全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(7): 1143−1152 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家重点基础研究发展计划(973计划)前期项目(2006CB708208); 国家科技支撑计划项目(2006BAD01A02)
作者简介: 吴金华(1978–), 女, 山西朔州人, 博士, 主要从事小麦抗病育种及其分子生物学研究。E-mail: wjhua2@126.com
*
通讯作者(Corresponding author): 吉万全(1963–), 男, 博士, 教授, 博士生导师, 主要从事小麦遗传育种与分子生物学研究。
E-mail: jiwanquan2003@126.com
Received(收稿日期): 2007-11-29; Accepted(接受日期): 2008-03-12.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01143
小麦种质 N9436抗白粉病的特异基因表达谱分析
吴金华 胡银岗 张 宏 王长有 王秋英 吉万全*
(西北农林科技大学农学院 / 陕西省农业分子生物学重点实验室 / 国家小麦改良中心杨凌分中心, 陕西杨凌 712100)
摘 要: 为了解白粉菌诱导下抗白粉病小麦的抗病机制, 构建了白粉菌接种初期小麦抗性种质 N9436 的抑制性消减
杂交文库。从文库中随机挑取 140 个阳性克隆, 测序结果表明, 冗余重复序列占 32.86%, 其中谷胱甘肽转移酶表达
频率最高, 其次为参与能量代谢的二磷酸核酮糖大小亚基。去除冗余序列和重复序列后, 得到 94条 EST, 利用 NCBI
的 BLAST在线序列比对工具对 GenBank的核酸和蛋白质数据库进行同源性比对和功能分析。BlastX比对结果表明,
有 49条 EST与已知功能蛋白同源性较高, 主要涉及抗病与防御(包括生物及非生物胁迫)、能量代谢、细胞结构、蛋
白质合成及加工、转运及信号转导等过程的相关蛋白。BlastN比对 NCBI的非冗余核酸数据库, 其中 69条序列与 EST
数据库中的 Unigene 具有较高的同源性, 20 条与 EST 数据库中的同源性较高, 另外 5 条序列找不到同源序列。通过
对核酸和蛋白质同源性的比较和功能分析发现, 比对结果一致的序列有 33条, 涉及白粉病抗性的相关蛋白 22个, 其
中与抗病信号传导相关的蛋白 6个, 过敏性坏死反应(HR)体系表达蛋白 2个, 系统获得性抗性(SAR)体系病程相关蛋
白 4个, SAR体系诱导防卫蛋白 10个。
关键词: 小麦; 白粉病; 抗病基因; 抑制性消减杂交; 表达序列标签
Expression of Special Genes Resistant to Powdery Mildew (Blumeria
graminis f. sp. tritici) in Wheat Germplasm N9436
WU Jin-Hua, HU Yin-Gang, ZHANG Hong, WANG Chang-You, WANG Qiu-Ying, and JI Wan-Quan*
(College of Agronomy, Northwest A＆F University / Yangling Branch of China Wheat Improvement Center / Shaanxi Key Laboratory of Molecular
Biology for Agriculture, Yangling 712100, Shaanxi, China)
Abstract: Powdery mildew, caused by Blumeria graminis f. sp. tritici (syn. Erysiphe graminis f. sp. tritici), is one of the most
important fungal diseases of common wheat (Triticum aestivum L.) worldwide and causes severe yield losses. Wheat germplasm
N9436, developed by our research group, is a resistant material to powdery mildew. In the present study, a suppression subtraction
hybridization (SSH) cDNA library was constructed with cDNA from N9436 leaf inoculated by Blumeria graminis as the tester and
cDNA from N9436 healthy leaf as the driver. A total of 140 positive clones were randomly chosen from the SSH-cDNA library
and were amplified with sp6 and t7 primers to examine the insert size. Their sizes ranged from 200 to 1 000 bp with an average of
238 bp. Among the 140 clones, 32.86% showed redundant and repeated sequences by sequence analysis. The most frequent se-
quence was glutathione transferase and followed by ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small/large subunit. After
screening repeat and redundant sequences, 94 ESTs were acquired. Nucleic acid and protein homology search were performed
using the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) program with the default settings at NCBI website (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov). BlastX results in nr-protein database revealed that 49 ESTs were highly homologous with known proteins involved
in disease resistance and defenses, energy metabolism, cell structure, protein synthesis and processing, transport and signal trans-
duction. BlastNr results showed that 69 and 20 ESTs had high identities with known Unigene and function-unknown ESTs, re-
spectively, and 5 ESTs matched none in the nr-database. Compared with BlastX and BlastNr analysis, 33 ESTs were both in the
nucleic acid and protein databases including 22 ESTs associated with powdery mildew resistance, out of which 6 for signal trans-
duction, 2 for hypersensitive necrosis reaction (HR) system, and 14 for systemic acquired resistance (SAR) system, respectively.
1144 作 物 学 报 第 34卷

Keywords: Wheat; Powdery mildew; Suppression subtraction hybridization (SSH); Expressed sequence tag (EST)
白粉病是由(Blumeria graminis f. sp. tritici)引起
的世界性小麦真菌病害之一, 也是目前危害我国小
麦生产的主要病害之一。该病是大区性气传病害 ,
传播距离远, 流行面积广, 危害程度重。白粉病原菌
的生理小种多, 毒性变异速度快, 很容易造成品种
抗病性的丧失。研究抗病机制是寻找抗病育种新方
法的有效途径, 因此加强抗病反应机制研究、延长
抗病品种的“寿命”和拓宽抗病品种的抗病谱非常重
要[1]。培育抗病新品种的基本途径, 一是发现与利用
新的抗病基因, 二是诱导防御基因的适当表达。抗
病基因的产物决定抗病系统能否打开或打开的程度,
而真正起抗病作用的是防御基因[2]。由于系统获得
性抗性(SAR)具有系统性、持久性、广谱性的特点,
研究其作用机制不仅有理论价值, 也有实际意义。
骆蒙等[3]构建了一个白粉菌接种初期的抑制消
减杂交文库, 获得 65 个抗病相关 EST, 通过分析抗
病相关基因表达谱 , 推测水杨酸信号传递系统、
MAP 相关信号传递系统等参与了小麦抗白粉病过
程 , 苯丙烷代谢途径参与了抗白粉病植保素的合
成。何道一等[4]以接种白粉菌的小麦-长穗偃麦草异
代换系山农 551 为材料, 利用代表性 cDNA 库扩增
(cDNA RDA)和快速 cDNA 末端扩增(RACE)技术克
隆了两个相关的新基因 WRP1和 RPW2。牛吉山等[5]
构建小麦-簇毛麦 6VS/6AL易位系经白粉菌诱导 48 h
和未经诱导的 cDNA 文库各 1 个, 揭示了不同条件
下差异基因表达情况, 为相关候选基因的分离和克
隆提供了理论基础。Chen 等[6]通过抑制性消减杂交
及电子克隆技术克隆了编码小麦抗坏血酸过氧化物
酶的全长 cDNA。Wong等[7]利用抑制性消减杂交技
术鉴定并分离了 126 个盐胁迫 cDNA。Yang 等[8]应
用抑制性消减杂交及微阵列鉴定了番茄盐胁迫应激
基因。Lin等[9]通过抑制性消减杂交技术鉴定了竹中
白化突变体的差异表达基因。
骆蒙等[3]为了获得 SAR启动与持续发挥作用相
关基因, 特别是相关信号传导途径, 构建了接种 24、
48和 72 h的混合文库。曹爱忠等[10]利用大麦基因芯
片, 将接种白粉菌 24、48和 72 h的簇毛麦叶片提取
RNA 后等量混合, 筛选簇毛麦抗白粉病相关基因。
为了解在系统获得性抗性系统充分启动的情况下具
体某一时段抗病相关基因的种类和数量, 并且揭示
小麦抗性种质在白粉菌诱导下抗病的分子基础。本
研究通过构建抗白粉病小麦在白粉菌接种前后的抑
制消减杂交文库, 分析其在白粉菌诱导下的基因表
达谱, 以期系统揭示小麦抗白粉病的分子机制, 发
现小麦抗白粉病的关键基因, 为寻找新的提高小麦
抗白粉病的有效途径奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
采用本研究室培育的小麦抗白粉病种质
N9436(多小穗, 高抗白粉病), 小麦幼苗在温室内培
养 3 周后, 采用涂抹法接种陕西关中地区白粉菌优
势小种关中 4 号, 以不接种为对照。接种后植株罩
以透明塑料桶, 保湿保温以利病原菌侵染。接种后
72 h, 分别剪取对照和接种材料的叶片约 0.2 g, 于
液氮中研磨, 提取总 RNA。
1.2 SSH-cDNA文库的构建
采用 BIOZOL总 RNA提取试剂(BIOZOL公司,
杭州)提取叶片总 RNA, 并采用 DNase I (TaKaRa公
司, 大连)处理, 去除可能残留的痕量 DNA。
将总 RNA 采用 AMV 反转录酶(Promega 公司,
美国), 以 oligo(dT)18 为引物反转录合成 cDNA, 以
接种叶片的 cDNA 为 tester, 对照叶片的 cDNA 为
driver, 依 照 PCR Select cDNA Subtraction Kit
(Clontech公司, 美国)的说明书进行抑制性消减杂交
(SSH)。
对 2次消减杂交的产物进行 2次巢式 PCR扩增,
扩增产物经纯化后, 与 pGEM-T easy 载体(Promega
公司 , 美国)连接 , 转化大肠杆菌(Escherichia coli)
DH5α感受态细胞, 转化细胞经含 100 μg mL−1氨苄
青霉素的 LB/IPTG/X-gal 平板的筛选培养, 挑选白
色克隆进行以 Sp6 和 T7 启动子序列为引物的菌落
PCR, 筛选阳性克隆并检测插入片段的大小。
1.3 序列测定及生物信息学分析
过夜培养阳性克隆, 采用 HQ&Q质粒微量抽提
试剂盒(优晶公司, 安徽)提取质粒 DNA, 送上海生
物工程有限公司测序。测序所得序列去除载体和接
头序列, 利用 DNAstar 及 CAP3 软件去除冗余序列
和重复序列以及小于 100 bp的序列, 提交 GenBank
数据库。
第 7期 吴金华等: 小麦种质 N9436抗白粉病的特异基因表达谱分析 1145


对所得 EST, 首先对 NCBI 的非冗余蛋白数据
库进行 BlastX 比对, 然后比对 NCBI 中的非冗余核
酸数据库。Blast比对结果显著性序列的判别标准参
照 Li 等[11]的方法, 即一致性大于 40%且 E 值小于
10−5。参照 Bevans等[12]的方法进行 EST功能分类。
2 结果与分析
2.1 SSH-cDNA文库的构建
经 Biozol 提取的小麦叶片总 RNA 共包含 5 条
带(图 1)。核酸蛋白仪检测表明, A260/A280值介于 1.8~
2.0, A260/A230值大于 2.0, 表明提取的总 RNA质量良
好, 达到建库要求。



图 1 小麦叶片总 RNA
Fig. 1 Total RNA of wheat leaves
1: tester; 2: driver.

经 AMV 反转录酶合成的双链 cDNA 呈弥散状
(图 2), 分布在 200~2 000 bp之间, cDNA合成效果较
好。运用 SSH 技术进行正向差减杂交, 两次巢式
PCR 扩增的 cDNA 片段采用 T/A 克隆法构建
SSH-cDNA 文库 , 文库中随机挑取阳性克隆进行
PCR 扩增 , 琼脂糖电泳检测结果表明 , 片段介于
200~1 000 bp之间(图 3), 平均为 238 bp, 表明构建
的文库质量较好。



图 2 小麦叶片 cDNA
Fig. 2 cDNA of wheat leaves
1: tester; 2: driver; M: marker (DL2000).



图 3 消减文库部分克隆的 PCR检测
Fig. 3 PCR identification of inserted fragments in the
SSH-cDNA library
Lane “M” is marker DL2000, and other lanes are 19 clones
selected randomly.
2.2 EST序列的比对分析
在经菌落 PCR鉴定的克隆中, 随机选取 140个
克隆进行测序, 去除冗余序列和重复序列以及小于
100 bp的序列后, 将获得的的 94个非重复序列递交
GenBank。GenBank序列号为 EX567357~EX567450,
dbEST-Id为 50073321~50073414。
2.2.1 BlastX 比对 对所获 94 个 EST 在 NCBI
的非冗余蛋白数据库的 BlastX比对结果表明, 49个
EST(占全部 EST的 52.1%)与已知功能蛋白同源性较
高, 主要涉及初级代谢(2%)、能量代谢(24%)、细胞
结构(2%)、转录(2%)、蛋白质的合成与加工和储藏
(16%)、转运 (4%)、信号转导 (4%)和抗病及防御
(30%)(表 1), 此外, 未知功能的 EST占 16%。
其中, 抗病及防御蛋白所占比例最大(30%), 既
包括非生物胁迫相关蛋白, 如 Z100-1(疏水蛋白)、
Z560-1(低温诱导蛋白)和 Z636(热激蛋白), 也包括
一些病程相关蛋白(Z25-1)。Z208(过氧化物酶)是过
敏性坏死反应体系表达基因。细胞色素 P450(Z219-1)
是生物体内的一类重要的多功能的血红素氧化还原
酶类, 在防御生物免受外界不良环境影响方面起重
要作用。谷胱甘肽硫转移酶(Z247-2、Z387、Z440-1、
Z608-1 和 Z709)能清除植物在抗病过程中积累的还
原性氧类(ROS), 减少 ROS 的毒性和破坏性作用 ,
从而保护植物细胞[13]。氧甲基转移酶(Z675)与木质素
合成有关。β-1,3-葡聚糖酶(Z449-1)属于病程相关蛋白,
在植物抗真菌病害的防卫反应中起重要作用[14]。
能量代谢蛋白占 24%。能量代谢中与光合有关
的蛋白, 如光系统 II蛋白(Z448-1)、叶绿素 a/b结合
蛋白(Z570-2、Z589和 Z549), 尤其是 1,5-二磷酸核酮
糖羧化酶/加氧酶(Z340-2、Z488-2、Z550、Z583、Z609-2
和 Z645)出现频率最高。1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加
氧酶是一个双功能酶, 在叶绿体基质中催化一对竞
争性反应, 即 CO2的固定和光呼吸碳的氧化[15]。丙酮
酸脱氢酶(Z601-1)在具有线粒体的任何生物细胞的
能量产生方面都非常重要, 可将糖酵解过程中产生
的丙酮酸转化成为三羧酸循环必需的乙酰辅酶
A[16]。单螺旋蛋白(Z609-1)是叶绿素 a/b 结合蛋白超
家族的远缘属, 具有一个横跨膜的 α-螺旋。
蛋白质合成、加工和储藏类中的核糖体蛋白(如
Z123、Z361、Z595、Z672和 Z711)是组成核糖体的
成分 , 其主要功能是参与蛋白质的合成。它通过
1146 作 物 学 报 第 34卷

表 1 BlastX对非冗余蛋白数据库比对结果
Table 1 Result of BlastX sequence homology analysis to nr-protein database
克隆号
Clone
GenBank登录号
GenBank acc. No.
期望值
E-value
一致性
Identity (%)
来源
Source
假定基因
Putative gene
Z622-2 EX567385 3E−06 70 A. thaliana acetyl-coA dehydrogenase, putative
Z340-2 EX567362 4E−13 100 T. aestivum ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit
Z448-1 EX567375 1E−15 97 M. truncatula photosystem II protein D1
Z488-2 EX567376 8E−23 95 T. aestivum ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit
Z549 EX567373 4E−39 100 T. aestivum chloroplast-localized Ptr ToxA-binding protein1 (TaThf1)
Z550 EX567363 8E−13 100 T. aestivum ribulose bisphosphate carboxylase small chain clone
Z570-2 EX567384 8E−10 96 T. aestivum chlorophyll a/b-binding protein WCAB precursor
Z583 EX567426 6E−51 98 T. aestivum ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit
Z589 EX567423 4E−36 96 A. thaliana LHCB3 (light-harvestingchlorophyllbindingprotein 3)
Z601-1 EX567395 5E−14 94 A. thaliana pyruvate dehydrogenase
Z609-1 EX567411 2E−16 80 A. thaliana OHP2 (ONE-HELIX PROTEIN 2)
Z609-2 EX567413 2E−11 100 T. aestivum ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase activase
Z645 EX567367 5E−09 100 P. tithymaloides ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit
Z449-2 EX567417 4E−12 91 H. vulgare beta tubulin 2
Z440-2 EX567437 9E−05 91 A. thaliana DNA binding/transcription factor
Z21 EX567435 7E−05 95 T. aestivum ubiquitin-conjugating enzyme
Z123 EX567406 1E−19 96 A. pisum putative ribosomal protein L32
Z361 EX567381 2E−08 82 T. aestivum ribosomal protein L11
Z573-2 EX567420 7E−09 96 A. thaliana 2-oxoglutarate dehydrogenase E2 subunit
Z595 EX567436 2E−17 100 T. aestivum ubiquitin/ribosomal fusion protein
Z662 EX567433 3E−19 92 A. thaliana putative CAAX prenyl protease
Z672 EX567446 2E−48 89 T. aestivum ribosomal protein L18
Z711 EX567428 3E−16 100 T. aestivum ribosomal protein L30
Z554-2 EX567377 3E−23 90 O. sativa histidine amino acid transporter
Z592-2 EX567419 3E−09 77 A. thaliana YKT61 (similar to yeast SNARE YKT6 1)
Z42 EX567415 9E−28 85 A. thaliana ARATH Ras-related protein ARA-3
Z639-1 EX567393 1E−11 68 T. aestivum serine/threonine protein kinase
Z25-1 EX567369 9E−22 100 T. aestivum pathogenisis-related protein 1.1 (PR-1.1)
Z74 EX567414 2E−05 100 A. thaliana aldehyde dehydrogenase homolog
Z100-1 EX567403 4E−09 60 A. thaliana ARATH Dehydration-responsive protein RD22 precursor
Z208 EX567370 2E−10 61 T. aestivum peroxidase (POX2)
Z219-1 EX567404 5E−05 76 A. thaliana putative cytochrome P450
Z247-2 EX567361 3E−22 63 T. aestivum glutathione transferase F6 (gstf6b)
Z387 EX567358 1E−24 91 T. aestivum glutathione S-transferase 2 (GST class-phi)
Z440-1 EX567360 7E−32 98 T. aestivum glutathione-S-transferase 1
Z449-1 EX567388 2E−10 83 O. sativa beta-1,3-glucanase
Z560-1 EX567418 2E−14 100 H. vulgare low temperature-induced protein
Z608-1 EX567359 3E−22 85 T. aestivum glutathione S-transferase 2 (GST class-phi)
Z636 EX567424 6E−05 77 A. thaliana ATHSP17.4 (Arabidopsis thaliana heat shock protein 17.4)
Z675 EX567372 2E−36 74 T. aestivum O-methyltransferase 5
Z709 EX567357 1E−07 67 T. aestivum glutathione S-transferase 2 (GST class-phi)
Z16 EX567366 1E−06 70 MdBV hypothetical protein
Z111 EX567416 5E−05 61 A. thaliana expressed protein
Z114 EX567396 3E−16 78 A. thaliana putative protein
Z184 EX567430 3E−12 87 A. thaliana expressed protein
Z274-2 EX567450 8E−37 91 A. thaliana expressed protein
Z373 EX567368 7E−43 100 Plasmodium chabaudi hypothetical protein
Z639-2 EX567392 9E−43 87 A. thaliana expressed protein
Z674 EX567387 1E−07 79 H. vulgare hypothetical protein
第 7期 吴金华等: 小麦种质 N9436抗白粉病的特异基因表达谱分析 1147


进核糖体 RNA 折叠而使之处于最利于其执行翻译
功能的构象状态, 从而提高蛋白质生物合成的效率
和准确度。核糖体蛋白还参与细胞增殖、分化和凋
亡, 在生物体的生长、发育中起着关键性的作用[17]。
与信号转导相关的 Z42与Ras蛋白同源性较高。
Ras 类蛋白是细胞对胞外刺激做出应答时被激活的
信号节点, 被激活的 Ras 与多种不同催化活性的效
应因子结合, 调控胞质信号网络, 从而控制基因表
达、细胞增殖、分化和生长[18]。丝氨酸/苏氨酸蛋白
激酶(Z639-1)是与逆境信号传递关系最密切的激酶
之一, 在植物的信号传导中起着重要的作用, 能够
感知外界刺激, 并参与信号的胞内传导[19]。
此外, YKT61(Z592-2)属膜转运蛋白, 是生物体
特异性蛋白, 渗透在膜的磷脂双分子层内, 进行溶
质交换及小分子运输。β-微管蛋白(Z449-2)属于结构
蛋白, 是细胞骨架, 由β-tubulin 基因表达形成, 与
α-tubulin 一起组成微管的主要部分, 在有丝分裂纺
锤体的形成过程中起着十分重要的作用[20]。
2.2.2 BlastNr比对 所得 94个 EST在 NCBI核
酸数据库比对结果表明, 有 69个与 EST数据库中的
Unigene具有较高的同源性, 占 73%; 20个与 EST数
据库同源性较高; 5 条未找到同源序列, 未知功能
EST占 27%(表 2)。
2.2.3 BlastX比对与 BlastNr比对结果的关系
共有 33 个 EST 在两个不同数据库中具有一致的功
能(图 4)。BlastNr比对后, 又有 36个 EST与已知功
能核酸具有较高的同源性, 包括参与代谢的半胱氨
酸内切酶(Z248-2)等, 参与能量代谢的光系统 II 蛋白
(Z252-2)等 , 参与转运的液泡内膜蛋白 (Z446-2)等 ,
参与信号传导的锚蛋白(Z588-1)以及参与抗病防御
的类甜蛋白(Z300-1)、脂转移蛋白(Z239-2)等。
2.3 白粉病抗病相关基因表达谱
经文库比对, 得到白粉病抗病相关蛋白 22个(表
3), 其中与抗病信号转导相关蛋白 6个, 过敏性坏死
反应(HR)体系表达蛋白 2个, 系统获得性抗性(SAR)
体系病程相关蛋白 4个, 系统获得性抗性(SAR)体系
诱导防卫蛋白 10个。
测序所得 EST中冗余重复序列占 32.86%, 其中
谷胱甘肽硫转移酶表达丰度最高(17个), 其次为假设
蛋白(9个)、二磷酸核酮糖小亚基(6个)、二磷酸核酮
糖大亚基(5个)、核糖体蛋白(5个)、过氧化物酶(4个)、
氧甲基转移酶(3 个)、光系统 II 蛋白(3 个)、叶绿素
ToxA 结合蛋白(3 个)、β-1,3-葡聚糖酶(2 个)、叶绿
素 a/b结合蛋白(2个)、组氨酸转运子(2个)、乙酰辅
酶 A脱氢酶(2个)及其他(1个)(图 4)。白粉菌侵染后
诱导谷胱甘肽硫转移酶的大量表达, 从而有效抑制
ROS 的毒性。参与能量代谢的二磷酸核酮糖大小亚
基、光系统 II 蛋白、叶绿素 ToxA 结合蛋白和叶绿
素 a/b 结合蛋白表达丰度高, 表明小麦在与白粉菌
互作中能量代谢占主导地位。过氧化物酶的表达丰
度也相对较高, 这是小麦抵抗白粉病侵害的一种保
护性反应, 它能增强小麦对病原菌的抵抗能力, 说
明过氧化物酶与小麦抵御白粉菌密切相关。
3 讨论
3.1 植物抗白粉病反应涉及的基因
王华忠等 [21]利用瞬间技术表明了小麦丝氨酸-
苏氨酸蛋白激酶在白粉菌诱导下有低水平的增强表
达, 可能参与了抗病反应过程中的蛋白识别或信号
传导网络。曹爱忠等[10]研究表明, 白粉菌诱导后簇
毛麦中的防卫反应基因细胞色素、热激蛋白、乙醛
酸脱氢酶等, 病程相关蛋白类甜蛋白、β-1,3-葡聚糖
酶等, 活性氧清除基因谷胱甘肽硫转移酶、过氧化
物酶等, 信号传导因子丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶等表
达量增加超过 2倍。
骆蒙等 [3]在构建的白粉菌混合文库中, 出现频
率最高的是过氧化物酶, 其次是类甜蛋白。本文所
构建的 SSH-cDNA 文库中, 抗病与防御基因所占比
例最高, 系统获得性抗性相关基因大量表达, 说明
小麦经白粉菌诱导 72 h后其抗病及防御机制明显加
强, 在植物体内积累一套病程相关基因, 诱导植物
的全面防卫反应, 有效抑制病原生长、繁殖和扩散。
尤其谷胱甘肽硫转移酶表达量最高, 说明抗病植物
在受病原物侵染后体内积累大量毒素, 这些毒素的
排出主要依赖于谷胱甘肽转移酶。
文库中二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶及大小亚
基大量表达。于秀梅等[22]研究表明, 二磷酸核酮糖
羧化酶 /加氧酶在小麦经条锈菌诱导构建的文库中
也大量表达。这说明在植物-病菌互作中能量代谢占
主导地位, 以满足菌丝体在扩展中的能量需求。无
论在基因水平还是蛋白质水平, 1,5-二磷酸核酮糖羧
化酶/加氧酶大亚基在植物光合作用的 CO2 同化过

1148 作 物 学 报 第 34卷

表 2 BlastN对非冗余核酸数据库的比对结果
Table 2 Result for homological alignment with function genes in nr-nuclear database
克隆号
Clone
GenBank登录号
GenBank acc. No.
期望值
E-value
一致性
Identity (%)
来源
Source
假定基因
Putative gene
Z284-2 EX567444 1E−50 99 A. thaliana cysteine-type endopeptidase/legumain
Z528-1 EX567398 4E−39 89 M. mulatta branched chain aminotransferase
Z622-2 EX567385 9E−53 99 A. thaliana acyl-CoA dehydrogenase
Z573-2 EX567420 2E−153 100 A. thaliana acyltransferase
Z252-2 EX567449 1E−56 100 A. thaliana photosystem II protein W homolog
Z340-2 EX567362 2E−112 100 T. aestivum ribulosebisphosphate carboxylase small subunit
Z448-1 EX567375 5E−49 99 O. sativa photosystem II protein D1
Z488-1 EX567408 2E−76 99 A. thaliana chlorophyll binding protein, putative
Z488-2 EX567376 9E−64 97 T. aestivum ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit
Z549 EX567373 1E−129 100 T. aestivum chloroplast Ptr ToxA-binding protein (TaThf1)
Z550 EX567363 1E−47 100 T. aestivum ribulosebisphosphate carboxylase small subunit
Z570-2 EX567384 2E−69 99 T. aestivum chlorophyll a/b-binding protein WCAB precursor (Wcab)
Z583 EX567426 3E−151 99 T. aestivum Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit
Z589 EX567423 3E−113 99 A. thaliana LHCB3 (light-harvesting chlorophyll binding protein3)
Z601-1 EX567395 9E−79 100 A. thaliana pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit
Z609-1 EX567411 2E−75 100 A. thaliana OHP2 (one-helix protein2)
Z609-2 EX567413 3E−62 100 T. aestivum Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase activase
Z645 EX567367 4E−45 100 T. aestivum riblose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large chain
Z219-1 EX567404 1E−78 100 A. thaliana monooxygenase/ oxygen binding
Z150-2 EX567394 1E−66 98 A. thaliana structural molecule
Z449-2 EX567417 4E−46 98 T. aestivum beta-tubulin 3 (tubb3)
Z440-2 EX567437 5E−82 100 O. sativa putative I-box binding factor
Z373 EX567368 3E−178 98 A. thaliana transcription factor
Z21 EX567435 2E−21 82 M. mulatta ubiquitin-conjugating enzyme E2C
Z123 EX567406 9E−49 90 A. pisum putative ribosomal protein L32
Z361 EX567381 4E−48 96 A. thaliana ribosomal protein L11-like
Z595 EX567436 2E−127 100 T. aestivum ubiquitin/ribosomal fusion protein
Z662 EX567433 6E−81 98 A. thaliana putative CAAX prenyl protease
Z672 EX567446 0 100 T. aestivum ribosomal protein L18
Z711 EX567428 9E−126 99 T. aestivum ribosomal protein L30
Z54-1 EX567371 7E−34 91 A. thaliana nucleobase transporter
Z173 EX567445 1E−98 98 T. aestivum ATP-binding cassette(ABC transporter)
Z184 EX567430 1E−139 100 A. thaliana protein transporter
Z312-2 EX567410 2E−44 99 T. aestivum Triose phosphate translocator (tpt1)
Z446-2 EX567438 1E−46 98 T. aestivum gamma-type tonoplast intrinsic protein (gamma-TIP)
Z554-2 EX567377 1E−150 100 A. thaliana amino acid permease
Z592-2 EX567419 6E−39 94 A. thaliana YKT61
Z608-2 EX567412 1E−133 100 T. aestivum aquaporin 1:2 (pip 1:2)
Z677 EX567429 5E−72 100 T. aestivum plasma membrane protein (wpi6)
Z42 EX567415 5E−103 98 A. thaliana ARATH Ras-related protein ARA-3
Z588-1 EX567397 9E−48 95 A. thaliana ankyrin-like protein
Z637 EX567382 5E−57 92 A. thaliana thioredoxin-like protein
Z639-1 EX567393 1E−21 85 A. thaliana receptor-like protein kinase
第 7期 吴金华等: 小麦种质 N9436抗白粉病的特异基因表达谱分析 1149


(续表 2)
克隆号
Clone
GenBank登录号
GenBank acc. No.
期望值
E-value
一致性
Identity (%)
来源
Source
假定基因
Putative gene
Z54-2 EX567441 3E−73 100 A. thaliana phosphatidate phosphatase
Z602 EX567422 1E−22 95 A. thaliana calmodulin binding
Z25-1 EX567369 2E−75 98 T. aestivum pathogenisis-related protein 1.1 (PR-1.1)
Z74 EX567414 2E−111 100 M. mulatta aldehyde dehydrogenase
Z88-2 EX567386 7E−48 100 A. thaliana peroxidase
Z208 EX567370 4E−124 100 A. thaliana peroxidase
Z239-2 EX567391 3E−47 100 T. aestivum lipid transfer protein precursor (LTP1)
Z247-2 EX567361 3E−125 99 A. thaliana glutathione transferase
Z256 EX567432 2E−81 100 T. aestivum pathogenisis-related protein 1.1 (PR-1.1)
Z300-1 EX567447 7E−117 97 T. aestivum thaumatin-like protein
Z387 EX567358 4E−114 100 A. thaliana glutathione transferase
Z440-1 EX567360 5E−97 100 A. thaliana glutathione transferase
Z449-1 EX567388 2E−48 96 A. thaliana beta-1,3-glucosidase
Z608-1 EX567359 5E−108 100 A. thaliana glutathione transferase
Z636 EX567424 7E−128 96 A. thaliana ATHSP17.4 (Arabidopsis thaliana heat shock protein 17.4)
Z674 EX567387 7E−48 100 T. aestivum thiol-specific antioxidant protein (TSA-WHEAT)
Z675 EX567372 5E−142 100 A. thaliana ATOMT1 (O-Methyltransferase 1)
Z709 EX567357 2E−127 99 A. thaliana glutathione transferase
Z114 EX567396 0 99 A. thaliana putative protein
Z274-2 EX567450 1E−128 99 T. aestivum unknown protein
Z277 EX567365 1E−49 88 A. thaliana unknown protein
Z309 EX567427 7E−112 97 A. thaliana hypothetical protein M4I22.130
Z491 EX567390 9E−69 98 A. thaliana unknown protein
Z639-2 EX567392 8E−167 99 A. thaliana expressed protein
Z643 EX567379 1E−108 100 T. aestivum unknown protein
Z706 EX567434 2E−96 100 A. thaliana hypothetical protein T22P11.150



图 4 冗余基因的丰度
Fig. 4 Abundance of different genes induced by pathogen
inoculation
1: 谷胱甘肽转移酶; 2: 假设蛋白; 3: 二磷酸核酮糖小亚基;
4: 二磷酸核酮糖大亚基; 5: 核糖体蛋白; 6: 过氧化物酶; 7: O-
甲基转移酶; 8: 光系统 II蛋白; 9: 叶绿素 ToxA结合蛋白;
10: β-1,3-葡聚糖; 11: 叶绿素 a/b结合蛋白; 12: 组氨酸转运子;
13: 乙酰辅酶 A脱氢酶; 14: 其他。
1: glutathione transferase F6 (gstf6b); 2: hypothetical protein;
3: ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit:
4: ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit:
5: putative ribosomal protein: 6: peroxidase(POX2);
7: O-methyltransferase; 8: photosystem II protein;
9: chloroplast-localized Ptr ToxA-binding protein;
10: beta-1,3-glucanase; 11: chlorophyll a/b-binding protein WCAB
precursor; 12: Histidine amino acid transporters; 13: acetyl-CoA
dehydrogenase, putative; 14: other genes.
中以及细胞内各种蛋白质化学反应或氨基酸修饰过
程中都起着非常重要的作用 , 一旦开始翻译 ,
Rubisco的 2个亚基就被结构修饰酶进行各种各样的
修饰或翻译后修饰。因此, 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/
加氧酶可能涉及到氧胁迫反应。本研究通过构建小
麦抗白粉病种质的接种白粉菌 72 h后的抑制消减杂
交文库 , 发现经白粉菌诱导后 , 过氧化物酶
(peroxidase)等 HR 相关蛋白 , β-1,3-葡聚糖酶
(β-1,3-glucanase)、脂转移蛋白(lipid transfer protein
precursor, LTP)、类甜蛋白(thaumatin-like protein)、
谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase, GST)、
热激蛋白(heat shock protein, HSP)等 SAR相关蛋白
以及丝氨酸 -苏氨酸激酶 (serine/threonine protein
kinase)、钙调蛋白(calmodulin binding)以及锚蛋白
(ankyrin-like protein)等参与信号传导的蛋白均表达。
参与转运的 EST 表达表明, 小麦白粉菌侵染初
期通过调节气孔的开闭来阻止白粉菌的侵入, 或者
其在转化病原菌产生毒素方面起重要作用。本试验
1150 作 物 学 报 第 34卷

表 3 抗白粉病相关基因
Table 3 Resistance-related genes to powdery mildew
类别
Gene type
基因名称
Gene name
基因数量
Number of gene
ARATH Ras-related protein ARA-3 1
serine/threonine protein kinase 1
ankyrin-like protein 1
thioredoxin-like protein 1
phosphatidate phosphatase 1
抗病信号传导
Signal transduction
calmodulin binding 1

peroxidase 1 HR体系表达相关蛋白
HR-related protein aldehyde dehydrogenase homolog 1

pathogenisis-related protein 1.1 (PR-1.1) 1
beta-1,3-glucanase 1
thaumatin-like protein 1
SAR体系病程相关蛋白
Pathogenisis-related protein of SAR
lipid transfer protein precursor (LTP1) 1

putative cytochrome P450(1) 1
glutathione S-transferase 2 (GST class-phi) 5
low temperature-induced protein 1
ATHSP17.4 (Arabidopsis thaliana heat shock protein 17.4) 1
O-methyltransferase 1
SAR体系诱导防卫蛋白
Defense protein of SAR
ARATH Dehydration-responsive protein 1

得到的热激蛋白属低分子量热激蛋白(HSP17.4), 推
测其可能具有热保护作用, 在体外具有分子伴侣功
能, 能够延缓植物细胞的衰老, 在植物体内的具体
功能有待进一步验证。实验中的锚蛋白不仅作为调
节因子参与植物防卫反应, 还参与物质的识别与运
输以及参与生物体的发育调控[23]。这在以往的白粉
病抗病机制研究中没有报道。25条 EST没有找到与
其同源的 EST, 推测这 25条 EST可能代表了新的基
因或变异度较高的 cDNA 的非编码区序列, 但尚待
进一步研究确证。
3.2 抗病机制与抗病性改良
在病菌与寄主互作中, 植物主要是通过防卫基
因的表达、过敏反应和系统获得性抗性等来抵抗病
菌的入侵 , 如与植保素合成有关的查尔酮合酶
(CHS)、脂氧合酶 (LOX), 水解酶基因几丁质酶和
β-1,3-葡聚糖酶等, 木质素合成有关的酶基因, 还原
性氧清除酶如谷胱甘肽硫转移酶以及病程相关蛋白
等都与植物抗病性的表达密切相关。马金彪等[24]构
建的小麦条锈菌 cDNA 文库中有谷胱甘肽硫转移酶
和热激蛋白的表达。谷胱甘肽硫转移酶(glutathione
S-transferase, GST)在细胞质中能清除植物抗病过程
中积累的还原性氧类(ROS), 减少 ROS 的毒性和破
坏性作用, 参与毒素的分解代谢。Enayati 等[25]证明
GST 与昆虫抗药性有关, 可作为杀虫剂的三大解毒
代谢酶系之一。β-1,3-葡聚糖酶催化β-1,3-和β-1,6-
葡聚糖的水解, 降解细胞壁后释放的低聚糖又能诱
导植物产生其他多种病程相关蛋白。β-1,3-葡聚糖酶
参与细胞分裂、种子萌发、芽休眠、花的形成和果
实成熟等生理分化和发育过程, 并参与植物抵抗病
原真菌侵害, 其生物合成受细胞分裂素、水杨酸、
乙烯、病原物等诱导。高玉龙等[14]在海岛棉中克隆
了一条参与黄萎病抗性的β-1,3-葡聚糖酶基因全长
cDNA。刘博等[26]对条锈菌诱导的小麦β-1,3-葡聚糖
酶基因编码区进行了克隆研究。脂转移蛋白(lipid
transfer protein, LTP)不仅在转运脂类、形成角质等
方面起作用, 而且在植物防御反应中起重要作用, 因
此于 1998年被命名为“病程相关蛋白 14”[27]。张永红
等[28]构建的小麦条锈菌 cDNA文库中还发现了丝氨
酸-苏氨酸激酶。
非生物胁迫抗性的分子机制研究中也发现, 植
物在抵御生物胁迫和非生物胁迫的反应中, 存在一
些共同的机制, 如植物 GST 不仅受条锈、白粉等病
原菌的诱导, 还受外界多种胁迫因子诱导, 如氧化
胁迫、干旱胁迫、盐胁迫、热激胁迫、2,4-D、乙烯、
第 7期 吴金华等: 小麦种质 N9436抗白粉病的特异基因表达谱分析 1151


除草安全剂和重金属等[13]。王玉成等[29]在研究干旱
胁迫下柽柳(Tamarix androssowii)基因表达时得到谷
胱甘肽硫转移酶、细胞色素蛋白、脂转移蛋白、脱
水诱导蛋白等。刘晓菲等[30]发现大麦和玉米的 LTP
具有抑制多种病原菌生长的作用, 大麦和番茄 LTP
基因还受环境胁迫因子如低温、干旱和高温诱导。
植物抗白粉病不是单一的过程, 而是一个复杂
系统的过程, 涉及到生理、生化途径的多个方面, 体
现了生命活动在整体上的协调性。因此, 抗病过程
不仅仅是抗病过程的识别和抗病基因的开启, 更重
要的是抗病过程中抗病相关基因的表达以及抗病信
号的传递。植物在非生物胁迫或抗病反应中存在的
共同机制, 为发掘和利用植物广谱抗性基因奠定了
基础。
4 结论
构建了白粉菌接种初期小麦抗性种质 N9436的
SSH-cDNA文库, 得到 22个与白粉病抗病相关 EST,
其中 6个与抗病信号传导相关, 2个与过敏性坏死反
应(HR)体系表达相关, 4 个与系统获得性抗性(SAR)
体系病程相关, 10个与 SAR体系诱导防卫相关(包括
小分子量热激蛋白和锚蛋白)。
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