全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(10): 1827−1832 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

* 通讯作者(Corresponding author): 林志珊, E-mail: linzs@caas.net.cn
第一作者联系方式: E-mail: yunlongzhang26@163.com
Received(收稿日期): 2012-03-21; Accepted(接受日期): 2012-06-10; Published online(网络出版日期): 2012-07-27.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120727.0846.017.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01827
不同簇毛麦 6VS染色体臂的白粉病抗性特异功能标记的开发及应用
张云龙 1,2 王美蛟 1 张 悦 1 褚翠萍 2 林志珊 1,* 徐琼芳 1
叶兴国 1 陈 孝 1 张宪省 2
1 中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部麦类生物学与遗传育种重点实验室, 北
京 100081; 2 山东农业大学 / 作物生物学国家重点实验室, 山东泰安 271018
摘 要: 小麦 6VS·6DL 易位系 Pm97033 和 6VS·6AL 易位系 92R137 中的 6VS 染色体臂来自不同的簇毛麦种质, 均
表现良好的白粉病抗性, 本研究利用分子标记对这 2个易位系所包含抗病基因的异同进行了鉴定。利用与 Pm21抗白
粉病相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 Stpk-V基因(GenBank登录号为 HQ864471.1)的基因组和 cDNA序列为基础, 在包
含至少 1个内含子的 2个编码区设计引物, 从 Pm97033中扩增获得特异的多态性片段。为进一步提高特异性和扩增
的稳定性, 对特异扩增片段测序并重新设计引物, 扩增筛选获得 2个引物对, 其中 PK-F1/PK-R可专一扩增 6VS·6DL
易位系 Pm97033 及其抗病亲本, 而 PK-F2/PK-R 可同时特异扩增 2 个不同来源的簇毛麦 6VS 染色体, 但二者间的特
异片段具有多态性。利用这 2对引物, 对系谱中包含 6V(6D)和 6VS·6AL、抗白粉病的小麦品系 CB037进行检测, 发
现仅出现与 6VS·6AL易位系相同的簇毛麦扩增片段, 不存在簇毛麦 No. 1026 (Pm97033的 6VS供体)的扩增片段。基
因组原位杂交结果表明, CB037 仅含 1 对小麦-簇毛麦的易位染色体, 用已报道的分子标记检测证明易位涉及的小麦
染色体为 6A, 与本研究开发的分子标记检测结果相吻合, 表明 CB037 携带的白粉病抗性基因来自 6VS·6AL 易位系
92R137, 其白粉病抗性可能与 Pm97033具有不同的遗传基础。
关键词: 6VS·6AL 易位系; 6VS·6DL 易位系; 簇毛麦; 白粉病抗性; 功能标记
Development and Application of Functional Markers Specific to Powdery Mil-
dew Resistance on Chromosome Arm 6VS from Different Origins of Haynaldia
villosa
ZHANG Yun-Long1,2, WANG Mei-Jiao1, ZHANF Yue1, CHU Cui-Ping2, LIN Zhi-Shan1,*, XU Qiong-Fang1,
YE Xing-Guo1, CHEN Xiao1, and ZHANG Xian-Sheng2
1 National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops,
Ministry of Agriculture / Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2 State Key Laboratory of
Crop Biology / Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China
Abstract: Lines Pm97033 and 92R137 with good resistance to powdery mildew are wheat–Haynaldia villosa translocation lines
carrying 6VS from different H. villosa germplasms. In this study, we identified the similarity of powdery mildew resistance genes
in both lines using molecular markers. Based on the sequence of Stpk-V gene (GenBank accession number HQ864471.1), we de-
signed three primer pairs in the coding regions containing at least one intron. Using one pair of primers, a polymorphic fragment
of Pm97033 pattern was amplified, which was specific to the alien chromosome arm 6VS. According to the sequencing result of
this specific fragment, two new primer pairs were designed for better stability. Primer pair A amplified a specific band specific to
6VS·6DL translocation line Pm97033 and its resistance donor H.v#2. Primer pair B amplified two polymorphic fragments corre-
sponding to 6VS from different H. villosa donors. The effectiveness of primer pairs A and B was then verified in wheat line
CB037 with strong powdery mildew resistance, which was developed using both 6V(6D) substitution and 6VS·6AL translocation
lines. The banding pattern in CB037 was identical to that in 92R137; however, the amplification fragment of Pm97033 was not
observed in CB037. The result of genomic in situ hybridization revealed only one pair of wheat–H. villosa translocation chromo-
1828 作 物 学 报 第 38卷

somes in CB037, and the translocation chromosome arm was identified as 6A by molecular markers NAU/xibao15F and
NAU/xibao15R. The GISH analysis confirmed the result based on molecular markers designed in this study. Thus, we infer that
the powdery mildew resistance in CB037 is derived from 92R137, and CB037 and Pm97033 probably have different genetic bases
on resistance to powdery mildew.
Keywords: 6VS·6AL translocation; 6VS·6DL translocation; Haynaldia villosa; Powdery mildew resistance; Functional marker
小麦白粉病(Erysiphe graminis D.C. f. sp. tritici)
是小麦的主要病害之一 [1], 在气候潮湿地区危害尤
为严重, 培育高抗白粉菌的小麦品种是解决这一问
题的根本途径之一。小麦亲缘种属簇毛麦(Haynaldia
villosa L. Schur.)是一个异花授粉的二倍体种(2n=14,
VV), 广泛分布于地中海东北部及高加索地区[2], 具
有抗小麦白粉病、锈病和抗旱性, 以及籽粒高蛋白
含量等优异品质性状[3-5]。通过不同渠道的引种和资
源收集与鉴定, 已发现几个不同来源的簇毛麦均高
抗白粉病, 是改良小麦抗逆性潜在的优良资源[6-8]。
自 20 世纪 70 年代开始, 通过远缘杂交和染色体工
程, 陆续将不同来源簇毛麦中的白粉菌抗性基因导
入普通小麦[8-14], 如刘大钧、陈佩度等利用引自英国
剑桥植物园的簇毛麦育成了 T6VS·6AL 易位系, 对
小麦白粉病表现抗性强、抗谱广; 目前该抗性已转
入主栽小麦品种, 推广面积达 340 万公顷[15], 其抗
病基因被命名为 Pm21。陈孝等将源于前苏联簇毛麦
的白粉病抗性导入小麦品种宛 7107的遗传背景, 培
育出 T6VS·6DL 易位系 Pm97033、 Pm97034 和
Pm97035, 同样表现出白粉病广谱抗性[16]。另外, 张
庆勤等[17]培育的 6V(6A)代换系贵农 21和贵农 22对
白粉病表现免疫, 其簇毛麦来自中国。
为了解不同来源的簇毛麦所携带的白粉病抗性
是否存在差异, 有必要对抗病基因或抗病候选基因
进行分析。以 T6VS·6AL 易位系为材料, Cao 等[15]
分离并鉴定出一个定位于 6VS 染色体臂的基因
Stpk-V, 并证明其为对 Pm21白粉病抗性有重要贡献
的一个关键基因。该基因受白粉病菌诱导表达。本
研究以 Sptk-V 基因序列为基础设计引物 , 对上述
T6VS·6AL 和 T6VS·6DL 小麦-簇毛麦易位系及其亲
本进行分子标记检测, 尝试在DNA序列水平上评估
这 2 个不同易位系抗性遗传基础的异同, 并对育种
程序中包含这 2 个不同抗病材料的小麦品系 CB037
的白粉病抗源进行鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
来源于英国剑桥植物园的簇毛麦 H.v#2 及衍生
的 T6VS·6AL易位系 92R137由南京农业大学陈佩度
教授提供。引自前苏联的簇毛麦 No. 1026由前中国
农业科学院作物品种资源研究所陶琨研究员提供 ,
其衍生的 T6VS·6DL 易位系 Pm97033、小麦品系
CB037 [组合为 CA9211/3/93N40/辽 10//92R137 (Pm21)/
4/辽 10/5/京 771×3, 其中 93N40 为 6V(6D)代换系
RW15 与小麦的杂种后代抗病株系]由本课题组培育
并保存。宛 7107 为 Pm97033 培育过程中主要的普
通小麦回交亲本。
簇毛麦和小麦种子经 0.7%双氧水室温避光处理
24 h后, 用无菌水洗涤 3~5次, 4℃放置 24 h, 待种子
露白后 25℃培养。挑选健壮且发芽一致的种子种于
花盆中, 室温下生长 2周, 剪取幼嫩叶片约 0.1 g, 用
CTAB法提取基因组 DNA[18]。
1.2 引物设计
根据 NCBI 网站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
nuccore/HQ864471.1)公布的丝氨酸 /苏氨酸蛋白激
酶基因 Stpk-V (HQ864471.1)序列设计了 3 对引物,
每对引物至少包含 1个内含子。对 2个小麦-簇毛麦
易位系及其亲本进行扩增, 其中引物对 6VS-15bF/
6VS-15bR在易位系 92R137和 Pm97033扩增出差异
片段。但该引物的扩增条带常受扩增条件及电泳中
各参数的影响而不甚稳定。为此, 对具有明显差异的
扩增产物进行回收、克隆、测序。经序列比对, 在 Stpk-V
和扩增片段间的碱基差异处, 设计了 2 个特异上游引
物 PK-F1和 PK-F2 (图 1)及其在下游外显子区共用引
物 PK-R, 组成引物对 PK-F1/PK-R和 PK-F2/PK-R。设
计引物所用软件为 Primer Premier 5.0 [19], 序列比对软
件为DNAMAN 6.0 (http://www.lynnon.com/)。
1.3 PCR扩增体系及反应程序
用 PTC-200 (Bio-Rad)进行 PCR扩增。扩增总体
系 25 µL, 含 1 µL基因组 DNA (50 ng µL−1)、2.5 µL
10×buffer、2 µL dNTP (2.5 mmol L−1)、2 µL 引物(10
mol L−1)、0.25 µL rTaq DNA polymerase (2.5 U µL−1,
TaKaRa)、15.25 µL ddH2O。扩增条件为 94℃预变性
8 min; 94℃变性 35 s, 合适的退火温度(表 1) 40 s,
延伸 35 s, 35个循环; 后 72℃延伸 5 min, 16℃保存。扩
增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳, 以紫外成像仪照相。
第 10期 张云龙等: 不同簇毛麦 6VS染色体臂的白粉病抗性特异功能标记的开发及应用 1829




图 1 引物序列 PK-F1和 PK-F2所处的位置
Fig. 1 Locations of primers PK-F1 and PK-F2
Stpk-A、Stpk-B和 Stpk-D为小麦丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因部分序列, 15 length为本研究获得的 783 bp片段的部分序列。
Stpk-A, Stpk-B, and Stpk-D are the sequences of serine/threonine protein kinases genes in wheat, and the sequence “15 length” is the partial
sequence of 783 bp fragment obtained in this study.

表 1 本研究设计的引物
Table 1 Primers designed in this study
引物
Primer
序列
Sequence (5′–3′)
退火温度
Annealing
temp. (℃)
6VS-15bF TATTTgCCTTggTATggC 52.0
6VS-15bR ggTCTTCATAgggTAATCTTg
PK-F1 TCCTATATgCTCATATATTggATgTAATAA 57.5
PK-F2 gCTCATATATTggATgTAAgTCTTATg 62.0
PK-R gACTTCCgTgTCACTTgTCCTCg

1.4 易位染色体的基因组原位杂交检测
按上述方法处理种子, 待根尖长 1~2 cm时取下
根尖组织在冰水中预处理 24 h, 卡诺固定液(乙醇∶
冰醋酸=3∶1)固定 3~4 d。用纤维素酶和果胶酶混合
酶液 37℃处理根尖 14 min, 于 45%醋酸中压片。以
液氮冷冻揭片, –20℃保存备用。按照地高辛缺口平
移标记试剂盒(Roche)说明书的操作方法标记簇毛麦
基因组 DNA, 用中国春基因组 DNA 为封阻进行原
位杂交。异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗地高辛检
测试剂盒(Roche)检测杂交信号。杂交过程参照 Wei
等 [20]的方法, 以荧光显微镜(OLYMPUS, BX51, 日
本)观察并照相[21]。
1.5 易位染色体的分子标记检测
利用 Cao 等[22]开发的可特异扩增 6AS/6BS/6DS/
6VS 的引物 NAU/xibao15F 和 NAU/xibao15R 确认
CB037 中易位染色体所涉及的小麦染色体。扩增程
序和电泳条件均按 Cao等[22]介绍的方法。
2 结果与分析
2.1 设计引物对不同簇毛麦和易位系的检测
2.1.1 引物对 6VS-15bF/R 从设计的 3对引物中
筛选到可对不同易位系及其亲本进行多态性扩增的
引物 6VS-15bF/R, 此对引物位于 Stpk-V的第 4和第
5 外显子。簇毛麦 No. 1026 和小麦-簇毛麦易位系
Pm97033 可扩增出 3 条带 , 而簇毛麦 H.v#2 和
92R137只扩增出 1条带, 且与小麦品种宛 7107的扩
增带较难区分(图 2)。同时, 样品的扩增条带常受扩
增条件及电泳参数的变动而不稳定。因此, 对差异
最明显的最长片段回收测序, 其片段长为 783 bp。
将其与 Stpk-V 比对后发现 , 得到的片段相对于
Stpk-V 在编码区无差异, 内含子区存在碱基的插入,
其中位于 Stpk-V第 4内含子第 108个碱基处有 4个
碱基(TAAC)的插入(图 2)。根据这 4个碱基的差异设
计特异上游引物PK-F1和PK-F2, 下游共用引物PK-R,
组成引物对 PK-F1/PK-R和 PK-F2/PK-R (表 1)。



图 2 引物对 6VS-15bF/R在不同易位系及其亲本中的扩增
Fig. 2 Amplification patterns of primer pair 6VS-15bF/R in
different translocation lines and their parents
1: H.v#2; 2: 92R137; 3: No. 1026; 4: Pm97033; 5: 宛 7107;
M: 200 bp DNA ladder。
1: H.v#2; 2: 92R137; 3: No. 1026; 4: Pm97033; 5: Wan 7107;
M: 200 bp DNA ladder.

2.1.2 引物对 PK-F1/PK-R 以 PK-F1/PK-R为引
物进行扩增, 发现仅从 No. 1026和 Pm97033扩增出
大小为 427 bp 的片段, 与预期大小相符。H.v#2、
92R137 和宛 7107 中无扩增产物, 说明此引物对簇
毛麦 No. 1026特异, 可作为一个方便、实用的白粉
病抗性的分子标记。在簇毛麦 No. 1026中除预期的
目标片段外 , 还扩增出另一条分子量较小的片段 ,
而易位系 Pm97033中没有这条扩增带。说明此片段
不在 6VS上。CB037没有扩增带, 说明 CB037可能
并不含有 No. 1026来源的 6V染色体片段(图 3)。



图 3 引物对 PK-F1/PK-R在不同易位系及其亲本和 CB037中
的扩增
Fig. 3 Amplifications pattern of primer pair PK-F1/PK-R in
different translocation lines and their parents and CB037
1: H.v#2; 2: No. 1026; 3: 92R137; 4: Pm97033; 5: 宛 7107;
6: CB037; M: 200 bp DNA ladder。a和 b表示带型。
1: H.v#2; 2: No. 1026; 3: 92R137; 4: Pm97033; 5: Wan 7107; 6: CB037;
M: 200 bp DNA ladder. Letters “a” and “b” refer to banding patterns.
1830 作 物 学 报 第 38卷

2.1.3 引物对 PK-F2/PK-R 引物对 PK-F2/PK-R
在簇毛麦 H.v#2 及其易位系 92R137 扩增出 331 bp
的条带, 在簇毛麦 No. 1026及其易位系 Pm97033扩
增出约 400 bp 的条带(图 4), 与预期结果一致。
CB037的扩增带大小与簇毛麦H.v#2和易位系92R137
一致, 而宛 7107没有出现扩增带, 表明 CB037可能
只含有 1 个来源的簇毛麦 6VS, 其白粉病抗性应该
来自小麦–簇毛麦易位系 92R137。



图 4 引物对 PK-F2/PK-R在不同易位系及其亲本和 CB037中
的扩增
Fig. 4 Amplification patterns of primer pair PK-F2/PK-R in
different translocation lines and their parents and CB037
1: H.v#2; 2: No. 1026; 3: 92R137; 4: Pm97033; 5: 宛 7107;
6: CB037; M: 200 bp DNA ladder。c和 d表示带型。
1: H.v#2; 2: No. 1026; 3: 92R137; 4: Pm97033; 5: Wan 7107; 6: CB037;
M: 200 bp DNA ladder. Letters “c” and “d” refer to banding patterns.

2.2 CB037基因组簇毛麦易位片段的鉴定
对 CB037的染色体荧光原位杂交分析结果显示,
有 1 对染色体臂具有簇毛麦 DNA 的荧光杂交信号
(图 5)。用 6AS/6BS/6DS/6VS特异引物 NAU/xibao15F
和 NAU/xibao15R的扩增结果表明, CB037缺失 6AS
小麦的特异带, 说明 CB037 中涉及的小麦易位染色
体是 6A (图 6)。因此, CB037虽然在培育过程中曾经
使用 2 个不同来源簇毛麦衍生系做杂交亲本 , 但
CB037 并不是二者的聚合体, 原位杂交显示的结果
与分子检测结果完全吻合。



图 5 CB037的原位杂交鉴定
Fig. 5 GISH result in CB037

3 讨论
培育不同抗性特点的抗病材料, 拓宽抗性基础,
可以有效防止因为抗性单一而发生的病害严重流行 ,


图 6 引物 NAU/xibao15F/R在 CB037和不同易位系及其亲本
中的扩增
Fig. 6 Amplification pattern of CB037 and two translocation
lines and their parents with primers NAU/xibao15F/R
1: H.v#2; 2: No. 1026; 3: 92R137; 4: Pm97033; 5: 宛 7107;
6: Pm97033; 7: CB037。
1: H.v#2; 2: No. 1026; 3: 92R137; 4: Pm97033; 5: Wan 7107;
6: Pm97033; 7: CB037.

对小麦安全生产无疑具有深远意义。有证据表明 ,
易位系 Pm97033 和 92R137 尽管都含有来自簇毛麦
的 6VS, 但在对某些病虫的抗性表现以及 DNA水平
上是有差别的。Li等[23]发现不同来源的 6VS对小麦
卷叶虫的抗性不同, 对条锈病的某些生理小种也有
不同的反应。李辉等[24]利用 RAPD引物对这些材料
及其小麦亲本进行扩增, 发现引物 OPAL03750 的扩
增带能够区分不同来源的 6VS。此外 , 对二者的
RFLP分析结果显示, 在 PSR8/EcoR V、PSR371/Xba
I等探针/酶组合中, 2个簇毛麦的染色体臂间均显示
出多态性[16,24]。这些证据暗示, 在 6VS 上存在差异
的 DNA序列。然而, 这些差别并不能充分证明 2种
材料具有不同的抗性基础。Cao 等 [15]最近报道 ,
Sptk-V 基因对 Pm21 白粉病抗性起关键作用。本研
究以 Stpk-V 基因序列为基础, 尝试分析该基因在不
同来源的簇毛麦间是否存在差异。结果证明这种差
异确实存在。
功能标记是根据功能基因内部引起表型性状变
异的多态性基序开发出来的一种新型分子标记, 不
需要进一步验证就可以在不同的遗传背景下检测 ,
确定目的等位基因的有无, 用于不同育种群体中目
标性状的准确选择[25]。目前, 已开发的功能标记的
基因包括高直链淀粉玉米 amylose-extender基因、水
稻多酚氧化酶基因、水稻香味基因、水稻广亲和基
因 S5-n 等[26-28]; 功能已明确并待开发标记的基因有
玉米株高、番茄果重、水稻株高 Hd6、食味品质
GBSS、小麦春化作用基因 VRN1 和抗叶锈基因
Lr10/Lr21等[29]。Stpk-V基因已被证实具有广谱抗白
粉病的功能且与 Pm21 有关, 具有功能标记开发的
潜力。基于此, 我们通过筛选与此基因存在差异的
片段, 开发了 2个功能标记。随着功能基因组学和基
因工程快速发展, 可供功能标记开发的重要农艺性
状相关基因也将越来越多[25]。功能标记在分子标记
辅助育种中和品种鉴定中有着广阔的应用前景。通
第 10期 张云龙等: 不同簇毛麦 6VS染色体臂的白粉病抗性特异功能标记的开发及应用 1831


过功能标记的开发, 可实现快速、准确改良生物性
状的终极目标[29]。
CB037 是一个新培育的春性高代品系。其生长
周期较短 , 且具有良好的组织培养能力及再生性
能。作为较理想的受体材料, 目前正频繁地应用于
基因枪的遗传转化[30]。CB037 的另一个显著优点是
对白粉病免疫, 这一特性保证了小麦遗传转化实验
中再生植株健康生长, 解决了温室温暖潮湿的环境
极易诱发白粉病的困扰。在培育 CB037过程中曾使
用了 2份不同来源的簇毛麦抗白粉病衍生系为亲本,
其系谱为 CA9211/3/93N40(Pmv)/辽 10//92R137 (Pm21)/
4/辽10/5/京 771×3, 但是 CB037 究竟是同时含有 2
个 6VS还是仅含二者之一尚没有实验证据。本研究
利用 GISH 技术和特异分析标记 , 首次明确了
CB037中外源染色体及其易位所涉及的小麦染色体,
证明 CB037 的抗性来自南京农大培育的 T6VS·6AL
易位系。本研究开发的标记被验证可用于 2 种簇毛
麦易位系的鉴定。
4 结论
根据与 Pm21 的白粉病抗性密切相关的 Stpk-V
基因序列开发了 2 个功能标记 PK-F2/PK-R 和 PK-
F1/PK-R。PK-F2/PK-R 为从前苏联引进簇毛麦 No.
1026及衍生的易位系 6VS上特异的白粉病抗性分子
标记, PK-F1/PK-R是易位系 Pm97033和 92R137中
6VS 上的抗白粉病的多态性分子标记, 可区分 2 份
不同来源的簇毛麦及其衍生的抗白粉病易位系。
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