全 文 ：第 28 卷 第 1 期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 1
2002 年 1 月　 110～ 114 页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 110～ 114　 Jan. , 2002
水稻胚乳特异性启动子G t1 的克隆及其功能验证α
张宪银　薛庆中3
(浙江大学农学系, 浙江杭州, 310029)
摘　要　以水稻品种“密阳 46”的DNA 为模板, 用 PCR 方法从水稻谷蛋白基因G t1 上游序列扩增出特异性条带, 并克
隆出种子特异性启动子。经鉴定, 它的长度为 929 bp , 与 T akaiw a (1987) 报道的序列仅有 12 个核苷酸的差异, 已知的
功能部位序列没有发生改变。用它构建了带动报告基因Gus 表达的双元载体, 并用农杆菌介导法转化水稻得到了转基
因植株。对Gus 基因表达检测结果表明, 由该启动子序列引导Gus 基因能在胚乳中表达, 而其它组织中都未表达, 证实
该启动子具有胚乳特异性表达的功能。
关键词　水稻; 启动子; 转基因
中图分类号: S511　　　文献标识码: A
Clon ing of a R ice Endosperm - spec if ic Promoter G t1 and Its Functiona l Ver if ica-
tion
ZHAN G X ian2Yin　XU E Q ing2Zhong
(D ep t of A g ronom y , Z hej iang U niversity , H angzhou 310029, China)
Abstract　A pair of specific p rim er w as designed acco rding to the published sequence of the 5′up stream se2
quence of rice glutelin gene G t1. A 929 bp sequence w as amp lified from genom icDNA temp late of an Ind ica rice
variety‘M iyang 46’by PCR. Sequence analysis show ed 12 bp difference betw een the cloned and the published
sequences. N o difference w as found in know n functional regions. T he cloned p romoter has been used in con2
struction of A g robacterium binary vecto rsw ith Gus repo rter gene, and several transfo rm ed p lan tsw ere obtained
th rough A g robacterium 2m ediated transfo rm ation. Gus activity in various tissues of transfo rm ed p lan ts w as ex2
am ined and the results show ed that Gus gene directed by the p romoter sequence of rice glutelin gene G t1 w as tis2
sue2specifically exp ressed in endosperm , in con trast to the exp ression pattern of Gus gene directed by 35S p ro2
moter, w h ich w as exp ressed in all the tissues tested.
Key words　O ry za sativa; P romoter; T ransfo rm ation
　　研究种子贮藏蛋白表达调控和克隆种子特异性
启动子是开展稻米品质分子改良工作的基础。据报
道, 水稻醇溶蛋白 4 a 基因 5′端测翼区已被克隆,
其中- 680～ - 18 区段具有胚乳特异性表达调节功
能[ 1～ 5 ], 推测水稻醇溶蛋白 4 a 基因受串联复合启
动子调控[ 6 ]。谷蛋白占水稻种子贮存蛋白的 70%～
80% , 而且控制谷蛋白的基因数目比醇溶蛋白的要
少得多, 所以水稻谷蛋白的启动子有可能比醇溶蛋
白的启动子要强。作者从水稻谷蛋白基因G t1 的上
游序列[ 7 ]克隆出胚乳特异性启动子, 并通过转基因
首次证实它能驱动 Gus 基因在水稻种子胚乳中表
达。
1　材料与方法
1. 1　植物材料
克隆启动子用的DNA 模板从水稻品种“密阳
46”叶片中提取, 本课题组培育的早粳品系“浙大
19”供转基因用。α 基金项目: 国家 863 计划 (10120120120123) ; 国家自然科学基金 (39870421)
作者简介: 张宪银 (1961 年生) , 男, 浙江温州人, 副教授, 博士, 长期从事作物遗传育种与植物生物技术研究;
薛庆中 (1942 年生) , 男, 教授, 博士生导师。研究方向作物遗传育种、植物生物技术。　　3 联系作者
Received on (收稿日期) : 2000201219, A ccep ted on (接受日期) : 2000210222

1. 2　试剂、质粒和菌株
常规试剂为国产分析纯试剂; 各种内切酶、修
饰酶、T aq 和 Pfu DNA 聚合酶购自华美公司、生工
公司或M B I公司; 克隆载体 pBS SK (- ) 为 Strate2
gene 公司的产品, 农杆菌双元载体 pCAM B IA 1301
由澳大利亚 CAM B IA 研究中心提供; 大肠杆菌菌
株为 T G1。
1. 3　基因组D NA 提取方法
用作 PCR 模板的水稻 DNA 按M cCouch 等
(1988)的方案[ 8 ]稍作修改提取。
1. 4　PCR 扩增和产物的克隆
根据报道的水稻谷蛋白基因 G t1 的 5′端序
列[ 7 ] , 设计如下引物:
上游引物:
5′2A GGTCA TA GGGA GA GGGA GCT T23′
下游引物:
5′2GT T GT T GTA GGA CTAA T GAA CT GA 23′。
由上海生工公司合成。预计扩增从- 900 到+
35 的序列, 长度为 935 bp。T aq 酶的扩增采用厂家
提供的标准条件, 引物浓度为 0. 4 Λm , dN T P 浓度
为 0. 2 mM。PCR 循环参数为预变性 94℃ 7 m in;
94℃ 40 秒, 58℃ 2 分, 72℃ 1 分, 30 个循环; Pfu
酶扩增的其它条件相同, 延伸时间延长为 2. 5 分。
扩增片段经酚抽提、酒精沉淀, 再用低溶点胶纯
化, 用于酶切鉴定和克隆。
pBS SK (- ) 质粒用 E coRV 切开, 为防止载体
自连, 用C IP 酶去掉 5′端的磷酸基团; 用 Pfu 酶扩
增的平末端片段, 纯化后, 用 T 4 磷酸激酶在A T P
的存在下使 5′端磷酸化, 用 T 4 连接酶与载体连接
(按试剂说明书)。连接产物转化大肠杆菌 T G1 菌
株感受态细胞, 少量提取质粒, 酶切鉴定, 筛选正
向插入的克隆成为 pBS2G t1。
1. 5　酶切鉴定方法和序列测定
按碱裂解法[ 9 ] 制备质粒, 分别用 B am H I 和
S al I 酶切鉴定插入片段的长度, 用 P st I 和 E coRV
酶切鉴定插入方向。选择 5′端朝 P st I位点方向的克
隆进行测序, 并用于进一步的加工和利用。提供
pBS2G t1 质粒, 由 T aKaR a 公司提供测序服务。全
长测序用 T 7 和 T 3 引物两头测定。
1. 6　表达质粒构建过程
农杆菌双元载体 pCAM B IA 1301 经H inD III 和
N co I 酶切, 分离大片段, 经 K lenow 酶补平后, 用
T 4 连接酶连接, 成为 pCAM 2Gus。后者用B am H I
和S al I酶切, 分离出大片段, 与pBS2Gt1 的B am H I
和 S al I 小片段 (启动子) 连接成为 pCAM 2Gt12Gus
(图 1)。
图 1　带Gus 报告基因的质粒构建策略
F ig. 1　Schem e for construction of p lasm id pCAM 2Gt2Gus
StepÉ : Excision of 35S p romoter w ith H ind III and N coI
Step II: Insertion of G t1 p romoter before Gus gene
LB: left border; RB: righ t border; M CS:
m ulti2cloning sites; N os: nos term inito r
图 2　Gt1 启动子 PCR 扩增产物的酶切鉴定
F ig 2　Enzym e digestion of PCR p roduct of 5′sequence
of rice glutilin gene G t1
1: PCR p roduct; 2: PCR p roduct+ E coRV ,
M arker: 1 kb DNA ladder m ix (Sangon)
1. 7　水稻遗传转化
将 pCAM B IA 1301 质粒 (Gus 基因在 35 S 启动
子带动下)和新构建的 pCAM 2Gt12Gus 质粒 (Gus 基
因在 G t1 启动子带动下) 分别用直接法导入农杆菌
EHA 105 菌株的感受态细胞, 再转化水稻品系“浙
大 19”。转化方法按H iei等 (1994) [ 10 ]的方法稍作修
改。
1111 期　　　　　　　　　　　　张宪银等: 水稻胚乳特异性启动子G t1 的克隆及其功能验证　　　　　　　　　　　　　　

1. 8　转基因植株的 PCR 检测
取再生植株的叶片, 用 1. 3 的方法提取DNA ,
对 H y g 和 Gus 基因进行 PCR 检测。H y g 基因和
Gus 基因的 PCR 检测引物序列分别为,
H y g 1 5′2TA GGA GGGCGT GGA TA T GGC23′
H y g 2 5′2TA CA CA GCCA TCGGTCCA GA 23′ 和 Gus1 5′2GGGA TCCA TCGCA GCGTAA T G23′Gus2 5′2GCCGA CA GCA GCA GT T TCA TC23′预期扩增片段的长度分别为 852 bp 和 563 bp。PCR 反应在 PE480 型DNA 扩增仪上进行, 采用标准反应体系。反应条件为94℃预变性5m in , 再以
图 3　　克隆的水稻谷蛋白基因启动子序列和 Takaiw a (1987)序列的比较
F ig. 3　　Comparison of the cloned rice glutelin p romoter sequence and the reported sequence
211　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　28 卷

94℃ 1 m in, 61℃ 1 m in, 72℃ 1 m in 进行 28 个循
环反应, 后延伸为 72℃ 10 m in。
1. 9　GUS 检测方法
转化植株经 PCR 鉴定H y g 基因和Gus 基因的
存在的情况下, 用 X2Gluc 检测液对 Gus 基因表达
的情况进行鉴定, 以验证启动子的功能。GU S 检测
按R ueb (1989) [ 11 ]的方法稍作修改进行。
2　结果与分析
2. 1　PCR 产物的酶切鉴定
根据设计的引物, PCR 产物的预期长度为 935
bp , 在- 520 位置有一个 E coRV 酶切位点, PCR 产
物经 E coRV 酶切后, 应产生 381 bp 和 554 bp 两个
片段。实际结果与预期的相符, 如图 2 所示 (根据测
序结果, 长片段实际长度应为 548 bp )。PCR 产物
克隆在 pBS SK (- ) 载体后的酶切鉴定结果见图 4
的泳道 1 和泳道 2。泳道 1 是用B am H I和S al I分离
pBS2Gt1 中的整个启动子, 泳道 2 是用 P st I和启动
子中的酶切位点 E coRV 鉴定外源片段的插入方向。
2. 2　克隆化启动子的序列分析
克隆的启动子序列分析结果和 T akaiw a
(1987) [ 7 ]的序列比较如图 3 所示。
比较报道序列 (上行)和新克隆的序列 (下行)可
见, 两序列仅在- 89、- 104、- 257、- 514、- 829
和 - 866 位置有 6 个碱基的差异 (划底线的碱基) ,
并在- 101、- 190 和- 269 三个位置各有两个碱基
的缺失, 共缺失 6 个碱基, 所以实际长度为 929 bp。
但在已知的功能区 (图中带黑框部分) 没有任何差
异。
2. 3　带 GUS 报告基因的重组质粒酶切鉴定
图 4 显示了用B am H I和 S al I分离pCAM 2Gt12
GU S 质粒中的启动子 (泳道 3) , 用 P st I 和 B stE II
可同时分离出 0. 93 kb 的启动子片段和 Gus 基因
( 2. 05 kb ) (泳道 4) , 以及对照, 为中间质粒
pCAM 2Gus 用 P st I 和B stE II 酶切的结果, 2 kb 左
右的带为带内含子的Gus 报告基因的长度, 说明 35
S 启动子已被切除, G t1 启动子未插入 (泳道 5)。
2. 4　转基因植株的 PCR 鉴定
用带 pCAM 2Gt2Gus 质粒的农杆菌转化水稻早
粳品系“浙大 19”的盾片愈伤组织, 产生了 6 株转基
因苗, 均已成株结实。PCR 检测的结果显示, H y g
基因和 Gus 基因都已整合到植物基因组中 (见图
5)。
图 4　pBS2Gt 和 pCAM 2Gt2Gus 质粒的酶切鉴定
F ig. 4　A nalysis of p lasm ids pBS2Gt1 and
pCAM 2Gt12Gus by enzym e digestion
M arker: 1 kb DNA ladder m ix (Sangon)
1: pBS2Gt1+ B am H I+ S al I; 2: pBS2Gt1+ P st I+ E coRV ;
3: pCAM 2Gt2Gus+ B am H I+ S al I; 4: pCAM 2Gt2Gus+ P st I
+ B stE II; 5: pCAM 2Gus+ P stI+ B stE II
图 5　pCAM 2Gt2Gus 质粒转基因植株的 PCR 鉴定
F ig. 5　PCR analysis of rice p lants transform ed
w ith pCAM 2Gt2Gus p lasm id
124: PCR amp lyfication of Hyg gene　　1: positive contro l;
2 and 3: p lants; 4: negative contro l; 529: PCR
amp lyfication of Gus gene; 5: positive contro l;
628: p lants; 9 negative contro l
2. 5　转基因植株的 GUS 检测
为了确证所克隆启动子的功能, 取转基因植株
不同部位的组织进行 GU S 检测。从转基因植株结
的种子横切面可以明显地看出, 转 pCAM 2Gt2Gus
质粒植株只在胚乳中特异性表达, 在胚中不表达,
而且四周染色明显比中间深 (图版 I, 1) , 这与蛋白
质在种子中的分布是一致的。转 pCAM B IA 1301 质
粒的植株上的种子, 在胚和胚乳中都表达, 而且整
个胚乳范围都比较一致 (图版 I, 7)。
对根、叶片、叶鞘、茎、颖壳、等组织的 GU S
检测结果表明, G t1 启动子驱动下的 Gus 基因不会
在这些组织中表达 (图版 I, 226) , 而 35S 启动子带
3111 期　　　　　　　　　　　　张宪银等: 水稻胚乳特异性启动子G t1 的克隆及其功能验证　　　　　　　　　　　　　　

动下的 Gus 基因能在上述的组织中表达 (图版 I, 82
12)。由此可以确认, G t1 为胚乳特异性表达的启动
子。
3　讨论
如前所述, 我们克隆的水稻谷蛋白基因 G t1 的
5′端序列与原报道的序列共有 12 个碱基的差异。
究其原因, 其一可能是品种间原有的差异。原序列
是对日本粳稻品种“M angetsumoch i”基因组 DNA
分析结果, 而本文用的是籼稻品种“密阳 46”。不同
类型或品种间在同一个基因的启动子序列有可能存
在 一定的差异。如 T akaiw a ( 1991 ) [ 13 ] 和 O k ita
(1989) [ 12 ]报道的同一个 G t3 基因的启动子有 15 个
碱基的差异。其二可能是 PCR 扩增过程中产生的
变异。本试验采用了高保真的 Pfu 酶做 PCR 反应,
故认为这种可能性很小。其三是不应排除测序的误
差。
水稻谷蛋白基因G t1 的启动子序列已被用于转
化烟草和玉米, 证明能够分别正确引导Gus 报告基
因在烟草和玉米的胚乳中表达[ 13 ] [ 14 ] , 所以用这个
启动子引导外源基因在水稻胚乳中特异性表达可能
性很大。本研究用转基因的方法对该启动子的功能
进行了直接验证, 证实该启动子确能引导基因在水
稻胚乳中特异性表达, 这将为进一步开展水稻品质
分子改良提供重要手段。已用该启动子构建了带动
大豆球蛋白基因表达的农杆菌转基因双元载体, 并
用农杆菌介导法转化水稻, 得到了转基因植株 (另
文报道)。
最近有人用水稻谷蛋白基因 G luB 1 的启动子
进行禾谷类作物转基因研究[ 3 ] , G t1 (即 G luA 2) 基
因的启动子的应用未见报道。控制水稻贮藏蛋白的
基因家族比较大, 每个基因的表达量也有所不同。
水稻贮藏蛋白基因的克隆采用了产物已知基因的克
隆策略, 即以贮藏蛋白的氨基酸序列为起点, 经
cDNA 最后找到核基因的, 所以最先找到的基因有
可能是表达量最大的。本研究克隆了最先克隆的水
稻谷蛋白基因G t1 的启动子序列, 并证明该启动子
能引导Gus 基因在胚乳进行组织特异性表达。至于
表达量如何, 能否达到目的基因表达的需要仍需进
一步的研究。但初步观察的结果显示, GU S 表达在
不同的转基因植株和同一植株的不同种子之间都有
很大的差异, 这可能与外源基因的插入部位、基因
的分离、种子的成熟度等都有关系。
References
[ 1 ]　Takaiw a F, Oono K. Genom ic DNA sequences of two new
genes for new storage p ro tein glutelin in rice. J pn J Genet.
1991, 66: 161～ 171
[ 2 ]　W ang G2Y (王关林) , Fang H 2J (方宏筠). P rincip les and tech2
nology of P lant Genetic Engineering (植物基因工程原理与技
术)Beijing, Science P ress, 1998. 32～ 34
[ 3 ]　Katsube T , Kurisaka N , O gaw aM et al. A ccum ulation of soy2
bean glycinin and its assem bly w ith the glutelins in rice. P lant
P hy siology , 1999, 120: 1063～ 1073
[4 ]　Zhou XJ, Fan YL. C loning and identification of rice p ro lam in
4a gene p romoter. R ice Genetic N ew sletter, 1990, 7: 154～
159
[ 5 ]　Zhou X2J (周先锦) , Fan Y2L (范云六). T issue2specific ex2
p ression and regulation of rice seed storage p ro tein gene p ro2
lam in 4a. S cientia S inica S eries B (中国科学, B 辑) , 1992,
11: 1176～ 1181
[ 6 ]　Zhao J (赵军) , Fan Y2L (范云六). R ice p ro lam in 4a gene is
regulated by tandem comp lex p romoter. S cientia S inica S eries C
(中国科学, C 辑) , 1996, 26 (2) : 156～ 163
[ 7 ]　Takaiw a F, H Ebinum a, S Kikuchi et al. N ucleo tide sequence
of a rice glutelin gene. FEB S L etters, 1987, 220: 43～ 47
[ 8 ]　M cCouch S R. Kochert G, ZH Yu et al. M olecular m app ing of
rice chromosom es. T heor A pp l Genet, 1988, 76: 148～ 149
[9 ]　Sam brook J , F ritsch EF, M aniatis T. M olecular C loning—A
L aboratory M anual (2nd ed). N. Y, Cold Sp ring Harbor L abo2
rato ry P ress, 1989
[ 10 ]　H iei Y, O hta S, Kom ari T et al. Efficient transform ation of
rice (O ry za sativa L. ) m ediated by A grobacterium and se2
quence analysis of the boundaries of the T2DNA. P lant J ,
1994, 6 (2) : 271～ 282
[ 11 ]　Rueb S, Hensgens LAM. Imp roved histochem ical staining forΒ2D 2glucuronidase activity in monocotyledonous p lants. R ice
Genet N ew sl, 1989, 6: 168～ 169
[ 12 ]　O kita TW , Hw ang Y S, Hnilo J H et al. Structure and exp res2
sion of the rice glutelin m ultigene fam ily. J B iol Chem 1989,
264: 12563～ 12581
[ 13 ]　Takaiw a F, Oono K, Kato A. A nalysis of the 5′flank ing re2
gion responsible for the endosperm 2specific exp ression of a rice
glutelin ch im eric gene in transgenic tobacco. P lant M olecular
B iology , 1991, 16: 49～ 58
[ 14 ]　Russell DA , F romm M E. T issue2specific exp ression in trans2
genic m aize of four endosperm p romoters from m aize and rice.
T ransgenic R esearch, 1997, 6: 157～ 168.
411　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　28 卷