全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(2): 330−332 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家基础研究发展计划(973计划)项目(2004CB117206)；国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10Z1C1)
作者简介: 汪潇琳(1981–)，女，硕士研究生，研究方向：植物基因工程。E-mail: xiaolinwang2001@yahoo.com.cn
* 通讯作者(Corresponding author): 喻德跃, 教授, 博士生导师。Tel/Fax: 025-84396410; E-mail: dyyu@njau.edu.cn
Received(收稿日期): 2007-05-23; Accepted(接受日期): 2007-08-19.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00330
MADS-box基因 GmAGL15在大豆种子发育过程中的表达
汪潇琳 陈艳萍 喻德跃*
(南京农业大学国家大豆改良中心/作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095)
摘 要: 以同源序列法克隆了大豆MADS-box基因GmAGL15, 序列分析表明, 该基因编码的氨基酸与拟南芥AGL15
蛋白的同源性为 61%, 其中在 MADS 区的同源性为 84.3%, K 区的同源性为 63.2%。半定量 RT-PCR 分析表明,
GmAGL15在幼胚中高度表达, 而没有检测到在根、茎、叶和花中的表达。荧光定量 RT-PCR分析发现, GmAGL15在
大豆种子发育的不同时期均有不同程度的表达, 其中在开花后 15 d的幼胚中表达量较高, 而在开花后 30 d的幼胚中
表达量最高。以上结果显示, 基因 GmAGL15对于大豆种子发育的调控可能有重要作用。
关键词: 大豆; 种子发育; GmAGL15; 表达
Expression of the MADS-Box Gene GmAGL15 in Seed Development of
Soybean
WANG Xiao-Lin, CHEN Yan-Ping, and YU De-Yue*
(National Center for Soybean Improvement, National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural Uni-
versity, Nanjing 210095, Jiangsu, China)
Abstract: AGL15 (AGAMOUS-like 15) is the only MADS domain regulatory factor identified to date that is expressed in a
highly preferential manner in developing plant embryos. In this study, an AGL15–like gene was obtained from soybean by ho-
mology-based cloning method, here named as GmAGL15. Sequence analysis indicated that Arabidopsis AGL15 and GmAGL15
shared 61% of identity at amino acid level, especially 84.3% in the MADS domains, 63.2% in the K domains. RT-PCR analysis
showed that GmAGL15 expressed only in embryos. A real-time PCR was performed to observe the expression profiling of
GmAGL15 in developing seeds, and the results indicated that the expression of GmAGL15 appeared two peak values, at 15 DAF
(days after flowering) and at 30 DAF. GmAGL15 was expressed at approximately 10-fold higher levels at the 30 DAF than other
time of seed development. Based on these data, we suggest that GmAGL15 is likely to be an important component of the regula-
tory circuitry directing seed specific processes in soybean.
Keywords: Soybean (Glycine max L.); Seed development; GmAGL15; Expression
植物生长发育过程中有很多基因参与调节 , 其中
MADS-box基因是最主要的基因之一。该基因编码的蛋白
质是一类转录因子即反式作用因子 , 其与真核基因启动
子区域中的顺式作用元件特异结合 , 从而使靶基因以特
定的强度在特定的时间和空间表达[1]。MADS-box基因在
植物花分生组织、花器官和营养器官中均有不同形式的时
空表达模式, 发挥不同的作用[1]。
AGL15 基因是 MADS-box 基因家族的成员之一[2],
有关该基因在拟南芥幼胚不同发育时期的表达已有详细
研究。AGL15基因的表达产物主要积累在幼胚中[3], 可能
参与延迟和下调种子的衰老程序 , 改变种子的水分丧失
过程。在油菜上, Heck等[4]发现 AGL15同源基因在幼胚发
育不同时期均有表达, 而 Perry 等[2]在油菜、豌豆、玉米
及紫花苜蓿的幼胚中也检测到了 AGL15 特异性蛋白。但
有关大豆 AGL15同源基因的表达特征以及作用还未知。
经过搜索 GenBank 序列库, 我们发现已有一个大豆
AGL15 同源序列登录(登录号为 AY370659), 但关于此基
因表达信息没有任何报道。因此, 为了探讨 AGL15 同源
第 2期 汪潇琳等: MADS-box基因 GmAGL15在大豆种子发育过程中的表达 331


基因在大豆中的作用 , 本研究应用同源序列法从大豆上
克隆了 AGL15 同源基因, 研究了其在不同器官及种子不
同发育时期表达特征 , 以期为大豆种子发育分子机理的
研究提供一些线索。
1 材料与方法
1.1 材料
大豆品种南农 N2899, 由南京农业大学国家大豆改
良中心种质资源研究室提供。种子播种于装有蛭石的花盆
中, 长出 2 片真叶后, 用无菌水清洗根、茎及叶片, 再用
干净的吸水纸吸干 , 液氮速冻后保存于−80℃冰箱中。
2005 年 6 月种植于江苏省农科院网室, 花期每天挂牌于
盛开的花上, 并标记开花日期, 取花以及开花后 10、15、
20、25、30、35、40、45、50 d的幼荚剥取幼胚, 液氮速
冻后保存于−80℃冰箱中。
1.2 方法
1.2.1 RNA 提取和 cDNA 合成 取适量实验材料, 置
高温处理过的研钵中, 加液氮研磨, 采用天为时代 DP406
试剂盒提取总 RNA, 取 2 μg总 RNA以 Olig dT18为引物
进行反转录。反转录酶为 TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)
Ver. 3.0。反应程序为 30℃ 10 min; 42℃ 30 min; 99℃ 5
min; 5℃ 5 min。反转录体系含 MgCl2 25 mmol L−1 2 μL,
10×RT buffer 1 μL, RNase Free dH2O 3.75 μL, dNTP Mix-
ture(各 10 mmol L−1) 1 μL, RNase Inhibitor 40 U μL−1 0.25
μL, AMV Reverse Transcriptase 5 U μL−1 0.5 μL, Oligo
dT18 2.5 μmol L−1 0.5 μL, Sample RNA2 μg μL−1 1 μL。
1.2.2 特异性引物设计及克隆 根椐 GenBank(登录号
AY370659)提供的大豆 AGL15 同源基因的序列设计特异
引物 , 全长上游引物 5′-ATGGGTCGAGGGAAAATCGA
GATCAAAAG-3′和全长下游引物 5′-CTAAACATTGTCT
TCATTAGAAATTTCAC-3′均由上海英骏公司合成, 扩增
片段为 708 bp, 连入 pCF-T载体(天为时代), 大肠杆菌菌
株 DH5α由本实验室保存。测序由上海英骏公司完成。
1.2.3 半定量 PCR 在 20 μL 反应体系中加入 cDNA
模板 1 μL, 全长上下游引物各 4 nmol L−1, 2.5 μL 10×
PCR缓冲液, dNTP各 0.2 mmol L−1, 1.5 mmol L−1 MgCl2,
0.8 U rTaqDNA聚合酶(TaKaRa公司), 进行 RT-PCR扩增。
94℃变性 5 min, 然后 94℃ 30 s, 50℃ 30 s, 72℃ 1 min,
循环 33次, 再 72℃延伸 10 min。同时设置 β-actin内参对
照 , 扩增产物在 1.0 %的琼脂糖凝胶上电泳分离。用
JS-380A 自动凝胶图像分析仪( 琣上海 清科技有限公司)拍
照、保存。
1.2.4 荧光定量 PCR 荧光定量上游引物为 5′-CTG
TGTCTTAATTTCTGCTAC-3′; 荧光定量下游引物为 5′-
ATTGAGGAGCTTCGGTGTCTG-3′; 扩增片段长度为
185 bp。应用 Bio-Rad iCycler iQ实时定量 PCR仪, 使用
EvaGreen PCR试剂( Biotium, USA )以大豆不同发育时期
(10、15、20、25、30、35、40、45、50 DAF)的幼胚 cDNA
为模板, 应用设计的引物进行 PCR扩增。扩增体系含 2 μL
cDNA, 4 nmol L−1引物, 10 μL反应 MIX, 6 μL ddH2O, 总
体积 20 μL。反应程序为 95℃变性 15 min; 95℃变性 15 s,
50℃退火 30 s, 72℃延伸 40 s, 40个循环; 反应结束后分析
荧光值变化曲线以及融解曲线。
在荧光定量 PCR 技术中, 有一个很重要的概念——
Ct值。C代表 Cycle, t代表 threshold, Ct值的含义是每个
反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
△Ct 是看家基因的归一化, 目的是消除样品间模板量的
差异, △△Ct 是基准品的归一化(如正常的样品 VS 处理
样品中, 正常样品即为基准品), 在这里将表达量最低的
样本 45 作为基准品。因为△△Ct 是指数表达方式, 因此
转换为线性表达方式即为 2- Ct△△ [5-11]。
2 结果与分析
2.1 大豆 AGL15同源基因的序列分析
序列分析发现, 克隆的大豆 AGL15同源基因(命名为
GmAGL15)编 码的氨基酸 与 GenBank 登录的序 列
(AY370659)有 13 个氨基酸差异, 其中差异最大的部分在
K 盒区域 ,有 7 个氨基酸的差异 (未展示 )。比较发现
GmAGL15 与拟南芥 AGL15 在 MADS 区的同源性为
84.3%, K区的同源性为 63.2%(图 1)。



图 1 大豆与拟南芥 AGL15蛋白的氨基酸序列比较
Fig. 1 Amino acid sequence comparison of AGL15 between Soy-
bean and Arabidopsis
AtAGL15: 拟南芥 AGL15 蛋白; GmAGL15: 大豆 AGL15蛋白。双下
划线为 MADS-box域, 单下划线为 K-box域。
AtAGL15: AGL15 from Arabidopsis; GmAGL15: AGL15 from soy-
bean .The MADS-box domains are double underlined and K-box do-
mains are underlined.


2.2 组织表达分析
为了明确 GmAGL15 基因在不同器官中的表达特征,
本研究采用了半定量 RT-PCR的分析方法。结果发现, 该
基因主要在大豆幼胚中表达, 而在根、茎、叶、花中均没
有检测到表达信号(图 2)。
332 作 物 学 报 第 34卷



图 2 GmAGL15基因在不同器官中的表达
Fig. 2 RT-PCR analysis of GmAGL15 in different organs
R: 根; S: 茎; L: 叶; F: 花; E: 幼胚。
R: root; S: shoot; L: leaf; F: flower; E: embryo.

2.3 在种子发育过程中的表达分析
为了进一步揭示 GmAGL15 在种子发育过程中的表
达状况, 取不同发育时期的种子提取RNA进行荧光定量分
析。结果发现, GmAGL15在种子的不同发育时期均有所表
达, 其转录本在不同时期的幼胚中的含量变化较大, 在开
花后第 15 天的幼胚中出现第一个峰值, 而在第 30 天的幼
胚中表达量最高, 出现第二个峰值, 然后显著下降(图 3)。


图 3 GmAGL15在种子不同发育时期的表达
Fig. 3 Expression of GmAGL15 in developing seeds
3 讨论
Heck 等研究表明, AGL15 同源基因在油菜幼胚过渡
期、中心期、成熟期均有表达, 且在第 26 天的幼胚中表
达量最高[4], Rounsley等的研究也表明, AGL15基因在幼
胚发育早期就有表达, 并持续到种子萌发时期[12]。Perry
等还发现只要有幼胚组织存在, 就可以检测到 AGL15 特
异性蛋白[13]。AGL15同源基因在芸薹授粉后 6 d就有表达,
并且迅速增加直到授粉后 16 d, 在授粉后第 30 天表达量
最大, 随后迅速下降, 由此推测, 该基因在表达量上的差
异显示它在胚柄与胚乳中的表达是暂时的[14]。本研究发
现 GmAGL15 基因在大豆发育的种子中都有表达, 这种表
达明显与种子的发育过程有关。GmAGL15 基因在时空上
的表达特征表明它可能作为一个种子发育相关的调节因
子。Hajduch 等 [15]将大豆幼胚发育时期分为成形期(1~2
周)、细胞分裂期(3~4 周)和细胞增大期(5~6 周)。通过荧
光定量 PCR分析发现, GmAGL15在花后第 15天的幼胚中
表达量比较高 , 表明该基因在幼胚形成时期具有重要作
用。参考 Hajduch 等的分类, 花后第 15 天大概是幼胚成
形期的后期和细胞分裂期的前期 , 这时对于种子发育是
一个重要时期, 因此, GmAGL15基因的表达水平较高。而
在花后第 30 天, 即在细胞分裂期的后期和细胞增大期的
前期, 对于幼胚发育也是一个重要的转折时期[15], 所以,
该基因在花后第 30 天的幼胚中表达量非常高, 然后即迅
速下降。这种戏剧性变化的原因可能是该基因在此时间段
瞬时表达, 而正值大豆幼胚中各种代谢最为旺盛的时期。
GmAGL15 基因在此时表达量陡然升高, 说明该基因可能
调控与贮藏蛋白合成等相关基因的表达 , 这个信息对大
豆品质育种有重要的参考价值。当然, 至于该基因在大豆
种子发育过程中的确切作用 , 将在后续研究中通过转基
因技术来深入揭示。
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