全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(9): 1620−1627 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家高技术研究发展计划(863 计划)重大专项(2009AA101102), 陕西省 13115 科技创新工程重大科技专项(2007ZDKG-02), 国家杨凌
农业生物技术育种中心专项(99-1A), 西北农林科技大学拔尖人才支持计划项目资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 张改生, E-mail: zhanggsh@public.xa.sn.cn
Received(收稿日期): 2009-02-24; Accepted(接受日期): 2009-04-08.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01620
黏类小麦细胞质雄性不育相关基因 cMDH 的克隆与表达分析
张龙雨 李红霞 张改生* 王俊生 韩艳芬 袁正杰 牛 娜 马守才
西北农林科技大学 / 陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室 / 教育部小麦育种工程研究中心, 陕西杨凌 712100
摘 要: 为深入研究黏类小麦雄性不育的分子遗传机制, 利用抑制差减杂交技术构建了黏类小麦育性相关基因的二
核期 SSH文库。经文库筛选后, 得到一个在可育文库中表达的与胞质苹果酸脱氢酶基因同源的 EST序列。以该 EST
序列为信息探针, 经电子克隆、RT-PCR、PCR 克隆与序列分析, 获得了小麦胞质苹果酸脱氢酶(cytosolic malate de-
hydrogenases, cMDH)基因的 cDNA与 DNA序列, 利用荧光定量 PCR技术对该基因在不育株和可育株花药中的表达
进行了分析, 并比较了 MDH在小麦不育株和可育株中的活性变化。结果表明, 该基因的 cDNA序列长 1 213 bp, 编
码 333个氨基酸; DNA序列长 2 908 bp, 含有 7个外显子和 6个内含子; 该基因在不育株和可育株花药发育 3个时期
(单核、二核和三核)的表达均表现为先升后降的模式, 而且该基因在不育株花药发育的二核期和三核期的表达相对于
可育株被明显抑制; MDH在小麦不育株和可育株中的活性变化趋势与定量结果一致。推测该基因在花粉发育早期表
达, 它的下调表达可能影响了小麦雄蕊发育过程中的能量供应而导致雄性不育。
关键词: 小麦; 胞质苹果酸脱氢酶基因; 克隆; 荧光定量 PCR
Cloning and Expression Analysis of cMDH Gene Related to Cytoplasmic Male
Sterile Wheat with Aegilops kotschyi Cytoplasm
ZHANG Long-Yu, LI Hong-Xia, ZHANG Gai-Sheng*, WANG Jun-Sheng, HAN Yan-Fen, YUAN Zheng-Jie,
NIU Na, and MA Shou-Cai
Key Laboratory of Crop Heterosis of Shaanxi Province, Northwest A&F University / Wheat Breeding Engineering Research Center, Ministry of Edu-
cation, Yangling 712100, China
Abstract: Male sterility with Aegilops kotschyi cytoplasm has a great application potential in hybrid wheat (Triticum aestivum L.)
breeding for its stable sterility and broad-spectrum of restoring gene resources. To further reveal the genetic mechanism of male
sterile with Ae. kotschyi cytoplasm, we employed a male sterile line ms (Kots)-90-110(A) and its near isogenic line BC4F1 (ferti-
lity restored by rk5451) to construct sterile and fertile cDNA libraries by suppression subtractive hybridization (SSH) in binucle-
ate stage of anther development. Comparative analysis of differentially expressed EST sequences revealed that one EST highly
similar to cytosolic malate dehydrogenases gene was identified from the fertile SSH-cDNA library. Then, the EST sequence was
used as a querying probe to blast the Genbank databases. Based on the assembled homologous cDNA sequence, both cDNA and
DNA sequences encoding a cytosolic malate dehydrogenases were isolated and characterized by PCR and sequence analysis. Fur-
thermore, expression characteristics of the gene between male sterile and fertile anthers were analyzed via real-time PCR. In this
study, the cDNA sequence was 1 213 bp in length and the open reading frame encoded a peptide of 333 amino acids. The DNA
sequence was 2 908 bp in length, which contained seven extrons and six introns. According to expression analysis, the expression
of this gene in fertile anthers was much higher than that in sterile anthers at binucleate and trinucleate stage during anther devel-
opment. The trend of MDH activity was consistent with the quantitative results between fertility and sterility. Therefore, the gene
is conjectured to be an early expression gene and its down-regulated expression may affect energy supply during stamen growth in
sterile line anthers resulting in male sterility in wheat.
Keywords: Wheat; Cytosolic malate dehydrogenases gene; Cloning; Real-time PCR
第 9期 张龙雨等: 黏类小麦细胞质雄性不育相关基因 cMDH的克隆与表达分析 1621
苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenases, MDH)广
泛分布于生物体内 , 是生物糖代谢中的关键酶之
一。在植物细胞中存在着多种 MDH同工酶, 根据其
辅酶专一性, 亚细胞定位和生理功能, 这些同工酶
可分为线粒体 NAD-MDH (mMDH)、微体 NAD-
MDH、叶绿体 NADP-MDH、叶绿体 NAD-MDH 和
细胞质 NAD-MDH (cMDH)[1]。其中, 胞质苹果酸脱
氢酶(cytosolic malate dehydrogenases, cMDH) 存在
于细胞胞质内, 可催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰
乙酸是生物体内生化反应的一个非常重要的中间产
物, 连接多条重要的代谢途径, 是氨基酸形成所必
需的碳骨架的主要来源之一[2]。此外, 细胞质苹果酸
脱氢酶与线粒体的能量代谢密切相关, 参与三羧酸
循环的主要底物草酰乙酸不能由细胞质基质直接进
入线粒体, 必须首先在细胞质中经胞质苹果酸脱氢
酶催化还原为苹果酸 , 后者可以直接进入线粒体 ,
在线粒体苹果酸脱氢酶的作用下催化进入线粒体基
质的苹果酸再生成草酰乙酸从而进入三羧酸循环[3]。
因此, 细胞质苹果酸脱氢酶在植物的中枢代谢途径
(糖酵解及三羧酸循环)、线粒体能量代谢底物供应中
均占有重要地位, 对胞质苹果酸脱氢酶基因的研究
具有十分重要的意义。在禾谷类作物中, 胡建广等[4]
从玉米杂种幼苗 cDNA 文库中筛选到编码胞质苹果
酸脱氢酶基因全长序列的 cDNA 克隆, 并完成了该
基因编码区的全序列分析; 姜瑞华等 [5]以玉米苹果
酸脱氢酶的基因为探针, 从水稻幼苗 cDNA 文库筛
选得到一条水稻苹果酸脱氢酶基因; 蔺占兵等 [6]报
道从小麦中克隆了一类依赖于 NAD的细胞质苹果酸
脱氢酶 cDNA 的部分序列。有关黏类小麦胞质苹果
酸脱氢酶基因的研究, 除本课题外还未见相关报道。
黏类小麦是指小麦黏型(K 型)和偏型(Ven 型)等
一类既易保持又易恢复, 且种子饱满、保持系与恢
复系来源都分布在普通小麦推广品种(系)内的小麦
雄性不育系的总称。黏类小麦细胞质雄性不育(CMS)
系是小麦杂种优势利用中很有应用潜力的不育类
型[7]。为了揭示黏类小麦细胞质雄性不育的分子机
理, 李红霞等[8]以该类型不育系 ms(Kots)-90-110(A)
和其近等基因系 BC4F1 为材料, 利用抑制消减杂交
技术分别构建了不育和可育条件下基因特异表达的
SSH-cDNA 文库, 比较分析了两文库 EST 序列, 探
讨了不育和可育条件下基因表达的种类、功能及其
参与的生化代谢途径的异同, 从 SSH-cDNA 可育文
库中发现一个与胞质苹果酸脱氢酶高度同源的基
因。本研究以该基因的 EST 序列为模板, 应用电子
克隆技术拼接了该基因的序列, 据此设计引物, 采
用 RT-PCR 技术扩增该基因, 对扩增到的基因片段
进行克隆和序列分析, 采用实时荧光定量 PCR 技术
对该基因在小麦不育系及其近等基因系不同发育时
期花药中的表达模式进行分析, 并比较了 MDH 在
小麦不育株和可育株中的活性变化, 以进一步探讨
该基因的表达与小麦雄性不育的关系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2007年获得黏类小麦细胞质雄性不育系及其近
等基因系[8]。以细胞质雄性不育系 ms(Kots)-90-110
及其恢复系 rk5451(均由本实验室保存)为试材, 先
以 ms(Kots)-90-110为母本, 与 rk5451杂交, 将恢复
系的核内恢复基因导入不育系 , 使育性得以恢复 ;
然后在后代中筛选其他农艺性状与不育系ms(Kots)-
90-110 相同, 但为可育的植株作父本, 与不育系连
续回交 5代, 获得 BC5F1; 最后对该 BC5F1群体的花
药进行观察, 发现花药饱满, 药室增大, 花粉发育、
减数分裂均表现正常, 能够形成正常花粉粒。因此,
用于本研究的不育系 ms(Kots)-90-110与其近等基因
系 BC5F1 除育性有差别外, 其他质核遗传背景相当
一致。
试材按正常秋播在西北农林科技大学农场试验
田种植, 2008年 4月中旬借助光学显微镜镜检, 分别
取不育系 ms(Kots)-90-110(A)和其近等基因系 BC5F1
处于不同发育时期的花药(单核、二核和三核), 在低
温下剥取后迅速在液氮中冷冻, 以尽量减少分离后
基因表达的变化。每天相同时间内采集不同时期的
花药样本, 以避免时间差异对基因表达的影响, 所
有试验材料于−80℃冰箱中保存备用。
1.2 小麦花药总 RNA提取与 cDNA合成
用 BIOZOI试剂(杭州博日科技有限公司), 按说
明书方法提取不同发育时期花药的总 RNA, 并用
DNase I (TaKaRa公司, 大连)进行纯化处理。用甲醛
变性琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白检测仪检测总RNA
质量。总 RNA纯化后进行 cDNA的合成, cDNA第
一链合成采用 M-MLV (TaKaRa 公司, 大连)反转录
酶, 引物为来自Clontech公司的CDSIII和SMART, 引
物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 小麦 cMDH基因的电子克隆及引物设计
从本实验室构建的黏类小麦育性相关基因 cDNA
1622 作 物 学 报 第 35卷
可育文库中筛选到与 cMDH 高度同源的 EST 序列,
以此 EST序列为模板进行Blast检索, 得到多条与之
高度同源的 EST 序列 , 将获得的 EST 序列利用
CAP3 (Sequence Assembly Programe)进行首尾拼接,
获得新的重叠群 contig, 将 contig 反复对 GenBank
的 EST公共数据库进行 Blast检索、拼接, 直至没有
新的匹配序列入选, 从而生成最后的新生序列, 作
为 EST 的延伸产物。根据 contig 序列, 利用 Primer
Premier 5.0软件设计引物 cMDH-F: 5′-CCTCCTCCT
AAACCACTCTC-3′, cMDH-R: 5′-GCTACAAGCCT
CATTCATACAC-3′。
1.4 小麦 cMDH基因 cDNA及基因组序列的分离
以黏类小麦细胞质雄性不育系的近等基因系
BC5F1双核期花药的 cDNA 及基因组 DNA 为模板,
以 cMDH-F和 cMDH-R为引物进行扩增。采用 50 µL
反应体系, 含 cDNA 3 μL (DNA 1 μL)模板, 10×PCR
buffer (含 Mg2+) 5 μL, 2.5 mmol L−1 dNTP Mixture 4
μL, 5 U μL−1 Taq酶(TaKaRa) 0.5 μL, 10 μmol L−1
cMDH-F 2 μL, 10 μmol L−1 cMDH-R 2 μL, ddH2O补
足至 50 μL。PCR程序为 94℃预变性 3 min; 94℃变
性 1 min, 59℃退火 1 min, 72℃延伸 1 min, 35个循环;
72℃延伸 10 min; 反应后 4℃保存。2%琼脂糖凝胶
电泳检测扩增产物。将扩增得到的目的片段回收纯
化, 与 PMD19-Vector (TaKaRa 公司, 大连)载体连
接。连接产物转化 DH5α 感受态细胞 , 涂于含有
Amp/X2gal/IPTG的 LB培养基上进行蓝白斑筛选。
挑取白色菌落, 通过菌落 PCR, 质粒提取, Eco RI和
Hin dIII (TaKaRa公司, 大连)双酶切等多重鉴定, 将
阳性克隆送北京三博远志生物有限责任公司测序。
1.5 小麦 cMDH基因的序列分析
采用 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/
cdd/wrpsb.cgi)在线进行序列保守功能区的分析; 采
用 ExPASy网站的 Compute PI/Mw tool (http://www.
expasy.org/tools/pi_tool.html)计算蛋白质的等电点和
分子量; 多序列比对以及进化树构建采用 Clustalw
和 MEGA2.0软件在默认参数下进行; 利用 NCBI的
在线分析软件 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/
spideyweb.cgi)对序列进行外显子和内含子结构的
分析。
1.6 利用荧光定量 PCR技术分析 cMDH基因在
不同发育时期花药中的表达
根据 RT-PCR扩增得到的 cMDH的 cDNA序列
在其保守序列区域设计一对特异引物, 上游引物序
列为 cMDH-F1: 5′-TGTGCCTGCTGGTCTTATCTA
CTC-3′, 下游引物序列为 cMDH-R1: 5′-GGTCGCA
TCCATCTTCTTCC-3′, 预期产物长度 112 bp。内参
根据小麦 18S rRNA (GenBank登录号为 AY049040)
基因的序列, 在其保守序列区域设计了一对特异性
引物, 上游引物序列为 18S-F: 5′-CGTCCCTGCCCT
TTGTACAC-3′, 下游引物序列为 18S-R: 5′-AACAC
TTCACCGGACCATTCA-3′, 预期产物长度 80 bp。
两对引物在大连 TaKaRa 公司合成。为提高荧光定
量 PCR的可靠性和准确性, 以目的基因 cMDH和内
参基因 18S rRNA 的荧光定量引物, 不加入荧光染
料进行普通 RT-PCR扩增, 并用 2%琼脂糖凝胶电泳
检测引物的特异性 , 然后再进行实时荧光定量
PCR。
为了构建 cMDH基因和 18S rRNA基因 Ct值的
标准曲线, 以可育双核期花药的 cDNA 为模板, 按
照 1~55倍稀释, 每个样品设置 3 次重复, 进行实时
荧光定量 PCR反应。根据模板起始拷贝数的对数和
临界循环数(threshold cycle, Ct)值制作标准曲线, 并
得到标准方程。
实时荧光定量 PCR按照 SYBR Premix Ex Taq
试剂盒(TaKaRa 公司, 大连)说明书进行操作, 同时
设置无模板对照, 每个反应设定 3 次重复。采用两
步法 PCR, 95℃预变性 10 s, 95℃变性 5 s, 60℃退火
31 s, 40个循环。设定在每个循环中 60℃ 31 s时读
取荧光值, 最后添加荧光 PCR 产物进行熔解曲线分
析。反应在 ABI Prism 7300定量 PCR仪上进行。
1.7 荧光定量 PCR结果分析方法
采用双标准曲线法引入斜率, 根据张驰宇等 [9]
的公式进行计算。F=10ΔCT,T/AT−ΔCT,R/AR, 式中, F代表
目的基因的相对表达量, ΔCT,T代表实验组减去对照
组目的基因 CT值的差, ΔCT,R代表实验组减去对照组
参照基因 CT 值的差。AT 代表目的基因扩增的标准
曲线的斜率, AR 代表内参照基因扩增的标准曲线的
斜率。利用 PEMS3.1 统计分析软件, 对实验数据进
行差异显著性检验。
1.8 酶液制备及小麦 MDH活性测定
以不育系 ms(Kots)-90-110 和其近等基因系
BC5F1 为试验材料, 通过镜检取处于减数分裂期的
幼穗、单核期、二核期及三核期的花药, 参照并适
当改进欧阳光察[10]和朱广廉等[11]的方法测定 MDH
活性。取 0.5 g新鲜材料, 放入预冷研钵中, 再加入
第 9期 张龙雨等: 黏类小麦细胞质雄性不育相关基因 cMDH的克隆与表达分析 1623
预冷的酶提取液(50 mmol L−1 Tris-HCl pH 7.5内含
1% PVP), 冰浴研磨后, 于 4℃下 15 000×g 离心 15
min 提取粗酶液。活性测定反应混合液为 50 mmol
L−1 Tris-HCl (pH 8.0)含 0.167 mmol L−1 NADH, 用 10
mmol L−1草酰乙酸启动反应, 25℃在 340 nm下测定
吸光值的变化。以下降 1.0 OD min−1为一个酶活性
单位, 每个指标重复测定 4次, 取平均值。
2 结果与分析
2.1 小麦 cMDH基因的 cDNA序列分析
以可育株双核期花药的总 RNA反转录的 cDNA
为模板, 进行 PCR扩增, 得到 1 213 bp的 cDNA片
段。测序结果显示, 该序列完整的开放阅读框从 57
bp开始到 1 058 bp终止, 编码 333个氨基酸, 分子
量为 35.48 kD, 等电点为 5.75(图 1)。分析发现, 该
序列具有典型的苹果酸脱氢酶功能区保守序列, 包
括一个 NAD结合位点 (NAD binding site), 一个苹
果酸结合位点(malate binding site)以及一个二聚化
接触功能区(dimerization interface)(图 2)。以该序列
编码的氨基酸序列与 GenBank中的非冗余蛋白质数
据库进行同源性搜索 , 该序列与小麦(T. aestivum,
AAT64932)、水稻(Oryza sativa, AAG13573)和玉米
图 1 小麦胞质苹果酸脱氢酶基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig. 1 Nucleotide and putative protein sequences of cytosolic malate dehydrogenases in wheat
核苷酸序列中阴影及斜体的部分为 6个内含子。
Six introns are indicated in italics and in the shadow.
1624 作 物 学 报 第 35卷
图 2 cMDH 保守结构域分析
Fig. 2 Conservative domain analysis of cMDH
(Zea mays, AAB64290)的 cMDH氨基酸序列的一致
性分别为 99%、93%和 94%。系统进化树分析表明,
该序列与小麦两个 cMDH的关系最近(图 3)。由此推
测 , 该序列为小麦胞质苹果酸脱氢酶的基因
(GenBank登录号为 FJ882049)。
图 3 cMDH 与其他 cMDH 蛋白的系统发生分析
Fig. 3 Phylogenetic relationship of cMDH and some other
cMDH proteins
2.2 小麦 cMDH的基因组序列分析
以基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增, 得到
2 908 bp的小麦 cMDH的部分基因组 DNA序列(图
1)。结构分析显示, 该 DNA序列含有 7个外显子和
6个内含子。在 103~955位、1 115~1 216位、1 394~1
817位、2 097~2 185位、2 322~2 401位和 2 516~2 660
位各有一个内含子, 分子量分别为 853、102、424、
89、80 和 145 bp。内含子与外显子相邻碱基均为
GT-AG, 符合典型的植物内含子剪切模式 , 其作用
有待进一步研究。
2.3 定量 PCR扩增产物的特异性确定
在实时定量中通过对熔解曲线的分析 , 发现
cMDH 和 18S rRNA 基因的熔解曲线分别在 82.8~
83.6℃和 83.1~83.6℃之间各有一个单峰(图 4), 表明
2个基因均可特异扩增。
2.4 标准曲线的建立
cMDH 基因和 18S rRNA 基因的标准曲线的斜
率分别为−3.366 和−3.534, 两标准曲线的相关系数
R2分别为 0.9986 和 0.9989, 反应效率都高于 0.99,
表明该体系可用于荧光定量 PCR体系(图 5)。
2.5 小麦 cMDH 基因在花药组织中的相对定量
分析
以可育株单核期花药中的表达量为对照, 分析
cMDH 基因在可育株和不育株花药发育三个时期的
相对表达量(图 6)。在可育株中, cMDH 基因在二核
期表达量都显著高于单核期和三核期, 是单核期的
143.4倍, 是三核期的 8.9倍; 在不育株中, cMDH基
因在二核期表达量最高, 是单核期的 1.2倍, 但两者
间并没有显著性差异, 而与三核期存在显著性差异,
是三核期的 32.3倍; 二者相比, cMDH基因在不育株
单核期花药中的表达量增加 , 是可育株单核期的
55.6 倍, 有显著性差异, 但随后该基因在不育株二
核期和三核期花药中的表达量都显著低于可育株 ,
仅是可育株二核期的 0.5 倍, 三核期仅达到可育株
花药的 0.1倍, 基因表达明显受到抑制。
图 4 cMDH 基因(A)和 18S rRNA 基因(B)的熔解曲线
Fig. 4 Dissociation curves of cMDH gene (A) and 18S rRNA gene (B)
第 9期 张龙雨等: 黏类小麦细胞质雄性不育相关基因 cMDH的克隆与表达分析 1625
图 5 系列稀释的 cDNA 模板浓度与 Ct 值的标准曲线
Fig. 5 Standard curve between Ct and cDNA templates with gradient dilution
a: cMDH基因的标准曲线; b: 18S rRNA基因的标准曲线。
a: standard curve for cMDH; b: standard curve for 18S rRNA.
图 6 小麦 cMDH 基因在不育株和可育株花药发育中的相对表
达分析
Fig. 6 Analysis of relative expression of cMDH gene in the
anther development of male sterile line and fertile line
2.6 小麦不育株和可育株中的 MDH活性分析
比较 MDH 在可育株和不育株中的活性, 具有
类似的动态变化(图 7)。随着花药的发育, MDH活性
在可育株和不育株中均表现为先升后降, 至二核期
均达最大值。二者相比, 在幼穗期和花药发育的单
核期, MDH 活性在不育株中较高, 其中在单核期,
图 7 小麦不育株和可育株中的 MDH 活性
Fig. 7 MDH activity between male sterile line and fertile line
不育株花药的 MDH 活性显著高于可育株, 是可育
株花药的 1.5 倍; 但在花药发育的二核期及三核期,
不育株花药的 MDH 活性则明显降低, 其中在三核
期, 不育株花药的MDH活性显著低于可育株, 是可
育株花药的 82.6%。
3 讨论
利用实时定量 PCR 分析基因的相对表达水平,
目前常用的结果分析方法多采用 Livak等[12]的 2–ΔΔCt
法, 但这种方法要求 PCR的扩增效率为 100%, 而实
际的 PCR 扩增效率不可能达到 100%, 并且通常会
低于 0.6[13]。此外, 在 PCR扩增中, 目的基因和参照
基因的扩增效率不可能完全相同, 也会影响结果的
准确性[14]。而本试验使用双标准曲线引入斜率, 排
除了扩增效率对计算结果的影响, 同时又引入看家
基因作校正, 排除了 RNA总量不均一的影响。因此
该方法能更加准确地计算出基因的相对表达量。
细胞质苹果酸脱氢酶在细胞质中运输反应底物
和间接提供还原动力, 从而为植物的生长和发育提
供能量和物质[15]。Mascarenhas[16]认为, 花粉发育中
表达的基因可分为早晚两个时期, 早期基因的转录
在减数分裂后即可被检测到, 在小孢子发育过程中
逐渐被激活, 在花粉成熟前达到高峰, 然后迅速减
少, 在成熟花粉中其 mRNA 水平下降或检测不到。
一般认为, 早期基因可能编码细胞骨架蛋白和参与
细胞壁形成、淀粉积累的蛋白质; 晚期基因在小孢
子有丝分裂后启动 , 并随着花粉的成熟继续积累 ,
在成熟花粉中表达程度最高, 晚期基因转录和翻译
出来的蛋白在花粉成熟、花粉萌发中起重要作用。
从本试验的定量结果来看, 在可育株和不育株花药
发育的 3个时期中, cMDH基因的表达量均呈现出在
双核期表达量最高 , 三核期显著下降的表达模式 ,
这与本试验酶活性测定的结果变化趋势相一致。推
1626 作 物 学 报 第 35卷
测小麦 cMDH 基因的表达有发育阶段的特异性, 是
花粉发育早期表达的基因, 它的早期表达可以促进
TCA 循环 , 为花粉粒的成熟提供充足的能量。但
cMDH 基因在可育株和不育株花药中的表达量出现
差异。一方面 cMDH基因在不育株单核期花药中的
表达量显著增多, 是可育株单核期的 55.6 倍, 该结
果与其他一些基因在植物雄性不育系中的表达很相
似。龚宏伟等[17]以 K型小麦雄性不育系及保持系为
材料, 对花粉发育过程中核糖核酸酶活性的研究表
明, 不育系花药中核糖核酸酶活性在二核期之前显
著高于保持系, 呈上升趋势, 二核期以后急剧下降。
吴峰等[18]发现在辣椒细胞质雄性不育系花药不同发
育阶段中, 过氧化物酶、多酚氧化酶、超氧化物歧
化酶的比活力明显高于保持系 , 且呈逐渐增强趋
势。而本实验表明, 在单核期不育株花药的 MDH活
性明显高于可育株, 是可育株花药的 1.5倍。由于酶
是基因表达的直接产物, 酶活性的差异可反映基因
表达的差异, 因此推测由于基因表达的异常变化可
能会引起花粉内各种代谢的失调, 从而影响到花粉
粒的发育。另一方面, cMDH基因在不育株二核期和
三核期花药中的表达量急剧下降, 基因表达明显受
到抑制。同时, 不育株花药的 MDH活性明显降低。
前人研究亦有相似报道, 例如李平等[19]研究幼穗发
育过程中的 NAD+-MDH 同工酶活性的变化与籼型
两用核不育系水稻培矮 64S的育性表达的关系表明,
在不育系培矮 64S 的花粉完熟期花药中 , NAD+-
MDH的活性明显下降。张明永等[20]研究苹果酸脱氢
酶在水稻细胞质雄性不育系与保持系呼吸途径中活
性的变化, 发现在不育系的二核期花药中, 苹果酸
脱氢酶的活性显著低于保持系, 仅为保持系的 22%。
推测由于 cMDH基因的表达在不育系花粉发育的二
核期和三核期的相对减弱, 不能催化草酰乙酸还原
为足够的苹果酸, 使返回到线粒体基质中的苹果酸
减少, 导致不育系中 TCA 循环运行程度降低, 所提
供的能量不能满足花粉成熟过程中的需求, 造成花
粉在二核期和三核期的发育受阻而影响小麦的育
性。梁承邺等[21]认为不育花药生活力衰退与活性氧
代谢失控有密切的关系, 而这种失控可能主要源自
能量代谢不能产生足够的还原力, 导致花药不育。
姚雅琴等[22]发现, K 型小麦不育系花粉粒败育的关
键时期在二核期。本试验中 cMDH基因的表达量下
调就发生在不育系花药发育的二核期, 这进一步证
明 cMDH基因与不育系花粉败育有紧密关系。
对小麦 cMDH 基因的克隆为进一步通过反义
RNA或 RNAi技术来研究该基因的具体功能奠定了
基础。此外, 对小麦 cMDH 基因的实时定量表达分
析为探究该基因与小麦雄性不育的关系提供了一条
重要线索。
4 结论
获得了小麦 cMDH基因的 cDNA和 DNA序列,
cDNA序列长 1 213 bp, 编码一段 333个氨基酸的蛋
白质; DNA序列长 2 908 bp, 包含 7个外显子, 6个
内含子, 内含子与外显子相邻碱基均为 GT-AG, 符
合典型的植物内含子剪切模式。在可育株和不育株
花粉发育的 3个时期中, cMDH基因的表达均呈现先
升后降的表达模式; 但与可育株相比, 该基因在不
育株单核期花粉中的表达量显著提高, 之后在二核
期花粉中表达量急剧下降, 且与酶活性的变化趋势
一致。推测该基因是花粉发育早期表达的基因, 它
可能是通过影响小麦雄蕊发育过程中的能量代谢而
参与花粉发育调控。
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