全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(1): 186189 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由江苏省农业科技自主创新基金项目 [CX(10)128], 现代农业产业技术体系项目 (nycytx-03), 国家科技部国际合作项目
(2009DFA32020)和国家转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08002-001)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 马鸿翔, E-mail: mahx@jaas.ac.cn
第一作者联系方式: E-mail: yangdan1290@163.com
Received(收稿日期): 2011-05-27; Accepted(接受日期): 2011-09-18; Published online(网络出版日期): 2011-09-30.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110930.1725.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00186
高效液相色谱-紫外法同时检测小麦中 DON、15ACDON和 3ACDON
杨 丹 耿志明 马鸿翔* 姚金保 张 旭 张平平 张 鹏
江苏省农业科学院 / 江苏省农业生物学重点实验室, 江苏南京 210014
摘 要: 建立了测定小麦中 B型单端孢酶烯族毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)、3-乙酰脱氧雪腐镰刀
菌烯醇(3-acetyldeoxynivalenol, 3-ACDON)和 15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyldeoxynivalenol, 15-ACDON)的高
效液相色谱-紫外(HPLC-UV)检测方法。用水提取小麦样品, 提取液经无水乙醇等体积沉淀, 再结合 Oasis HLB 固相
萃取小柱可取得较好的净化效果。采用乙腈-0.005%磷酸水溶液二元梯度洗脱程序在高效液相色谱-紫外检测器上完
成 DON、15ACDON和 3ACDON的定性定量分析。结果表明, 在 0.5~15.0 mg L1线性范围内, DON、15ACDON和
3ACDON的平均加标回收率分别为 89.8%、93.4%和 92.9%, 相对标准偏差分别为 2.2%、2.0%和 2.5% (n=3); 检测限
分别为 12.2、10.5和 16.7 μg kg1。该方法准确、重现性好, 样品净化方法使杂峰干扰少, 大幅减少有机溶剂的使用,
成本低, 适用于小麦中 B型单端孢酶烯族毒素的大批量检测。
关键词: 小麦; B型单端孢酶烯族毒素; 高效液相色谱-紫外检测法
Establishment of a HPLC-UV Method for Simultaneous Determination of DON,
15ACDON, and 3ACDON in Wheat
YANG Dan, GENG Zhi-Ming, MA Hong-Xiang*, YAO Jin-Bao, ZHANG Xu, ZHANG Ping-Ping, and
ZHANG Peng
Provincial Key Laboratory of Agrobiology / Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China
Abstract: A HPLC-UV method was established to determine deoxynivalenol (DON), 3-acetyldeoxynivalenol (3-ACDON) and 15-
acetyldeoxynivalenol (15-ACDON) in wheat. Wheat sample was extracted by water, and the extracting solution was precipitated with
an equal volume of ethanol followed by solid phase extraction with Oasis HLB cartridge. Qualitative and quantitative analyses of
DON, 15ACDON and 3ACDON were done by HPLC-UVD using gradient elution program with acetonitrile and 0.005% phosphoric
acid solution. Results showed that at the linear range of 0.5–15.0 mg L1, the recoveries were 89.8%, 93.4%, and 92.9%, respectively.
The relative standard deviations were 2.2%, 2.0%, and 2.5%, respectively, and the detection limit levels were 12.2, 10.5, and 16.7 μg
kg1, respectively. The method was accurate and reproducible. Sample purification lessened interference peaks, and due to the use of
organic solvents was greatly reduced, the cost was decreased. Therefore, the method was suitable for the large batch determination of
type B trichothecenes in wheat.
Keywords: Wheat; B trichothecenes; HPLC-UV
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)及其衍
生物属于单端孢霉烯族 B 类, 基本结构为四环的倍半萜,
以 C8 位上的羰基为特征[1]。王裕中和 Miller[2]依据 DON
乙酰化的位置不同, 将 DON的化学型又分为 3-乙酰脱氧
雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyldeoxynivalenol, 3-ACDON)和 15-
乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (15-acetyldeoxyni-valenol, 15-
ACDON)。其中, DON对谷物污染率和污染水平居于镰刀
菌毒素之首, 给人、家畜的健康造成巨大威胁[3]。2010年,
根据 FAO 和 WHO 食品安全评估委员会的最新毒性数据
结果, 由于在有机体内乙酰化代谢产物转变成 DON 而增
大了其诱导毒性, 联合食品添加剂专家委员会(JECFA)规
定, DON及其乙酰化衍生物的一组暂定最大每日耐受摄
入量(PTMDI)为 1 μg kg1 BW [4]。单端孢霉烯族类化合
物较为耐热 , 在酸和碱中也较稳定 , 通常的烹调加工难
第 1期 杨 丹等: 高效液相色谱-紫外法同时检测小麦中 DON、15ACDON和 3ACDON 187


以破坏其活性[5]。易受污染的食品主要包括玉米、小麦、
黑麦、燕麦等谷物。因此, 检测单端孢霉烯族毒素在粮
食中的存在情况 , 对保证人类食品安全是非常必要的。
镰刀菌毒素的检测方法较多, 可分为 3 类: ①生物检测
法, 包括皮肤毒性试验、种子发芽试验等[6]; ②理化检测
法, 包括薄层层析[7]、高效液相色谱[8]、气相色谱[9-10]、
气 (液 )质联用等 [11-12]; ③免疫化学检测法 , 包括放射性
免疫法 [13]、荧光极性免疫分析法 [14]和酶联免疫吸附
(ELISA)法 [15-16]。
国内有关 DON 的检测方法报道较多, 而 DON 的乙
酰化衍生物同样具有细胞毒性和致突变、致畸、致癌等危
害[19-21], 用 HPLC-UV 检测 15ACDON 和 3ACDON 的方
法尚未见报道。使用 HPLC-UV 检测样品中的 DON 及乙
酰化衍生物时 , 净化效果是关键 , 对于自然污染的粮食
样品, 经多功能柱和免疫亲和柱净化后出现毒素和粮食
基体物质共提取、谱图分离度差等问题[17], 并且这 2种净
化柱价格较贵。本研究旨在建立一种新的样品净化方法及
色谱检测条件 , 使样品前处理简单 , 极大地减少有机溶
剂的使用, 成本低, 同分异构体 15ACDON 和 3ACDON
达到有效的基线分离 , 适合大批量检测小麦样品中的
DON、15ACDON和 3ACDON。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
U-3000高效液相色谱仪(美国Dionex), VWD-3000可
变波长紫外检测器 ; 3K30 高速台式冷冻离心机 (德国
Sigma); 乙腈为色谱纯(美国 ROE Scientific Inc.), 水为去
离子水, 其余试剂均为分析纯; 标准品纯度分别为 DON
≥99.4、3-ACDON≥98%、15-ACDON≥98.8% (Sigma-
Aldrich); Oasis HLB固相萃取小柱(Waters, 3 mL 60 mg1);
供试小麦样品有 2010年收获的宁麦 11、宁麦 9号及有恒
面粉(购于超市)。
1.2 试验方法
标准溶液配制: DON、15ACDON 和 3ACDON 储备
液的浓度均为 100 mg L1, 溶剂为乙腈。用水把 DON、
15ACDON和 3ACDON储备液配制成 0.5、2.0、5.0、10.0、
15.0和 20.0 mg L1的混合标准溶液。
样品制备: 称取粉碎后的小麦样品 5.00 g 于 50 mL
的离心管中, 加入 25 mL的H2O振荡提取 15 min, 3 500×g
离心 10 min, 取 10 mL上清液加入等体积的无水乙醇 4℃
沉淀 1 h, 在 10 000×g离心 20 min, 取上清液旋转蒸发至
干, 用 1.0 mL H2O 分 2 次振荡溶解, 合并样液过 Oasis
HLB固相萃取小柱。分别用 3.0 mL甲醇和纯水活化小柱;
上样量 2.0 mL, 自然流速, 用 2.0 mL纯水洗涤, 然后在真
空下抽气干燥 30 min; 用 2.0 mL乙酸乙酯分 2次洗脱小
柱, 收集洗脱液, 旋转蒸发至干后, 加 0.5 mL H2O 溶解,
过 0.22 μm微孔滤膜, 上机。
色谱条件: 色谱柱为 Xtimate C18 (4.6 mm×250 mm
i.d., 5 μm); 乙腈为流动相 A, 0.005%磷酸水溶液为流动相
B, 按一定比例梯度洗脱; 检测波长 224 nm; 流速 0.7 mL
min1; 柱温 35℃; 进样量 10 μL。
方法学考察: 将混合标准溶液以峰面积平均值和质
量浓度进行回归处理 , 分析线性关系; 分别在一日内不
同时间制备样品 5次, 计算日内精密度, 再连续测定 5 d,
计算日间精密度 ; 取空白样品 , 按 S/N=3 确定检测限
(LOD), S/N=10确定定量限(LOQ); 取 5.00 g空白样品, 分
别加入适量的DON, 15ACDON和 3ACDON储备液, 分析
加标回收率。
1.3 样品测定
取小麦样品宁麦 11、宁麦 9 号及有恒面粉按照方法
1.2 进行样品制备, 根据回归方程计算 DON, 15ACDON
和 3ACDON的质量分数。
2 结果与分析
2.1 测定方法评价
在选定的色谱条件下, DON、15ACDON和 3ACDON
在 0.5~15.0 mg L1 范围内的线性回归方程分别为 y =
0.2904x–0.0182 (R2=0.9989)、y=0.2631x–0.0150 (R2=0.9975)、
y=0.2732x–0.0189 (R2=0.9976); 精密度试验测得 DON、
15ACDON 和 3ACDON 的日内相对标准偏差分别为
2.97%、2.65%和 2.18%, 日间相对标准偏差分别为 3.43%、
3.82%和 3.11%; 以 3 倍信噪比(S/N＝3)可得出检测限分
别为 12.2、10.5和 16.7 μg kg1, 以 10倍信噪比可得出定
量限分别为 40.7、35.0和 55.7 μg kg1; 平均加标回收率
分别为 89.8%、93.4%和 92.9%, 相对标准偏差分别为
2.2%、2.0%和 2.5% (表 1)。

图 1 小麦空白样品及加标样品的HPLC-UV图谱(标样 0.5 mg L1)
Fig. 1 HPLC-UV chromatograms of wheat blank samples and
spiked samples (standard 0.5 mg L1)

2.2 样品测定
经检测 3 个样品中均含有 DON, 未检测到 15ACDON
和 3ACDON (表 2)。图 1 中标样 DON、15ACDON 和
3ACDON的出峰时间分别为 13.94、20.05和 20.46 min。
15ACDON 和 3ACDON 达到基线分离, 分离度为 2.0, 符
合分离度>1.5的要求。
188 作 物 学 报 第 38卷


表 1 回收率试验结果
Table 1 Results of the recovery (n=3)
分析物
Analyte
加入量
Additive (μg kg1)
测得量
Measured (μg kg1)
回收率
Recovery (%)
平均回收率
Mean recovery (%)
相对标准偏差
RSD (%)
DON 2500 2185 87.40
2500 2242 89.68
2500 2296 91.84
89.8 2.2
15ACDON 2500 2258 90.32
2500 2193 87.72
2500 2297 91.88
93.4 2.0
3ACDON 2000 1883 94.15
2000 1867 93.35
2000 1906 95.30
92.9 2.5

表 2 样品测定结果
Table 2 Determination result of samples (μg kg1)
样品
Sample
DON 15ACDON 3ACDON
宁麦 11 Ningmai 11 725 － －
宁麦 9号 Ningmai 9 450 － －
有恒面粉 Youheng flour 563 － －
－ 表示测定值低于定量下限。
－ denotes the detected concentration is below LOQ.

3 讨论
3.1 样品净化方法的选择
在自然污染的小麦样品中除了毒素外, 尚含有蛋白
质、脂肪、色素等干扰物质, 它们随着样品进入提取液,
干扰了 DON 及乙酰化衍生物的测定。如 Klötzel 等[17]曾
报道应用 2 种免疫亲和柱和基于活性炭和氧化铝柱子作
为填料的 MycoSep 多功能柱对自然污染小麦样品的净化
检测, 结果表明, 用紫外检测器检测, 杂质峰较多, 受基
质干扰严重。毒素存在和粮食基体物质共提取的非特异性
相互作用 , 共提取的峰和毒素信号重叠、覆盖 , 而且
HPLC色谱柱要每个序列结束后冲洗, 保护柱也须经常替
换。因此, 我们根据 DON、15ACDON 和 3ACDON 易溶
于水和甲醇、乙醇、乙腈、丙酮及乙酸乙酯等极性溶剂的
性质, 选用水为提取溶剂, 向提取液中加入无水乙醇, 在
低温下可使绝大部分蛋白质、酶、核酸、糖、氨基酸等溶
解度降低并析出, 通过离心可很好地去除沉淀。并且, 当
无水乙醇︰提取液(V/V)=1︰1时, 沉淀效果最好, 杂质干
扰少。
在通过 Oasis固相萃取小柱时, DON、15ACDON和
3ACDON可以完全保留在小柱上, 可用 2 mL水洗涤小柱,
去除水溶性杂质的干扰, 而分析物不会被洗脱下来。比较
了 3种洗脱剂甲醇、乙腈和乙酸乙酯的净化效果, 用甲醇
和乙腈洗脱下来的杂质较多, 在 20~21 min 的位置干扰
15ACDON 和 3ACDON 的测定, 并且基线波动较大。用
乙酸乙酯洗脱, 图谱很干净(图 2), 无须经常更换保护柱,
可消除 20~21 min的杂峰干扰, 基线比较平稳。分析物的
回收率在 89.8%~93.4%之间。添加回收率试验证明本文方
法选择性高。本研究采用乙醇沉淀结合 Oasis固相萃取小
柱净化样品, 获得了很好的效果, 成本低, 极大地减少了
有机溶剂的使用, 适合大批量检测样品。

图 2 3种有机溶剂洗脱固相萃取小柱的 HPLC-UV图谱
Fig. 2 HPLC-UV Chromatograms of three kinds of organic
solvents eluting solid phase extraction column

3.2 HPLC分离条件的选择
因为 15ACDON和 3ACDON为同分异构体, 使用紫
外检测器并且在非衍生的条件下 , 很难达到基线分离 ,
比如 Jiménez 等[18]报道, 使用甲醇-水(35∶65)为流动相,
15ADON和 3ADON以一个峰出现。我们比较了最常用的
流动相系统乙腈-水和甲醇-水体系 , 结果表明 , 以乙腈-
水体系为流动相时 , 改善了分离效果 , 但效果依然不理
想, 且色谱峰有拖尾现象。而以甲醇-水为流动相时, 色谱
峰很难分离。由于毒素的分子结构中带有多个羟基, 流动
相的 pH对化合物的峰形、分离度和保留时间会产生影响。
因此尝试采用乙腈 -(0.001%~0.01%)磷酸水溶液和乙腈-
(0.01%~0.1%)三氟乙酸水溶液来改善峰形, 消除拖尾。经
过反复试验发现 , 乙腈 -0.005%磷酸水溶液梯度洗脱时 ,
分离度好、峰形尖锐。对柱温(20~70 )℃ 的比较分析中发
现 , 柱温只对毒素的保留时间有影响 , 对分离度没有影
响, 选择 35℃保留时间较为适宜。
第 1期 杨 丹等: 高效液相色谱-紫外法同时检测小麦中 DON、15ACDON和 3ACDON 189


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