全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(10): 1843−1848 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30571158); 国家高基础研究发展计划 (973计划 )项目 (2002CB111301); 中国农业科学院所基金项目
(2060302-2-07)
作者简介: 赵永涛(1981–), 男, 在读硕士, 主要从事小麦基因组学研究。
*
通讯作者(Corresponding authors): 詹克慧, E-mail: kh486@163.com; 孔秀英, E-mail: xykong@mail.caas.net.cn
Received(收稿日期): 2008-03-11; Accepted(接受日期): 2008-04-24.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01843
硬粒小麦 Glu-B3基因家族新成员的克隆及其分子标记的开发
赵永涛1,2 孔秀英2,∗ 詹克慧1,*
(1河南农业大学农学院, 河南郑州 450002; 2中国农业科学院作物科学研究所 / 农业部作物种质资源与生物技术重点开放实验室 / 国
家农作物基因资源与基因改良重大科学工程, 北京 100081)
摘 要: 获得小麦低分子量谷蛋白基因家族新成员, 为深入研究该基因家族的组成及其在染色体上的分布与进化奠
定基础。本研究根据已发表的小麦低分子量麦谷蛋白基因序列设计了 1对简并引物, 以从硬粒小麦品种 Langdon BAC
文库中筛选的携带小麦低分子量谷蛋白基因的 BAC 为模板, 利用同源序列克隆技术克隆了 1 个 MET 类型的小麦低
分子量谷蛋白基因 LMWLDN-M, 该基因编码 350个氨基酸。利用 LMWLDN-M与本实验室克隆的 Langdon品种其他
类型的小麦低分子量谷蛋白基因之间的 SNP, 设计了该类型基因特异的引物。以 Langdon代换系和中国春小麦缺体-
四体为模板进行 PCR扩增, 将该基因定位到小麦 B基因组上。序列分析表明, LMWLDN-M为 Glu-B3基因家族的一
个新成员。
关键词: 硬粒小麦; 低分子量麦谷蛋白; 基因家族; 同源序列克隆
Cloning a New Member from Glu-B3 Locus in Durum Wheat and Deve-
loping Its Specific Marker
ZHAO Yong-Tao 1,2, KONG Xiu-Ying 2,∗, and ZHAN Ke-Hui 1,∗
(1 College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan; 2 Key Laboratory of Crop Germplasm and Biotechnology, Minis-
try of Agriculture / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agri-
cultural Sciences, Beijing 100081, China)
Abstract: A new member of Glu-B3 gene family was isolated from durum wheat Langdon variety. According to the alignment of
the conserved N- and C- terminal domains of the deduced amino-acid of LMW-GS genes in GenBank, a pair of degenerate prim-
ers was designed. Using this primer pair, an M-type LMW-GS gene was identified from Langdon. The gene, designated as
LMWLDN-M, encodes 350 amino acids. Compared with other sequences of Glu-3 isolated from Langdon in our laboratory, a SNP
was detected and thus a gene specific marker was developed. This marker can also be used to map the gene LMWLDN-M onto the
chromosome 1B using LDN D-genome disomic substitution lines and CS nulli-tetrasomic lines as templates. By comparison with
other members of Langdon isolated before, we confirm that LMWLDN-M is a new member of Glu-B3 family. After sequencing the
BAC carrying this gene, it can help us to understand the complex Glu-3 loci well.
Keywords: Durum wheat; Low-molecular-weight glutenin subunit; Gene family; Homology-based cloning
小麦种子贮藏蛋白约占小麦种子总蛋白的 80%以上,
主要存在于小麦胚乳中[1-2]。小麦贮藏蛋白分为麦谷蛋白
和麦醇溶蛋白, 它们是小麦面筋的主要成分。根据分子量
的不同, 前者又可分为高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)
和低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS), 被分别定位在小麦
第一同源群染色体的长臂和短臂上[3-4]。由于HMW-GS基
因在小麦的每个基因组中只有 2个拷贝, 因此对其基因的组
成和在染色体上的分布及进化特点研究得比较清楚[5-8]。而
LMW-GS是由多拷贝基因编码的, 在六倍体小麦中可能存
在 30∼40 个拷贝[9-10], 再加上LMW-GS基因与醇溶蛋白基
因在遗传上紧密连锁[11-13], 在氨基酸序列上有比较高的同
源性及在蛋白水平上不易与醇溶蛋白分离的特点[14], 所以
目前关于LMW-GS基因的组成、分布及进化的信息较少。
Wicker等 [15]在栽培一粒小麦(Triticum monococcum)
1844 作 物 学 报 第 34卷

1AS上 420 kb的区域内鉴定了 3个LMW-i型成员, 对其中
2个BAC的序列分析表明, 其所携带的Glu-A3基因家族的
2 个成员的核苷酸序列相似性高达 99.4%, 而它们在染色
体上的物理距离至少在 150 kb以上。Wicker等[15]在四倍体
硬粒小麦(T. turgidum subsp. durum) Langdon 1AS染色体
上 142 kb的BAC克隆 107G22中鉴定出 1个LMW-i成员; 本
实验室也从该文库中的一个 140 kb的BAC克隆 790O10中
鉴定 1个LMW-i成员, 该BAC克隆与 107G22重叠约 35 kb,
2个LMW-i型成员核苷酸序列的同源性为 94%, 它们之间
至少相距 100 kb以上[16]。Johal等[17]在粗山羊草(Aegilops
tauschii) D基因组BAC文库中鉴定出 7 个LMW-m型成员,
其核苷酸序列相似性在 85%以上, 其中有 2个成员的序列
同源性为 98.69%, 推测各个成员至少相距几十万个碱基。
Özdemir等[18]对六倍体小麦(T. aestivum) Glenlea的BAC文
库进行筛选, 共获得 91 个BAC跨叠群和 282 个singleton,
但尚不清楚该LMW-GS基因家族的组成、分布与进化情
况。
目前, 虽然在四倍体硬粒小麦中研究了A基因组上 2
个 LMW-i 型和 B 基因组上 1 个 LMW-s 型成员在染色体
上的分布与进化特点, 但对其他成员的研究尚未进行, 而
进行这一研究的限制因素是如何区分来自小麦各基因组
的不同成员。本文从四倍体硬粒小麦 Langdon BAC文库
中鉴定了 1 个新的 Glu-B3 基因家族成员, 并开发了该类
型基因的特异分子标记 , 这一结果将为深入研究小麦低
分子量谷蛋白基因家族的组成、分布与进化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
硬粒小麦 Langdon BAC 阳性克隆由 Gu Yongqiang
博士(USDA-ARS, Western Regional Research Center)提供;
Langdon 及其 1A 和 1B 的代换系—LDN1D(1A)和 LDN1D
(1B)由 Steven S Xu博士(USDA-ARS, Northern Crop Science
Laboratory)提供; 中国春及其缺体-四体材料 CSN1AT1B、
CSN1AT1D、CSN1BT1A、CSN1BT1D、CSN1DT1A 和
CSN1DT1B由本室保存。
1.2 DNA的提取
参考Jia等[19]的方法提取植物叶片DNA; 用碱裂解法
[20]提取BAC质粒DNA。
1.3 LMW-GS 基因编码区的扩增及 PCR 产物的回收与
纯化
根据 GenBank中的 LMW-GS基因序列(AB062852、
AJ007746、AB062868、AJ293097 等)的 N末端和 C末端
的保守区设计了 1对简并保守引物 Glu (1, 2), Glu1为 5′-A
TGAAGACCTTCCTCRTCTTTG-3′; Glu2 为 5′-CAGTAG
RCACCAACTCSGRT-3′, 引物由上海英骏生物技术有限
公司合成。
PCR体系为 25 μL, 含 25 mmol L−1dNTP, 45 ng引物,
0.75 U Taq酶, 10×PCR buffer, 50 ng模板DNA。PCR程序
为 95℃预变性 5 min; 94℃ 1 min, 60℃ 1 min, 72℃ 2 min,
30个循环; 72℃延伸 7 min。
PCR扩增产物用 1.2%琼脂糖凝胶电泳分离, 电压为
5 V cM−1。用北京百泰克公司的DNA回收试剂盒进行目的
片段的回收与纯化。
1.4 目的片段的克隆与测序
将目的片段连接到 T-easy载体(全式金生物技术有限
公司)上, 并将其转入 TOPO10 感受态细胞。在涂有羧苄
青霉素及 X-gal/IPTG的 LB平板上挑取白色菌斑, 并将其
转移到含有羧苄青霉素的 LB液体培养基上进行摇菌与提
质粒。重组克隆经 PCR验证后选择 6个正确的质粒用 ABI
公司的 3730测序仪进行测序。
1.5 序列分析
用 DNAMAN 进行基因的氨基酸序列推断 , 用
DNAStar 和 NCBI 网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的
相关软件进行 DNA和氨基酸序列的比对分析。
1.6 基因特异引物的设计
将本研究克隆的基因编码区与本实验室从 Langdon
BAC 中分离的其他类型的低分子量谷蛋白基因的编码区
用 MegAlign 进行序列比对分析 , 选取 SNP 位点 , 用
DNAStar中的 PrimerSelect设计引物。
2 结果与分析
2.1 LMW-GS基因序列的获得
利用引物Glu(1, 2)对已鉴定的携带小麦Glu-3基因的
阳性BAC克隆进行PCR扩增。在BAC克隆D10中扩增出一
条约 1 050 bp的片段(图 1), 将该片段进行克隆转化后, 选
择 6个正确的克隆用来测序。序列分析表明该片段含有一
个完整的LMW-GS基因序列 , 将其命名为LMWLDN-M,
它编码 350个氨基酸(图 2)。根据DNAMAN推测的N末端
氨基酸序列可知该LMW-GS基因的序列类型为M型 , 具
有一般的LMW-GS基因的典型结构, 在重复序列和C末端
含有 8个半胱氨酸残基(图 2), 根据Ikeda等[21]LMW-GS半
胱氨酸的分布类型标准, 我们所克隆的基因为Type I。



图 1 PCR扩增产物电泳图谱
Fig. 1 Electrophoresis of PCR products
1: BAC D10; M: 100 bp DNA ladder.
第 10期 赵永涛等: 硬粒小麦 Glu-B3基因家族新成员的克隆及其分子标记的开发 1845




图 2 LMWLDN-M核苷酸序列及推断氨基酸序列
Fig. 2 Nucleotide sequence and its deduced amino acid sequence of
LMWLDN-M
简并保守引物、特异引物和半胱氨酸残基分别用单下划线、
双下划线和方框表示。
Degenerate primers, specific primers, and cysteines are marked by
single underline, double underline, and box, respectively.
2.2 LMWLDN-M 与 Langdon 中已克隆的 LMW-GS 基
因的序列比对分析
氨基酸序列比对分析表明(图 3), LMWLDN-M与 Glu-
B3 位点上的 Y14104 和 EF426564 相似性最高, 分别为
98.6%和 75.1%; 与 Glu-A3 位点上 LMW-i 型序列
AJ293097、 EF426565、 AY146587及 AJ293098的相似
性分别为 60%、61.1%、59.7%和 60.2%, 但与 Glu-A3 位
点上的 2 个 LMW-m 型的基因 AJ293099 和 X62588 的相
似性分别为 73.8%和 73.3%。由于 LMWLDN-M与 Y14104
的相似性很高, 我们进行了重复实验, 结果得到同样的序
列差异, 说明 LMWLDN-M 与 Y14104 序列间的差异是真
实存在的, 它们是 Langdon B基因组低分子量谷蛋白基因
家族中同源关系很近的 2个成员。
2.3 LMWLDN-M与小麦其他品种中已克隆的 LMW-GS
基因的序列比对分析
图 4表明, LMWLDN-M首先与位于 B基因组的 M类
型的 LMW-GS 基因聚为一类 , 与 B 基因组的 S 类型
LMW-GS 基因的亲缘关系次之, 与 Glu-A3 位点编码的
LMW-GS 基因的亲缘关系最远。这与该基因同 Langdon
品种中其他的 LMW-GS 基因的聚类结果相同 , 说明
LMWLDN-M可能为 Glu-B3位点上的基因。从总的聚类图
来看, LMW-GS基因被聚为两大类, 所有来自小麦 A基因
组的 I型基因被聚为一类, 而来自小麦不同基因组的所有
M型基因被聚为另一类, 由于 S型基因(SHIPGL)是 M型



图 3 硬粒小麦品种 Langdon中已克隆的 Glu-3基因序列的聚类分析
Fig. 3 Dendrogram of the gene sequences of Glu-3 from durum wheat variety Langdon

基因(MENSHIPGL)加工后而形成的 [14], 所以S型被聚在
M型这一大类里。从图 4的聚类分析可以说明M型的基因
与S型的基因的亲缘关系要比M型与I型基因的亲缘关系
要近, 这种聚类关系与S型是由M型演化而来[14], I型是由
二倍体A基因组的某一类M型演化而来的进化关系相符
[16]。
2.4 LMWLDN-M基因特异标记的开发
根据 LMWLDN-M与本实验室在四倍体小麦 Langdon
中克隆的其他类型的 LMW-GS 基因序列的比较分析, 选
择 SNP 位点设计一对特异引物 Glu-M1-2, SNP 位点和引
物位置如图 5 方框中和图 2 中双下划线所示。引物序列
Glu-M1 为 5′-TCCCTAGCTTGGAGAAACCATT-3′; Glu-
M2 为 5′-TGCAACAAGGTACCCTGG-3′。经实验摸索
PCR的最佳退火温度为 58℃, 在该条件下, 引物 Glu-M1-
2在四倍体小麦 Langdon及其第一同源群代换系和中国春
及其第一同源群缺体-四体中均表现出很好的特异性(图
6), 这进一步证实 LMWLDN-M为 Glu-B3位点上的基因。
用该特异引物对本实验室从 Langdon BAC文库中获得的
其他不同类型的 LMW-GS基因的BAC克隆进行扩增, 发现
只在 N 末端以 METSHIPSLEKPL 开始的基因的 BAC 克隆
C10、D10和 E10中才有扩增, 而 N末端以 ISQQQQPPPFS、
ISQQQQQQPFPR、METSHNPGLEKPS、MENSHIPGL-
1846 作 物 学 报 第 34卷



图 4 小麦不同低分子量麦谷蛋白基因在氨基酸水平上的聚类分析
Fig. 4 Dendrogram based on deduced amino acid sequences of wheat LMW-GS genes
I, S, and M in the middle of the gene’s accession number indicate LMW-GS type of this gene. A, B, and D at the end of the accession number indicate
the genome location of this gene.



图 5 从 Langdon BAC文库中分离的不同类型 LMW-GS基因之间的序列比对分析及特异引物序列的选择
Fig. 5 Comparison of different LMW-GS genes from Langdon BAC library and the selection of specific primers

第 10期 赵永涛等: 硬粒小麦 Glu-B3基因家族新成员的克隆及其分子标记的开发 1847




图 6 引物 Glu-M1-2在不同材料中的扩增情况
Fig. 6 PCR products amplified from LDN D-genome disomic substitu-
tion lines and CS nulli-tetrasomic lines with primer Glu-M1-2
1: LDN; 2: LDN1D(1A); 3: LDN1D(1B); 4: Chinese Spring; 5:
CSN1AT1B; 6: CSN1BT1A; 7: CSN1AT1D; 8: CSN1BT1D;
9: CSN1DT1A; 10: CSN1DT1B; M: 100 bp DNA ladder.
ERPS开始的 LMW-GS基因的BAC克隆A9, A12, F12, G5;
B7, D5, F11; B11, C5, E1; A6, B6, B9, B10, C6, C9, E3, F3,
G4, H2, H4 均无扩增(图 7)。这说明引物 Glu-M1-2 为 N
末端以METSHIPSLEKPL开始的 LMW-GS基因的特异引
物。
3 讨论
小麦LMW-GS是由多拷贝基因编码的, 在六倍体小
麦中可能有 30∼40 个拷贝[9-10], 二倍体D基因组有 7 个拷



图 7 引物 Glu-M1-2在 Langdon含有不同类型 LMW-GS基因的 BAC克隆中的扩增情况
Fig. 7 PCR products amplified from different BACs of Langdon that contained different types of LMW-GS genes
1: BAC A6; 2: BAC A9; 3: BAC A12; 4: BAC B6; 5: BAC B7; 6: BAC B9; 7: BAC B10; 8: BAC B11; 9: BAC C5; 10: BAC C6; 11: BAC C9; 12:
BAC C10; 13: BAC D5; 14: BAC D10; 15: BAC E1; 16: BAC E3; 17: BAC E10; 18: BAC F3; 19: BAC F11; 20: BAC F12; 21: BAC G4; 22: BAC G5;
23: BAC H2; 24: BAC H4; 25: LDN; 26: LDN1D(1A); 27: LDN1D(1B); M: 100 bp DNA ladder.

贝 [17], 由此可以推测四倍体小麦中LMW-GS基因的成员
数可能有 14∼25 个, 每个基因组至少有 7 个拷贝。目前
GenBank中已注册的来自四倍体小麦 Langdon品种的
LMW-GS基因序列有 8条, 其中A基因组LMW-i型为 4条,
LMW-m型为 2 条; B基因组LMW-m和s型各 1 条。在
Langdon的 8条序列中, 其中 5条是以Langdon品种基因组
DNA为模板通过PCR扩增获得的基因序列, 另外 3条是来
自BAC序列。来自Langdon A基因组的 2个BAC形成了 265
kb的连续区段, 其上携带 2个LMW-i型基因[15-16], Wicker
等 [22]将该区段又延伸了一个BAC, 使该区段的长度达到
380 kb, 但没有新的LMW-GS基因出现, 由此可见, A基因
组的LMW-GS基因家族成员之间至少相距 100 kb以上。对
B基因组而言 , 我们已注册的来自Langdon B基因组的
LMW-s型基因[16]与本研究鉴定的B基因组的LMW-m型基
因的BAC克隆并不重叠, 因为对BAC D10 克隆的末端测
序及与EF426564 序列的比对分析并没有发现同源序列,
推测这 2种类型的基因在染色体上相距很远。来自同一基
因组的同种类型的LMW-GS基因在聚类时会首先聚为一类
(图 4), 那么它们在染色体上的分布是否同类型的基因也会
以相邻的方式进行排列 , 需待每一基因组的所有
LMW-GS基因家族成员都鉴定清楚 , 并且将携带它们的
BAC克隆形成一个连续的BAC跨叠群才会有一个明确的
答案。
LMW-GS是由基因家族所编码, 在鉴定其家族成员
时所开发的基因特异分子标记 , 一方面可被用来区分基
因家族的不同成员, 另一方面可成为Glu-3 基因的功能分
子标记的潜在来源。Zhao等[23]利用从粗山羊草BAC文库
中鉴定的 7个LMW-GS基因, 开发了 2个Glu-D3基因的功
能分子标记。本研究开发的标记也可以为小麦分子标记辅
助育种提供参考。
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