全 文 ：第27卷 第4期 作　物　学　报 V ol. 27, N o. 4
2001 年7月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA July, 2001
玉米细胞质线粒体DNA　RFLP 分类研究Ξ
李小琴2　万邦惠2　刘纪麟1　李建生1　郑用琏1　徐尚忠1
(1华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 湖北武汉, 430070; 2华南农业大学农学系, 广东广州, 510642)
提　要　本实验用4个酶、4个探针组成16个酶ö探针组合对玉米N、T、C、S、WBM s、801CM S 等细胞
质进行了线粒体DNA (m tDNA )R FL P 分析。一方面对玉米细胞质m tDNA R FL P 分类方法进行研究,
证明只要酶ö探针技术体系合适, 可以通过该方法对细胞质进行快速准确地分类; 提出探针的选择是
主要的, 酶次之; 认为 P stÉ öB 30、H indË öpBcmH 3、B am H É öpHJ22721三个酶ö探针可以作为m tDNA
R FL P 分类技术体系。另一方面, 用m tDNA R FL P 分类法把新发现的WBM s 不育胞质划分为 S 组,
801CM S 划分为C 组。
关键词　R FL P; 线粒体DNA ; 细胞质分类; 雄性不育; 玉米
RFL P Cla ssif ica tion of Cytopla sm ic m tD NA in M a ize
L I X iao2Q in2　WAN Bang2H ui2　L IU J i2L in1　L I J ian2Sheng1　ZH eng2Yong2L ian1
XU Shang2Zong1
(1 S tate key lab. of C rop Genetic Im p rovenm ent, H uazhong A g r. V niv. , H ubei W uhan 430070, China; 2D ep t of A g ronom y ,
S outh China A g r. U niv. , Guangd ong guangzhou 510642, China)
Abstract　　R FL P analysis of m tDNA w as carried out w ith 16 (4×4) com binations of enzym eö
p robs to study the N T , C, S cytop lasm ics of m aize, as w ell as the uncertain cytop lasm ics of a
m ale sterils lines, WBM s and 801 M s. T he results indicated: (1) R FL P analysis of m tDNA
could classify the cytop lasm of m aize quick ly and co rrectly if app rop riate enzym eöp robe. Com bi2
nation ( s) w as (w ere) used. (2) Op tion of p robes w as of p rim ary importance w ith that of en2
zym es rank ing the second. (3) T h ree enzym eöp robe com binations, i. e. , P stÉ öB30, H indË ö
pBcmH 3 and B am H É öpHJ22721, w ere suggested as better techn ical system s fo r the classification
of the cytop lasm ics of m aize w ith R FL P m tDNA analysis. (4) T he m ale Sterile Cytop lasm ics of
WBM s and 801 M s w ere classified as S and C cytop lasm s respectively acco rding to results of
R FL P m tDNA analysis.
Key words　　R FL P; m tDNA ; Cytop lasm ic classification; M ale sterility; M aize
1970年, 美国玉米大面积暴发 T 型小班病, 警示人们要用抗病的、多样化的细胞质雄性
不育杂交种, 促使了玉米细胞质分类研究[ 1 ]。1971年, Beckett [ 2 ]首先据育性恢复专效性原理
提出大田育性鉴定分类法, 把玉米不育胞质分成 T、C、S 三大组。1976年, L evingsË [ 3 ]发现Ξ 本研究由国家自然科学基金重点资助项目、广东省自然科学基金共同资助, 在华中农业大学作物遗传改良国家重点
实验室完成。
收稿日期: 1999212219, 接受日期: 20002102
Received on: 1999212219, A ccep ted on: 20002102

细胞质中控制育性的遗传物质存在于线粒体DNA (m tDNA ) 上, 从此, 人们开始据m tDNA
对不育胞质进行分类。迄今还未弄清m tDNA 控制育性的遗传机制, 仍无法从育性基因本身
对细胞质分类, 只能从分析整个m tDNA 分子的差异进行分类。分析m tDNA 差异的方法有
R EFA (R estriction enzym e fragm en t analysis)、R FL P、RA PD 等[ 3～ 8 ]。由于R FL P 技术相对稳
定, 重复性好, 采用较多。m tDNA R FL P 分类技术尚有待完善。
目前生产上可利用的抗病不育胞质仅有 S 组、CÉ、CÊ 亚组[ 9 ]。但C 组仅含4种胞质; S
组虽有一百多种胞质, 由于育性不稳定等因素, 在我国大面积应用的仅唐、双等2～ 3种胞
质[ 1 ]。细胞质类型单一给生产造成很大隐患, 挖掘新的不育胞质资源已成为当今世界玉米雄
性不育育种的重要方向。华中农业大学玉米室近年来在用我国地方品种“巫溪”与美国群体
BSSSC9组配群体时, 发现雄性不育株, 将其不育胞质定名为WBM S, 经几年初步观察, 育性
稳定, 有研究价值。
本文一方面对玉米细胞质m tDNA R FL P 分类技术体系进行研究, 希望使该法更完善;
另一方面对新不育胞质WBM S、田间育性反应有疑问的801CM S 进行m tDNA R FL P 分类鉴
定, 为进一步应用提供依据。
表1　供试材料
Table 1　M ater ia ls
试材代号
No. of m aterial
试材名称
N am e of m aterial
细胞质型
Types of CM S
1 M o17CM S2WBM S64 待测
2 M o17CM S2WBM S62 待测
3 M o17CM S2T T 组
4 M o17 N 组
5 M o17CM S2EL C 组
6 M o17CM S2唐 S 组
7 801CM S 待测
8 801 N 组
1　材料与方法
1. 1　材料
供试材料共8份, 见表1。1～ 6号材料带
M o17核背景, 7、8号材料带801核背景。其中,
1、2号材料是带WBM S 胞质的姐妹系, 已回交
5代, 田间表现一级雄性不育。材料均由华中
农业大学玉米室提供。
1. 2　探针
选用前人报道与雄性不育有关的来自线粒
体DNA 的4个探针进行R FL P 分析[ 5, 10, 11 ] (见表2)。由华中农业大学作物遗传改良国家重点
实验室提供。
表2　用于 RFLP 分析的探针及克隆
Table 2　Probes and clones used for study RFLP
克隆
Clone
基因
Genes
来源
Source
插入片段 (kb)
Insert size (kb)
克隆位点
Insert ends
载体
V ector
选择标记
Selecting
pHJ22721 COX Ê 小麦 1. 7 B am H É pU C9 Amp r
pBcmH 3 油菜 1. 7 H indË pDPL 13 Amp r
atp 6 atp 6 玉米 2. 7 H indË pU C Amp r
B30 atp 9 大麦 1. 9 B am H É pU C9 Amp r
1. 3　方法
用上述材料暗培养出黄化苗约5g, 按 Saghai2M aroof 的CTAB 法[ 12 ]提取总DNA。各取约
7. 5 Λg 总DNA 用限制性内切酶 (B am H É、E coR É、H indË、P stÉ ) 消化, 在0. 8% 琼脂糖凝
胶上用20V 电压电泳过夜, 凝胶上的DNA 经变性后用 Southern 转移法转至N + 2尼龙膜上。
用32P 标记探针, 进行分子杂交, 得到放射自显影图。共进行了4个酶×4个探针= 16个酶ö
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探针组合的R FL P 分析。
2　结果与分析
2. 1　不同探针的 RFL P 结果比较
将玉米N、T、C、S 四种胞质m tDNA 的16个酶ö探针组合的R FL P 放射自显影结果整理
成表3。本实验所用的4个探针均可在不同程度上检测到四种胞质的m tDNA 多态性。B 30、
pBcmH 3检测的多态性最丰富, 在4种酶切下均可检测到四种胞质存在特异的DNA 带纹, 且
B 30的总带纹最少, 特异带清晰易辩认, 是较理想的细胞质分类探针。pHJ22721仅在B am H É
酶切下检测到四种胞质的特异带, 在其它酶切下只检测到部分胞质的特异带。有趣的是,
atp 6探针在4种酶切下的结果类似, 均是 T、C 胞质出现各自特异带, N、S 胞质带纹相同, 且
总带纹少 (见图1)。如果不考虑N 胞质, atp 6探针很易将 T、C、S 三种不育胞质分开。
图1　　B am H É öatp 6检测的玉米线粒体DNA
RFL P 图谱 (数字: 试材代号, M : 分子量标准)
F ig. 1　　RFL P patterns detected w ith B am H É ö
atp6 on m tDNA of m aize
(N um ber: No. of m aterial, M : M olecular w eigh t)
　　以上结果说明, 玉米不同类型细胞质的m tD 2
NA 间确实存在差异, 用 R FL P 技术可以检测出
这种差异。不同探针检测差异的效率不同, 这可
能与探针所在的基因对雄性不育性状所起的作用
有关。本试验中, B 30的检测效果最好, pBcmH 3
次之, pHJ22721仅在少数酶切下可区分出4种胞
质, atp 6只能分出 T、C 胞质。
2. 2　不同限制酶的 RFL P 分析效果比较
从表3可看出, 当限制酶改变时, 除 pHJ 22721
探针对N、T、C、S 四种胞质m tDNA 的R FL P 检
测结果有所改变外, 其它3个探针的检测结果几乎
不变, 即 pBcmH 3、B30在4种酶切下都可检测出
四种胞质的特异带, atp 6可检测出 T、C 胞质的特
异带, 只是 R FL P 带谱的多寡、特异带的大小有
所不同 (见图2、3)。说明当探针一定时, 限制酶的改变一般不会从根本上改变分析结
图2　　H indË öpBcmH 3检测的玉米线粒体DNA
RFL P 图谱 (数字: 试材代号, M : 分子量标准)
F ig. 2　　RFL P patterns detected w ith
H indË öpBcmH 3 on m tDNA of m aize
(N um ber: No. of m aterial, M : M olecular w eigh t)
图3　　E coRÉ öpBcmH 3检测的玉米线粒体DNA
RFL P 图谱 (数字: 试材代号, M : 分子量标准)
F ig. 3　RFL P patterns detected w ith E coRÉ ö
pBcmH 3 on m tDNA of m aize
(N um ber: No. of m aterial, M : M olecular w eigh t)
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果, 但会影响检测效果。在选择m tDNA R FL P 分类技术体系时, 探针的选择最关键, 酶次
之。可通过筛选合适的酶ö探针, 使分类效果更佳。
2. 3　不同酶ö探针的 RFL P 结果比较
本实验所用的16个酶ö探针组合中, 有9个能检测到玉米N、T、C、S 四种胞质m tDNA 间
的差异 (pBcmH 3、B 30分别与4种酶、pHJ 22721与B am H I 组合) , 其中, 总带纹较少, 特异带
较清楚易辩别、检测效果较好的有3个: P stÉ öB30、H indË öpBcmH 3、B am H É öpHJ22721 (见
图4、2、5)。它们检测出的N、T、C、S 胞质的特异带见表3。在这3个酶ö探针中, P stÉ öB30
的带纹最少、特异带最明显, 是首选的分类技术体系。
2. 4　W BM s、801CM S 的m tD NA RFL P 分析
同样方法分析了WBM s、801CM S 的 m tDNA R FL P。结果显示, 在16个酶ö探针下,
M o17CM S2WBM s64、M o17CM S2WBM s62 与 M o17CM S2唐的 R FL P 带纹几乎完全相同,
801CM S 与M o17CM S2EL 的带纹相同 (见图1- 5)。如图4中, M o172WBM s64、M o17CM S2
WBM s62、M o17CM S2唐都出现15kb 和4. 0 kb 带纹, 801CM S 与M o17CM S2EL 出现20kb 和
510kb 的带纹。表明WBM s 胞质与唐胞质很类似, 属 S 组, 801CM S 胞质属C 组。
图4　　P stÉ öB30检测的玉米线粒体DNA RFL P
图谱 (数字: 试材代号, M : 分子量标准)
F ig. 4　　RFL P patterns detected w ith
P stÉ öB30 on m tDNA of m aize
(N um ber: No. of m aterial, M : M olecular w eigh t)
图5　　B am H É öpHJ22721检测的玉米线粒体DNA
RFL P 图谱 (数字: 试材代号, M : 分子量标准)
F ig. 5　　RFL P patterns detected w ith
B am H É öpHJ22721 on m tDNA of m aize
(N um ber: No. of m aterial, M : M olecular w eigh t)
2. 5　细胞质组内m tD NA RFL P 分析
本文在 E coR É öpBcmH 3、P stÉ öB 30两个酶ö探针下检测到801与M o17两种N 胞质的
R FL P 带纹有所不同。图3中801比M o17多一条3. 7 kb 带纹, 图4中801比M o17多一条17. 4 kb
带纹, 而801 CM S 与M o17CM S2EL 的带纹完全相同, 说明801与M o17的这种差异不是来自
核背景, 而是源于细胞质。由此可推测, 这两个酶ö探针组合可以检测到不同来源的N 胞质
间的差异, 为用m tDNA R FL P 技术进行胞质亚组分类提供了证据。
3　讨论与结论
3. 1　玉米细胞质m tD NA 分类技术探讨
目前, 可通过R EFA、R FL P、RA PD 等技术分析m tDNA 对玉米细胞质进行分类。R E2
FA 技术需大量的m tDNA ; 用限制酶酶切后电泳的带纹繁多, 难以辩认[ 3, 4 ]。RA PD 技术需
高质量的m tDNA ; 反应结果易受反应条件、DNA 质量及不明因素的影响, 稳定性差[ 5、6 ]。
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R FL P 技术只需用3～ 5g 黄化苗提取总DNA , 避免了用大量黄化苗和复杂的方法抽提m tD 2
NA 的麻烦; 反应结果稳定, 重复性好; 带纹少、清晰、易辩认; 速度较快 (分析周期约15～ 20
天) , 是当今应用较多、较好的m tDNA 分类技术[ 5, 7～ 8 ]。
P ring (1987)、Sisco (1985) 曾进行过玉米的胞质m tDNA R FL P 分类技术研究[ 7, 8 ]。1997
年, 韦桂旺[ 5 ]用44个酶ö探针对该技术进行了较详尽地研究, 证明该分类结果与大田育性鉴定
基本一致, 选出B am H É öpHJ 22721作为该分类方法的技术体系。在应用中只用一个技术体系
似乎缺乏说服力, 结果不能相互验证。
本实验在前人基础上进一步对m tDNA R FL P 分类技术进行了研究, 证明选用合适的酶ö
探针可以用该法将玉米细胞质类型分开。在选择技术体系时, 探针选择是主要的, 酶次之。
本文增选 P stÉ öB30、H indË öpBcmH 3两个酶ö探针作m tDNA R FL P 分类的技术体系, 为用
m tDNA R FL P 鉴定玉米细胞质类型提供了更多的可供选择的方法, 且检测结果可以相互验
证。至今, 已有3套酶ö探针技术体系可供选择, 使m tDNA R FL P 分类技术日臻完善。
迄今还未找到可靠的细胞质亚组分类方法, 本实验发现801与M o17 m tDNA 间存在
R FL P, 说明有可能通过m tDNA R FL P 技术对玉米细胞质进行亚组分类, 具体方法有待研
究。
3. 2　W BM S 的类型
从本实验结果看, 新发现的WBM S 胞质属 S 组, 但因本实验仅选用一个 S 组胞质作对
照, WBM S 与其它 S 组胞质有无异同, 属何亚组尚有待进一步研究。
参　考　文　献
1　刘纪麟主编1 玉米育种学1 北京: 农业出版社, 1991, 384～ 388
2　Beckett J B. C rop S cience , 1971, 11: 724～ 726
3　L evings C SË . P roceed ings of the 31st A nnual Corn and S orghum R esearch Conf erence, 1976, 110
4　谢友菊, 戴景瑞1 遗传学报, 1988, 15 (5) : 335～ 338
5　韦桂旺, 郑用琏, 张德华1 遗传学报, 1997, 24 (1) : 66～ 77
6　汪志纯1 中国农业科学, 1997, 30 (4) : 45～ 49
7　P ring D R. TA G , 1987, 73: 646
8　Sisco D R. TA G , 1985, 71: 5～ 19
9　刘克明, 苏海1 中国农业科学, 1991, 24 (4) : 58～ 60
10　Dew ey R C1 Cell, 1986, 44: 439～ 449
11　Dew ey R C, D H T imothy, C SË L evings. Current Genetics , 1991, 20: 475～ 482
12　Saghai2M aroof M A. P. N . A . S USA , 1984, 81: 8014～ 8018
1844期　　　　　　　　　李小琴等: 玉米细胞质线粒体DNA 　R FL P 分类研究