全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(1): 62−70 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究是由中国烟草总公司面上项目(HN200903)资助。
∗ 通讯作者(Corresponding author): 杨铁钊, E-mail: yangtiezhao@126.com, Tel: 0371-63358030
第一作者联系方式: E-mail: rpchen2000@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2011-05-10; Accepted(接受日期): 2011-09-12; Published online(网络出版日期): 2011-11-07.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20111107.1554.023.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00062
TMV侵染烟草基因差异表达的 cDNA-AFLP分析
陈荣平 1,2 刘 磊 3 万秀清 2 邱恩建 2 王春军 2 宋宝刚 2 颜培强 2
杨铁钊 1,*
1 河南农业大学烟草学院, 河南郑州 450002; 2 黑龙江省烟草公司牡丹江烟草科学研究所, 黑龙江牡丹江 157011; 3 牡丹江市疾病防
控中心, 黑龙江牡丹江 157022
摘 要: 以烤烟品种龙江 925 [高抗烟草普通花叶病(TMV)]接种TMV的叶片为材料, 选用 240对引物组合的扩增, 获
得约 9 500个转录基因片段, 经过克隆测序最终获得了 12个诱导表达片段, 它们与核酸代谢、蛋白质合成与修饰、
能量代谢、胁迫响应、细胞内运输、糖代谢等相关。利用荧光定量 PCR分析诱导表达片段 TIF2在 0~72 h之间 5个
时间点(0、12、24、48 和 72 h)的基因差异表达, 证实了所获得的基因序列为真实诱导的表达序列。对此序列进行
RACE, 最终获得全长 cDNA序列, 全序列 857 bp, 预测的编码区在 101~613 bp之间, 共编码 170个氨基酸。经Blastn、
Blastp比对分析, 在烟草中没有获得其同源序列, 确定该基因是在烟草中发现的与抗 TMV相关的新基因。
关键词: 烟草; TMV; 差异基因表达; cDNA-AFLP
cDNA-AFLP Analysis of Differentially Expressed Genes in Tobacco Infected by
TMV
CHEN Rong-Ping1,2, LIU Lie3, WAN Xiu-Qing2, QIU En-Jian2, WANG Chun-Jun2, SONG Bao-Gang2, YAN
Pei-Qiang2, and YANG Tie-Zhao1,*
1 College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2 Mudanjiang Tobacco Science and Research Institute of
Heilongjiang Provincial Tobacco Company, Mudanjiang 157011, China; 3 Centers for Disease Control and Prevention in Mudanjiang, Mudanjiang
157022, China
Abstract: Flue-cured tobacco variety Longjiang 925 with high resistance to Tobacco mosaic virus (TMV) was used as the tested
material, and we selected 240 pairs of primers and amplified cDNA from the tobacco leaf inoculated by TMV. The results showed
that approximately 9500 gene transcript fragments were obtained, and twelve inducible expressed gene fragments were selected
out by cloning and sequencing. The inducible fragments functions, involve in the nucleic acid metabolism, protein synthesis and
modulation, energy metabolism, stress responding, intracellular transport, metabolism of carbohydrates. To validate the func-
tions of these differentially expressed gene sequences obtained, we analyzed TIF2 fragment by real-time PCR with the samples
collected at 0, 12, 24, 48, and 72 hours after inoculation, and the mRNAs samples were isolated. The result of real-time PCR in-
dicated that the gene isolated was related to TMV-resistance. Then, both 5′- and 3′-rapid amplification of cDNA ends (RACE)
were preformed. A full length cDNA sequence of TIF2 contained 875 bp, with a coding zone of 101 bp to 613 bp conjecturably,
encoding 170 amino acids. Analyses of Blastn and Blastp showed that the gene was not homologous to tobacco, and probably was
the TMV-resistance related novel gene. The results will be helpful for the future research on tobacco resistant-breeding to TMV in
molecule level and so on.
Keywords: Tobacco; TMV; Differentially Expressed Genes; cDNA-AFLP
烟草普通花叶病是一种全球性病害, 全世界每
年由烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)造成
的经济损失约一亿多美元。在中国, 大部分烟区都
有该病发生, 以山东、河南、辽宁、安徽、云南、
第 1期 陈荣平等: TMV侵染烟草基因差异表达的 cDNA-AFLP分析 63


黑龙江、四川、广东等省受害较重, 产量降低、品
质变劣[1-2]。通过多年对烟草属野生种和普通烟草品
种抗性研究 , 发现烟草普通花叶病抗源可分作两
类。一类是最早研究的普通烟草品种 Ambalema 的
抗性, 该抗性由 2 对隐性重叠基因决定 , 与一些低
产、劣质基因紧紧连锁在一起。育种工作者在 20多
年的研究实践中试图通过杂交将抗性、丰产、优质
结合在一起 , 但至今没有功。另一类抗性来源于
Nicotiana glutinosa, 是由一对单显性基因控制的 ,
称作 N基因。NN纯合体或 Nn杂合体的叶片在受到
普通花叶病侵染时, 会形成枯斑阻止病毒的系统扩
展, 即产生过敏性反应(HR)。目前大部分商业品种
的普通花叶病抗性均来源于 N 基因, N 基因最早被
转到香料烟品种 Samsoun 及一些白肋烟品种, 但由
于 N 基因对烤烟品质的不良影响, 很难在烤烟品种
中应用[3-4]。尽管美国利用 N 基因育成了烤烟品种
Coker176, 中国育成了抗 44、辽烟 8号、辽烟 10、
辽烟 14 (8021)和龙江 912 等田间抗病性好的品种,
但由于 N 基因对烤性的不良影响, 很难在烤烟品种
中应用。同时, 发现 N基因的抗性具有温度敏感性,
在环境温度低于 28℃时接触 TMV 病毒能够正常发
生过敏性枯斑反应, 产生抗性; 而在较高的环境温
度下, 烟株将不产生枯斑反应, 病毒将会在体内扩
散, 不产生抗性[5-7]。这可能是近几年发现的有些原
来高抗 TMV 的烟草品种在其他地区部分表现感病
的原因。N 基因是目前发现的比较简单的病毒病抗
性基因, 国内外对它做了大量的研究, 全基因序列
和编码的蛋白质已经破译出来, 另外还发现了一些
新的与 N基因有关基因, 或是 N基因家族的其他成
员[8-9], 已经有人将N基因转到其他作物中用于抗病
毒病育种。
龙江 925 是高抗烟草普通花叶病(TMV)的烤烟
品种, 接种 TMV 不产生枯斑反应, 烤性好, 烟叶产
量和质量均很好, 其抗性基因不同于 N 基因。本研
究利用 cDNA-AFLP 技术, 对接种普通花叶病毒的
抗病品种龙江 925 叶片进行分析, 寻找与抗烟草花
叶病毒相关的基因序列, 并利用 RACE 等方法, 克
隆与抗烟草花叶病毒相关的全基因序列, 以期发现
新的抗烟草普通花叶病基因及用于分子育种的技术
储备和物质基础。
cDNA-AFLP 是一种成熟的用于植物差异基因
表达的方法, 已经有了很多成功的试验。张岗等[10]
利用该技术分析小麦成株抗条锈性差异基因表达特
征, 用 37对引物检测到 2 201个(6.81%)差异 TDF,
其中 926个 TDF诱导表达, 1 275个下调表达。经大
规模克隆、测序分析, 最终获得 330 个差异 TDF。
cDNA-AFLP 技术已经成为目前筛选差异表达基因
最有效的方法。利用该技术, Zheng等[11]得到了可能
参与水稻的抗病反应的信号传导的全长 cDNA 基因
序列 ; 谢荣等 [12]鉴定出紫花苜蓿(Medicago sativa)
根瘤发育相关基因; 陈桂平等[13-14]分析耐盐性不同
但遗传背景相似的小麦在盐胁迫和非胁迫的条件下
表达的基因差异, 成功克隆了编码 TaGSKl (glyco-
gen synthasekinase shaggykinase)的全长基因, 并且
得到了在盐胁迫下起调控作用的基因片段 SIR73;
秘彩莉等 [15]获得小麦耐盐性相关基因 TaVHA-C;
刘丽等 [16]以纹枯病菌诱导玉米高耐纹枯病自交系
R15, 分析其基因差异表达谱, 共获得 18 条差异条
带, 其中 2条差异条带与抗病防御基因相关 ; 赵继
荣等[17]筛选出抗黄矮病相关防御基因片段 6 个, 并
结合 RT-PCR 分析, 最终验证了候选抗黄矮病相关
基因表达片段 3个。
cDNA-AFLP保留了 AFLP多态性丰富、稳定性
高、无需了解序列信息等优点的同时, 还具有集中
显示基因组表达序列的多态性差异、重复性好、准
确可靠、效率高等特点, 可对生物体转录组全面、
系统分析 , 并且获得的转录衍生片段 (transcript-
derived fragments, TDF)一般也集中在蛋白的编码区
或者附近, 可最大限度地提供基因编码区的信息。
1 材料与方法
1.1 试验材料及试剂
高抗烟草普通花叶病的烤烟品种龙江925, 由黑
龙江省烟草公司牡丹江烟草科学研究所育种室提
供。
使用 QIAGEN公司的 RNeasy Plant Mini(50)试
剂盒提取RNA。使用TaKaRa公司的TaKaRa M-MLV
cDNA 试剂盒反转录 RNA。RT-PCR 过程中使用
TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0 试剂盒合成
cDNA。Pmd18-T Vector载体、限制性内切酶、 DNA
连接酶、Taq酶、dNTP购自 TaKaRa公司。DNA回
收试剂盒购自上海申能博彩公司产品。低熔点琼脂
糖为 Sigma公司产品。其他常用试剂为国产分析纯。
1.2 接种与取样
接种物采集自用于保存或繁殖TMV病毒的 8~9
片叶烟苗, 用 10倍体积(V/W)的 0.05 mol L–1磷酸缓
64 作 物 学 报 第 38卷

冲液(pH 7.0)研磨新鲜的普通花叶病烟草病叶 , 纱
布过滤后的上清液作为病毒接种物, 用常规的摩擦
接种法对烟草顶端完全伸展开的 2片新叶接种 TMV
病毒。分别在接种后 0、12、24、48 和 72 h, 沿叶
脉一侧定量取样, 液氮速冻, 其中 0 h为对照, 并设
置一次重复, 共取样本 10份, 将这 10个样本分别提
取 RNA用于其后的 cDNA-AFLP试验。
1.3 cDNA-AFLP引物设计
在选择性扩增中 , 共设计 240 对引物 , 其中
Pst I引物 12个 : 5′-GTGACTCATGGTGCAGNNN-
3′(N 为 A、T、C、G 中任意一个 ; 其中 9 个具有 2
个选择性碱基), Mse I 引物 20 个 : 5′-GCTGAGTC
CTGCGTAANNN-3′(其中 12 个具有 2 个选择性碱
基)(表 1)。

表 1 cDNA-AFLP选择性引物组合
Table 1 Selecting amplified primer pairs used in cDNA-AFLP
Pst I引物
Pst I primer
Mse I引物(2个选择性碱基)
Mse I primer (2 selective bases)
Mse I引物(3个选择性碱基)
Mse I primer (3 selective bases)
P1: GTGACTCATGGTGCAGAA M1: GCTGAGTCCTGCGTAAAA M13: GCTGAGTCCTGCGTAAGGA
P2: GTGACTCATGGTGCAGAT M2: GCTGAGTCCTGCGTAAAT M14: GCTGAGTCCTGCGTAAGGT
P3: GTGACTCATGGTGCAGAC M3: GCTGAGTCCTGCGTAAAC M15: GCTGAGTCCTGCGTAACCA
P4: GTGACTCATGGTGCAGAG M4: GCTGAGTCCTGCGTAAAG M16: GCTGAGTCCTGCGTAACCT
P5: GTGACTCATGGTGCAGTA M5: GCTGAGTCCTGCGTAATT M17: GCTGAGTCCTGCGTAACGA
P6: GTGACTCATGGTGCAGTT M6: GCTGAGTCCTGCGTAATA M18: GCTGAGTCCTGCGTAACGT
P7: GTGACTCATGGTGCAGTC M7: GCTGAGTCCTGCGTAATC M19: GCTGAGTCCTGCGTAAGCA
P8: GTGACTCATGGTGCAGTG M8: GCTGAGTCCTGCGTAATG M20: GCTGAGTCCTGCGTAAGCT
P9: GTGACTCATGGTGCAGGA M9: GCTGAGTCCTGCGTAAGA
P10: GTGACTCATGGTGCAGGT M10: GCTGAGTCCTGCGTAAGT
P11: GTGACTCATGGTGCAGCA M11: GCTGAGTCCTGCGTAACA
P12: GTGACTCATGGTGCAGCT M12: GCTGAGTCCTGCGTAACT

1.4 RNA提取及 cDNA的合成
使用 QIAGEN公司 RNeasy Plant Mini(50)提取
试剂盒, 参照使用说明书提取 RNA; 使用 TaKaRa
M-MLV cDNA合成试剂盒, 参照试剂盒使用说明书
cDNA的合成。
1.5 cDNA-AFLP过程
参照 Bachem 等[18]所述的 cDNA-AFLP 体系及
程序, 略加修改。以 Pst I和 Mse I为酶切组合, 取
20 μL双链 cDNA酶切连接, 制备预扩增模板, 并利
用选择性引物预扩增, 将预扩增产物稀释 10 倍后,
用于选择性扩增, 选择性扩增产物经 6%的聚丙烯
酰胺凝胶上 200 V 电压的电泳分离, 用银染法显示
条带。
1.6 cDNA-AFLP 差异表达片段的回收、测序与
分析
使用 E.Z.N.A. Poly Gel RNA Extraction Kit回收
试剂盒回收。将 PCR 产物连接 Pmd18-T 载体
(TaKaRa 公司), 转化 DH5α 感受态细胞, 将转化后
的菌液涂于含 AP的 LB培养基上, 挑取白色菌落进
行菌落 PCR, 并将阳性克隆委托上海生工生物工程
技术服务有限公司测定 DNA 序列。序列登录
GenBank进行 BlastX比对。
1.7 Real-time PCR分析
样品处理与总 RNA 提取同 1.3 和 1.4。cDNA
第一链合成使用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0
试剂盒, 标准样制备与 PCR体系的设计根据 cDNA-
AFLP过程分析得到的序列合成特异引物: YHDL-F:
5′-CAGACCTCCGCGTCATGTGACTCAT-3′, YHDL-
R: 5′-AGTCCTGCGTAAATAAGACATAGAC-3′ 。
PCR 体系含 2.5 µL 10×PCR buffer、2.5 mmol L–1
dNTP各 1 µL、10 µmol L–1 P1 0.5 µL、10 µmol L–1 P2
0.5 µL、1 µL原测序质粒模板、1.5 U rTaq酶(TaKaRa),
加去离子水补足 25 µL。PCR 程序为 94℃预变性 5
min, 94℃变性 40 s, 62℃退火 40 s, 72℃延伸 1.2 min,
共 35次循环, 72℃保温 5 min。纯化产物经紫外分光
光度计测定浓度后, 将浓度调节至 50 ng µL–1, 在
10–6~10–10范围内设 5 个梯度, 各梯度代表的假定拷
贝数分别为 105、104、103、102和 10。实时定量 PCR
体系含 2 µL 10×PCR buffer、2.5 mmol L–1 dNTP各
2 µL、10 µmol L–1 P1 0.5 µL、10 µmol L–1 P2 0.5 µL、
50 ng各时期 cDNA模板或 1 µL标准样模板系列稀
释样、1.5 U Taq酶(TaKaRa)、0.1 µL 10×SBG1, 加
第 1期 陈荣平等: TMV侵染烟草基因差异表达的 cDNA-AFLP分析 65


去离子水补足 20 µL。阴性对照以烟草 DNA作为模
板。在 OPTIONⅡ荧光定量 PCR仪上完成 PCR, 程
序为 95℃预变性 1 min, 94℃变性 30 s, 68℃退火 30 s,
72℃延伸 1 min, 读板, 40次循环。
1.8 RACE克隆全长基因
5′RACE及 3′RACE的 cDNA参照 BD SMART-
RACE cDNA Amplification Kit试剂盒合成。5′RACE
引物为 CGCCTCCATGTCCATAGTGAGCAGC, 3′
RACE 引 物 为 GCTGCATGCCTATGGTGCTCAT
CAC。5′RACE 扩增体系含 5 µL 10×PCR buffer、
2.5 mmol L–1 dNTP各 2 µL、10 µmol L–1 5′RACE引
物 1 µL、5 µL 10×UPM、1.5 U rTaq酶、2.5 µL 5′cDNA,
加去离子水补足到 50 µL。
3′RACE扩增体系含 5 µL 10×PCR buffer、2.5
mmol L–1 dNTP各 2 µL、10 µmol L–1 5′RACE引物 1
µL、5 µL 10×UPM、1.5 U rTaq酶、2.5 µL 3′ cDNA,
加去离子水补足到 50 µL。PCR反应程序为 94℃预
变性 1 min, 94℃变性 40 s, 58℃退火 40 s, 72℃延伸 2
min, 共 35次循环, 72℃10 min。PCR产物经 1%琼
脂糖电泳检测。采用 EasyPure Quick Gel Extraction
Kit试剂盒回收 DNA。将回收产物连接转化并测序。
2 结果与分析
2.1 TMV 诱导烟草叶片后 mRNA 的 cDNA-
AFLP扩增结果
共用 240对引物, 对 TMV接种后 5个时间段的
烟草叶片进行扩增, 共扩增出 9 500余条带, 每对引
物大约能扩增出 20 个条带, 其中有 42 条为诱导表
达片段(图 1和图 2)。
2.2 TMV诱导表达基因片段 TIF (TMV induced
fragment)分析
选取 26条诱导表达的基因片段回收测序, 但最
终只取得了 12 个片段的测序结果, 其他 14 个片段
可能是由于几个大小相近的基因片段在同一位置重
叠, 电泳未能将其分离。
将 12条序列利用 Blast程序在 GenBank数据库
中比对分析(表 2)。将这些诱导表达的基因根据比对
结果分为以下 6 类: (1)与核酸代谢相关基因, 包括
TIF4 (核苷酸转移酶)。(2)蛋白质合成与修饰相关基
因, 包括 TIF9 (烟草 NtH2B2 mRNA); TIF3 (丙氨酸
氨基转移酶)。(3)能量代谢相关基因, 包括 TIF11 (泛
醌-细胞色素 C 还原酶)。(4)胁迫响应相关基因, 包
括 TIF10 (半胱氨酸蛋白酶); TIF12 (核酮糖二磷酸
羧化酶)。(5)细胞内运输相关基因, 包括 TIF1 (水通
道蛋白)。(6)糖代谢相关基因, 包括 TIF8 (UDP葡萄
糖焦磷酸化酶)。其余 4个基因片段包括 2个未知功
能蛋白 TIF5、TIF6和 2个 EST序列 TIF 2、TIF7。

图 1 部分 cDNA-AFLP扩增产物聚丙烯酞胺凝胶电泳图谱
Fig. 1 PAGE electrophoresis patterns of some cDNA-AFLP
amplification products
M: DL2000 marker; A、B为诱导表达片段。
A and B: inducible expressed fragment.
1, 6, 11, 16: 0 h; 2, 7, 12, 17: 12 h; 3, 8, 13, 18: 24 h; 4, 9, 14, 19:
48 h; 5, 10, 15, 20: 72 h.

图 2 部分 cDNA-AFLP扩增产物聚丙烯酞胺凝胶电泳图谱
Fig. 2 PAGE patterns of some cDNA-AFLP amplification
products
M: DL2000 marker; C和 D为诱导表达片段。
C and D: inducible expressed fragment.
1, 6: 0 h; 2, 7: 12 h; 3, 8: 24 h; 4, 9: 48 h; 5, 10: 72 h.

2.3 TIF2片段的全基因克隆
TIF2 号克隆序列是未知功能的新 cDNA 片段,
仅在 EST 数据库中有部分同源序列, 而且出现在过
敏反应相关的表达文库中, 推测是抗 TMV 相关基
因, 所以对此序列进行 RACE扩增。根据 TIF2片段
66 作 物 学 报 第 38卷

表 2 诱导表达片段比对结果
Table 2 Comparison of inducible expressed fragments
编号
Number
长度
Length
(bp)
比对数据库
Database
indexed
登录号
Accession No.
功能
Function
E值
E-value
TIF1 185 Blastx ref|NP_252723.1| Aquaporin Z [Pseudomonas aeruginosa PAO1] 3E–04
TIF2 122 EST gb|CV507093.1|
DD11-25 tobacco ESTs characterized by a hypersensitive
response specific pattern of expression library Nicotiana
tabacum cDNA clone DD11-25, mRNA sequence
3E–41
TIF3 169 Blastx ref|NP_175439.2| ALATS (ALANYL-TRNA SYNTHETASE); ATP binding [Arabidopsis thaliana] 5E–07
TIF4 262 Blastx ref|YP_251888.1| tRNA nucleotidyltransferase [Corynebacterium jeikeium K411] 2E–07
TIF5 159 Blastx ref|XP_002284808.1| Hypothetical protein [Vitis vinifera] 1.9
TIF6 304 Blastx ref|XP_002264221.1| Hypothetical protein [Vitis vinifera] 7E–45
TIF7 159 EST gb|FG182816.1| AGN_PNL205dr1_e3.trimmed.seq AGN_PNL Nicotiana tabacum cDNA 3′ 2E–46
TIF8 209 Blastn dbj|AB055502.1| Nicotiana tabacum NtUGPase mRNA for UDP-glucose pyrophosphorylase 8E–53
TIF9 88 Blastn dbj|AB363001.1| Nicotiana tabacum NtH2B2 mRNA for histone H2B 1E–21
TIF10 452 Blastn dbj|AB306514.1| Plautia stali mRNA for 26,29 kDa proteinase-like cysteine protease 2E–18
TIF11 193 Blastx emb|CAA55863.1| ubiquinol-cytochrome c reductase [Solanum tuberosum] 3E–07
TIF12 282 Blastn gb|DQ682463.1| Nicotiana attenuata RuBisCO activase (rca) mRNA 3E–78

设计了 5′及 3′RACE扩增引物序列, 因为 TIF2片段
较短仅有 159 bp, 现有的核苷酸序列并不能提供最
完美的 RACE引物设计信息, 所以又根据 TIF2片段
在网上比对后扩展到 400 bp 的序列设计了 5′及
3′RACE引物。其中根据 TIF2原始片段设计的 RACE
引物并未扩增出产物, 原因很可能是原始片段过短,
核苷酸提供的序列有限, 引物的设计不符合 RACE
引物的设计标准。根据扩展到 400 bp序列设计的 5′
及 3′RACE 引物分别得到了一条特异扩增产物, 其
中 5′RACE扩增产物长度为 495 bp, 3′RACE扩增产
物长度为 450 bp。将 5′RACE 序列和 3′RACE 序列
拼接, 共得到长度为 857 bp的全长 cDNA序列, 命
名为烟草甘氨酸富集蛋白 (Nicotiana tabacum
Glycine-rich RNA-bindingproteins, NtGRP)。NtGRP
基因序列如下:
TAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCGCGG
GGGGAAATCTTCATTCGAAAAACTTTGCTTAAC
GTTCGCTCAACAAAGAAAATCTGTACTAGTAGT
GAAATATGGGAGGTGGACAGGATGGGTCTGAT
AAGGGACTCTTTTCCCATCTTATACCCGGTATGA
CTGGTCATTCTTCTGGTCATGGATATCCACCGGG
GCAGTACCCTCCGCCGCCTGGTGCTTACCCTCC
GCATCAAGGGTATCCTCCTCAAGGATATCCTCCT
CAGGGTTATCCTCCACAGGGAGGAGGATACCCA
CCTGCAGGATATCCTCCACAAGGATATCCTCCC
GCTGGTGGTCACCACGCTCCTCCACACCAATCA
GGTCATGGGGGCATGGGGGCGATGTTAGCCGG
AGGTGCTGCAGCTGCAGCTGCTGCCTATGGTGC
TCATCACCTGGCACACGGAAGTGGATCTCACAT
GGGACACGGTGCTGCTCACTATGGACATGGAG
GCGGTCATTATGGAGGCGGTCATTATGGAGGCA
AGTTTAAGCATGGCAAGCATGGGAAATTCAAGC
ACGGAAAGCATGGCAAAGGCGGGATGTTCGGA
GGCAAATTCAAGAAGTGGAAGTAAACAAGTGT
CTTACTTATAATATCAACTTCACCTGGTTTTTTAC
ATTGTGTGCTAATACTCCGTCTTTAAATAAGACA
TACTACATGTTATAATTGGCCTATAGGCCTGTGA
GATGTTCTCTTGTTATATTGCATTTTCAATCAATG
CTAAATTGTGTGAGACTATGCAGTTGGATTGCC
GCAGATGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAGTACTCTGCGTTGATACCACTGCTT
A
2.4 NtGRP基因 cDNA序列功能分析
利用 NCBI的 ORF finder程序对此全长序列进
行可读框架分析, 发现其编码的起始密码子位置在
第 101 个核苷酸上, 终止位置在第 613 个核苷酸上
(图 3), 共编码 170个氨基酸(图 4)。
将 NtGRP序列在 NCBI数据库中进行 Blastn对
比分析, 比对结果与 3′RACE 序列在网上的比对结
果基本一致, 在烟草中未找到同源序列, 与番茄被
水杨酸及多种病原物诱导出现的序列同源, 同源性
最高的 3个序列均来源于番茄 , 相似性为 71%, 基
因功能未知, 表 3列出了与之同源性最高的 3个核
苷酸序列。
2.5 TIF2片段的 real-time PCR分析
2.5.1 标准曲线 图 5 所示, 只有在标准样梯度
10−10 处显示扩增结果同标准曲线有一定偏离, 属于
第 1期 陈荣平等: TMV侵染烟草基因差异表达的 cDNA-AFLP分析 67



图 3 NtGRP序列开放阅读框分析
Fig. 3 Analysis of open reading frame of NtGRP sequence
实验随机误差, 已将其从标准曲线中除去, 实验体
系较为合理。
2.5.2 目标基因表达丰度 图 6显示, 实时定量

图 4 NtGRP序列蛋白编码分析
Fig. 4 Analysis of protein seguence encoded by NtGRP

表 3 NtGRP核苷酸序列 Blast比对结果
Table 3 NtGRP nucleotide sequence compared by Blastn
登录号
Accession No
功能
Function
E值
E-value
相似度
Similarity (%)
AK224726.2 Solanum lycopersicum cDNA, clone: FC10DE01, HTC in fruit 1E–79 71
AK319374.1 Solanum lycopersicum cDNA, clone: LEFL1005BG08, HTC in leaf 1E–79 71
AB211523.1 Solanum lycopersicum mRNA for hypothetical protein, complete cds, clone: FC10DE01 1E–79 71


图 5 实时定量标准曲线
Fig. 5 Standard curve in real-time PCR

图 6 实时定量 PCR报告
Fig. 6 Report of real-time PCR
S1:0 h; S2:12 h; S3:24 h; S4:48 h; S5:72 h.
68 作 物 学 报 第 38卷

PCR 运行结束后 , 目的基因的时序表达状况集于
报告中。图中 S1~S5 为取样时间 0、12、24、48
和 72 h的样品, Blank为阴性对照。从结果上来看,
TIF2片段在接种 TMV后 12 h表达量最高, 其后表
达量在 24 h 减少, 在 48 h 表达量又明显增加, 在
72 h减至除 0 h外最低, 证明 TIF2基因确实为诱导
表达基因。
3 讨论
普通烟草 (Nicotiana tabacum L.)是模式植物 ,
具有较强的组织再生和分化能力, 容易进行基因转
化和组织培养, 成为转基因和生物学试验的最好模
板, 用于研究新基因等的转录与表达效果等, 是转
外源基因最多的植物 [19]。同时, 烟属(Nicotiana)有
66个种(species), 普通烟草是异源四倍体[3], 含有丰
富的变异类型, 抗性基因也较丰富, 普通烟草作为
主要的叶用经济作物 , 容易受到各种病虫害的侵
袭。大量研究发现并分离克隆了一些新的抗性基因,
用于今后的分子抗病育种工作, 以培育更多的抗病
品种。周佳等[20]利用 SSH结合 cDNA芯片技术, 克
隆到与烟草抗马铃薯Y病毒(PVY)相关基因NtPsaN,
陈帅等[21]利用 SSH 技术在受 PVY 诱导的烟草中分
离到 NtERD1基因。本研究虽然只取得了 12个诱导
表达片段的测序结果, 但其含盖核酸代谢、糖代谢
等多条生理代谢途径。显示了烟草被 TMV 侵染后
体内发生的一系列生理变化, 可以推测烟草与 TMV
互作后是通过多种代谢途径协调作用来抵抗 TMV
侵染的。如 TIF10 半胱氨酸蛋白酶和 TIF12 核酮糖
二磷酸羧化酶是已知的在抵抗植物逆境或胁迫时的
重要蛋白。TIF11泛醌-细胞色素 C还原酶即电子传
递复合体Ⅲ是电子传递的关键酶; TIF8 UDP葡萄糖
焦磷酸化酶是与糖代谢相关的酶, 它们都与植物的
呼吸作用相关, 植物被病原物侵染后, 可以依靠呼
吸作用氧化分解病原微生物分泌的毒素, 消除其毒
害 , 同时通过旺盛的呼吸作用 , 促进伤口愈合 , 加
速木质化或者栓质化, 抑制病斑的继续扩大。呼吸
作用还可以加强具有杀菌作用的物质的合成, 增强
植物的免疫力, 上述蛋白可能是通过提高植物的呼
吸作用来参与植物抗病的。TIF1 为水通道蛋白, 水
的跨膜转运在细胞的代谢当中有重要作用, 可以在
细胞膜的内外转运中实现细胞的多种功能, 水通道
蛋白负责水分的跨模运输, 协调胞内离子浓度和细
胞渗透压, 所以在受到外界胁迫时其表达量会发生
变化。
利用 cDNA-AFLP 技术分析基因表达差异, 其
最终目标是为了分离差异表达基因, 研究被分离基
因在生物个体中起的作用。本研究应用 cDNA-AFLP
技术成功克隆出 1条与抗 TMV相关的新基因, 将其
翻译为氨基酸序列后进行 Blastp 分析, 判定此基因
为编码 GRP蛋白基因, 即命名为 NtGRP基因。GRP
基因的表达可受到多种物理、化学和生物因素的影
响, 如病毒侵染、机械损伤、真菌感染、温度、激
素处理等都可以在一定程度上影响 GRP 基因的表
达, 这表示 GRP可能参与一些重要的生理过程。病
原相关蛋白(pathogenesis related protein, PRP/PR)被
认为与植物的局部和系统的诱导抗性有关, 在植物
对各种病原菌的抗性中起作用。在 PRP蛋白中, PR-1
家族的 3个蛋白 PR-la、PR-lb和 PR-1c都富含苷氨
酸, 虽然功能尚不明确, 但它们在 NN 型香料烟对
TMV 的过敏反应(HR)过程中产生, 说明这组 PRP
有抗病毒功能 , 有人推测可能与细胞壁上富含甘
氨酸的蛋白(GRP)类似 , 起加强机械抗性的作用。
本研究的结果与此基本相同, 克隆的 NtGRP 序列
也是在对 TMV 过敏反应过程中产生的, 并且都富
含甘氨酸。NtGRP序列在 NCBI上的比对结果是受
多种病毒及水杨酸所诱导的 GRP 蛋白, 虽然有很
多的化学物质都能够诱导植物产生局部抗性 , 并
且也能诱导产生 PRP 蛋白, 但只有将水杨酸喷在
烟草上时才能使 TMV抗性选择性地增加, 在大麦、
玉米等植物中也存在与 PR-1蛋白类似的 PRP蛋白,
只有在病原菌感染或水杨酸处理后才出现 , 这与
NtGRP序列极为相似, 结合 real-time PCR分析, 可
以推断此基因与 TMV 抗性密切相关。因此, 深入
研究此基因的结构与功能, 阐明其作用机制, 对进
一步了解植物抗病机理 , 具有重要的理论和实践
意义。
4 结论
克隆了全序列为 857 bp、编码区为 101~613 bp
之间的 NtGRP 基因。它与 TMV 抗病性相关, 是 1
条不同于 N 基因的新的 TMV 抗性基因。该基因高
抗 TMV, 且不会对烤烟品种的烤性有不良影响, 具
有较好的应用前景。可将 NtGRP 基因转到对 TMV
没有抗性的烟草品种当中, 进一步验证其与 TMV
的关系及其作用机制 , 用作分子育种基础储备物
质。
第 1期 陈荣平等: TMV侵染烟草基因差异表达的 cDNA-AFLP分析 69


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