 0.84
HAU209 0.76 HAU211 0.76 HAU222 0.85 HAU230 0.89
HAU210 0.87 HAU212 0.85 HAU223 0.85
HAU215 0.76 HAU213 0.49 HAU224 0.86

2.3 EST-SSR的染色体定位
6对引物在鄂棉 22和 Pima3-79之间表现多态性,
在 BC1作图群体中产生 7个多态性位点, 5个为共显
性, 2个为显性(HAU209和HAU211)。经卡平方检验,
HAU230b (χ2 = 7.37)表现偏分离 , 其余引物表现
正常分离。7 个多态性位点中有 6 个被整合到海陆种
间遗传连锁图谱上, 位于 6 条染色体上。有 4 个位
点位于 A亚基因组的 4条染色体上(Chr. 6、10、11
和 12), 2个位点位于D亚基因组的 2条染色体上(Chr.
19和 20)(图 2)。HAU216 标记位于第 19 染色体(D
亚基因组)上, 分析其在棉属资源中的扩增条带发现
HAU216在海岛棉 Pima3-79中出现了 D基因组的特
异条带(图 1), 因而该标记被定位于 D亚基因组染色
体。
第 12期 余 渝等: 草棉 EST-SSRs的遗传评价 2089



图 2 6个草棉 EST-SSRs在海陆种间 BC1连锁遗传图上的分布
Fig. 2 Distribution of 6 polymorphic loci in the interspecific BC1 genetic linkage map
草棉 EST-SSR用下划线标出。
EST-SSR markers from G. herbaceum were underlined.
2090 作 物 学 报 第 34卷

3 讨论
截至 2008年 5月, 在 dbEST数据库(http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)中棉花的 EST 序列已达到
369 913条, 包括陆地棉、中棉、草棉、海岛棉和雷
蒙德氏棉 5 个棉种。除草棉外, 其他 4 个棉种都有
EST-SSR开发的报道[8,10-15]。GenBank数据库中草棉
EST 序列只有 247 条, 利用这些 EST 序列进行 SSR
搜索和引物设计得到了 25 对草棉的 EST-SSR 引物,
并且出现了 1~6核苷酸重复类型。这说明 SSR在棉
花基因组中是广泛存在的。草棉 EST-SSR的开发也
丰富了棉属 EST-SSR的来源。
通常来说, 来源于基因组的 SSR 在基因组之间
的可转移性比例较低 , 而来源于表达序列的
SSR(EST-SSR)的可转移性比例较高。本研究中 22
对草棉 EST-SSR引物(88%)能够在所有的 24份棉花
材料中获得扩增产物, 其中只有 HAU217 不能扩增
D基因组材料, 说明这些引物在 A、D和 AD基因组
是可以通用的。Guo等[23]研究发现来源于亚洲棉(A
基因组)的 EST-SSR 在其他棉种中也有高比例的可
转移性。如此高比例的可转移性与 SSR的来源相关。
HAU217 只能在 A 染色体组进行扩增, 表明该
引物的扩增产物在 D 染色体组没有同源序列, 属于
A染色体组特有 , 染色体定位也证实该引物位于 A
染色体组的 11号染色体上。引物 HAU214未得到特
异性产物, 可能的原因有, 一是扩增区间内有大内
含子的存在导致产物远大于期望片段; 二是 SSR 位
点和所设计的引物位于转座子或重复 DNA 区域内,
结果产生偏离目标片段的多个产物。HAU227 和
HAU228 在任何一份材料中均无扩增产物。其原因
可能是正向引物或反向引物或二者都恰好跨过了
mRNA的剪切位点; 或在相应的基因组DNA序列中
存在较大的内含子[24]。这两个原因都会导致引物无
法与模板 DNA结合而不能扩增。
PIC 值可用来估计每对扩增引物的等位基因的
变异, 而 PIC 值的大小是基于所检测到的等位基因
的数目及分布频率[25], 所以在一定意义上, PIC也是
引物检测多态性的能力的一种度量。引物的 PIC 值
越高, 它揭示等位基因变异的能力就越强。Blair 等[26]
研究表明 EST-SSR标记的 PIC值低于基因组 SSR。
本研究中的草棉 EST-SSR引物的 PIC值比来自于陆
地棉基因组 SSR (0.12~0.85, 平均 0.4)[27]和亚洲棉 EST-
SSR (0.12~0.73, 平均 0.42)的 PIC值都高[14]。其主要
原因在于 Park 等[14]和 Frelichowski 等[27]主要利用
AD 基因组材料进行引物评价, 而本研究中使用了
较多的遗传丰富的 D基因组材料。
由于目前公布的草棉的 EST 序列数量太少, 我
们只得到了 25 对 EST-SSR 引物。而只有 6 个引物
在陆地棉和海岛棉种间群体中表现多态性, 得到 7
个位点。其中的 6 个位点被整合到种间 BC1连锁遗
传图上, 4个标记位于 A亚基因组上, 2个位于 D亚
基因组上。HAU230b位于第 10号染色体上而 H230a
位于第 20 号染色体上, 这与 Rong 等[28]研究结果一
致, 即 10 号染色体与 20 号染色体具有较高的同源
性。草棉 EST-SSR标记在四倍体棉花遗传图谱中分
布的不均匀与草棉是四倍体棉花 A亚基因组的供体
相关, 这对于研究四倍体棉花 A 亚基因组的进化以
及 A基因组与 D基因组融合后两个基因组的相互协
调进化具有重要意义。相信随着研究的不断深入 ,
更多的草棉标记的开发将有助于四倍体棉花起源、
进化、基因组结构和功能的研究。
4 结论
利用 GenBank数据库中的 247条草棉的 EST序
列开发了 25对 EST-SSR引物, 这些 SSR中包含 1~6
碱基重复基序。22 对引物能够在棉花 A、D 和 AD
基因组中扩增并且显示出很大的变异。6 对引物在
陆地棉和海岛棉的种间 BC1 群体中表现多态性, 得
到 7 个位点; 其中 6 个位点整合到种间 BC1连锁遗
传图上, 4个位点位于 A亚基因组, 2个位于 D亚基
因组。草棉 EST-SSR的开发丰富了棉属 EST-SSR的
来源并有助于棉花基因组的进化研究。
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