全 文 ：第 28 卷 第 6 期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 6
2002 年 11 月　 857～ 860 页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 857～ 860　N ov. , 2002
利用B t 基因和Xa21 基因转化获得抗螟虫、白叶枯病的转基因水稻Ξ
王爱菊1, 3 　姚方印2, 3 　温孚江1, 3 3 　朱常香1　李广贤2　杨　磊2　朱其松2
张洪瑞2
(1山东农业大学生命科学学院, 山东泰安 271018; 2 山东省水稻研究所, 山东济宁 272017)
摘　要　利用水稻的愈伤组织作受体, 采用 P IG 基因枪法, 首先成功地将B t 基因[cry IA (b) ]连同抗除草剂 bar 基因导
入栽培水稻品种中国 91, 选育出纯合稳定的株系 T 91 系。然后将 T 91 系与黄淮区主栽品种豫粳 6 号杂交, 并辅以标记
基因选择, 选育出纯合稳定、综合性状优良的转B t 基因株系C48。利用农杆菌介导的转化系统将 X a21 基因转入C48,
根据标记基因测定, 转基因植株的 PCR 和 Southern 分析, 田间抗病虫性鉴定, 获得了双抗 (螟虫、白叶枯病) 转基因水
稻。
关键词　水稻; 遗传转化; 基因枪; cry IA (b)基因; X a21 基因
中图分类号: S511　　　文献标识码: A
Obta in ing of Tran sgen ic R ice Plan ts Resistan t to both Stem Borer and Bacter ia l
bl ight D isea se from B t and X a21 Genes Tran sform ing
WAN G A i2Ju1, 3 　YAO Fang2Yin2, 3 　W EN Fu2J iang1, 3 3 　ZHU Chang2X iang1　L I Guang2X ian2
YAN G L ei2　ZHU Q i2Song2　ZHAN G Hong2R ui2
(1 College of L if e S ciences, S hand ong A g ricultural U niversity , T aian, S hand ong 271018; 2 S hand ong R ice R esearch Institu te, J ining , S hand ong
272017, China)
Abstract　U sing rice calli as exp lan ts, a p lasm id pBW 3 con tain ing cry IA (b) gene and bar gene w as transferred
in to the rice variety Zhongguo 91 w ith P IG gene gun m ethod, and a line nam ed T 91 w h ich w as homozygous to
cry IA (b) and bar genesw as then developed. T he cry IA (b) gene w as inherited stably in to the p rogen ies of the
transgen ic rice. A rice line C48 w h ich show ed ideal agronom ic traitsw as developed by crossing T 91 w ith a culti2
vated variety Yujing 6 fo llow ed by molecular m arker- assisted selection. T he X a21 gene, w h ich confers resis2
tance to bacterial bligh t disease, w as then in troduced in to C48 line via the A grobacterium 2m ediated transfo rm a2
tion system. T ransgen ic rice p lan ts con tain ing bo th cry IA (b) gene and X a21 gene w ere obtained. B io logical
tests show ed that the transgen ic rice w as resistan t to bo th stem borer and bacterial bligh t disease.
Key words　R ice; Genetic transfo rm ation; P IG gene gun; cry IA (b) gene; X a21 gene
　　水稻白叶枯病是我国水稻三大病害之一, 造成
水稻产量的巨大损失。同时, 每年水稻因鳞翅目害
虫而造成的损失就达 1000 万吨[ 1 ]。化学农药对防
治病虫害起着十分重要的作用, 但随着时间的推
移, 农药的残毒、环境污染以及害虫抗药性等问题
日益突出。培育高产、优质品种的同时, 加强对病
虫害的抗性是十分重要的课题。
由于水稻本身没有足够抗虫水平的基因, 因而
抗虫育种工作进展缓慢, 近几年兴起的基因工程为
水稻抗虫育种提供了强有力的手段。B t 毒蛋白基
因 (B acillus thu ring iensis in secticidal crystal p ro tein
gene) 是目前使用最广泛的抗虫基因, 用转基因的
方法将 B t 基因导入水稻可使水稻对螟虫表现高
抗[ 2～ 4 ]。来自野生稻已被克隆的抗白叶枯病 X a21Ξ 基金项目: 国家转基因植物研究与产业化专项资助项目 (J992B2018)。　　3 前两位作者对本研究有同等重要的贡献。
作者简介: 王爱菊, 女, 1978 年出生, 硕士研究生。　　3 3 通讯联系作者。
Received on (收稿日期) : 2001212221, A ccep ted on (接受日期) : 2002203221

基因已导入水稻, 提高了抗性[ 5～ 8 ]。但是至今尚未
见有双抗 (螟虫、白叶枯病) 转基因水稻。本研究旨
在利用 X a21 和B t 基因培育出可供生产上推广利
用的双抗水稻新品种。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　植物材料　　供试的水稻品种为不抗白叶
枯病和螟虫的两个粳稻品种中国 91 和豫粳 6 号。
中国 91 为 20 世纪 90 年代初黄淮区推广品种, 豫
粳 6 号为目前黄淮区主栽品种。
1. 1. 2　农杆菌菌株及表达载体质粒　　菌株
EHA 105, 含有 pCXK1301 质粒, 由中国科学院遗
传研究所翟文学先生惠赠。质粒 pCXK1301 含有
hp t 基因, 抗白叶枯病 X a21 基因和 GU S 基因。质
粒 pBW 3 含有 A ctin 启动子, cry IA (b) 和 bar 基
因[ 2 ]。
1. 1. 3　供试的白叶枯菌系　　中国 7 型白叶枯致
病菌系C1～C7, 有中国水稻研究所提供。
1. 2　方法
1. 2. 1　转基因植株的获得　　采用基因枪法和农
杆菌介导转化法, 转化水稻胚性愈伤组织, 经选
择、再生后, 获得转基因植株。具体转化方法和再
生过程见文献[ 2, 9, 10 ]。
1. 2. 2　GU S 活性的组织化学染色检测　　将待检
测的样品浸入 X2Gluc 染色液 (100 mmolöL 磷酸钠
缓冲液, 10 mmolöL ED TA , 1 mmolöL X2Gluc,
0. 1% T riton2100) 中, 37℃保温 8～ 24h, 观察染色
情况。
1. 2. 3　转基因水稻的除草剂抗性鉴定　　转基因
水稻待长至 20 cm 左右时, 进行除草剂Basta (有效
成分 PPT )抗性检测。PPT 浓度为 1 göL , 涂抹于植
株的叶片上, 3 天后, 调查抗性株数及敏感株数。
1. 2. 4　白叶枯病抗性分析　　在孕穗期用剪叶法
接种致病菌系 C1～ C7, 菌液浓度为 109 个细菌ö
mL ; 每菌系接种 5 片叶, 用剪刀蘸菌液从叶尖剪去
2～ 3 cm , 20 天后调查发病情况。
1. 2. 5　转基因植株的分子分析　　DNA 的提取与
纯化, Southern 杂交程序参照《分子克隆》手册[ 11 ]。
探针的合成, 以B t 基因的编码区段 (2. 2 kb) 为模
板, 采用随机引物法 (p rom ega 试剂盒) 合成, 用
[a2P32 ]dCT P 进行标记。
X a21 基因的检测采用 PCR 方法。根据 X a21
序列设计了特异扩增引物 P1 和 P2。引物序列如下:
P15′2A T T GAA TAA T TCA CT GGGTA T T GG,
P25′2GTCT T GCCT T GCA CT TCT GCA CGA。 PCR
扩增反应按下列方法进行: 94℃预变性 5 m in ,
94℃变性 1 m in, 56℃复性 1 m in, 72℃延伸 2 m in,
共 35 个循环。PCR 结束后, 产物进行 1% 琼脂糖电
泳检测。
2　结果与分析
2. 1　B t 转基因植株的获得
用 P IG 基因枪轰击中国 91 水稻的愈伤组织
(图A ) , 在 14 m göL PPT 条件下筛选获得抗性愈
伤组织 (图B ) , 经分化培养后, 获得了含B t 基因和
bar 基因的转基因水稻。遗传分析表明B t 基因和
bar 基因连锁遗传[ 2 ]。根据除草剂抗性鉴定 (图C) ,
抗螟虫性检测, 共获得 3 个综合性状优良的株系,
定名为 T 91 系, 目前已稳定遗传至第 9 代, 田间表
现良好的抗除草剂和抗螟虫性能。但是转基因株系
结实率降低, 产量不高, 诱导的愈伤组织质量较
差, 不适于作受体, 直接用于 X a21 基因的转化。
因此, 将 T 91 系与黄淮稻区主栽品种豫粳 6 号杂
交, 杂交后代根据标记基因 (bar)选择, 获得了大量
B t 基因和 bar 基因仍稳定连锁遗传的转基因植株。
其中一个株系的田间综合性状优良, 产量高于双
亲, 根据南繁编号, 定名为C48。
2. 2　双抗转基因水稻的获得及分子分析
用农杆菌介导转化法, 将 X a21 基因转入了
C48 的愈伤组织, 经选择培养, 植株再生, 最终获
得 67 株 T 0 代转基因苗。根据标记基因选择, 获得
了农艺性状优良的 T 2 代株系 5 个, 分别定名为
BX1～BX 5。
以B t 抗虫基因的DNA 片段 (2. 2 kb) 为探针,
双抗转基因植株DNA 经H indË 酶切 (单酶切位点)
或H indË + Sm aÉ (双酶切) 后, 进行 Southern 杂
交。杂交结果 (图D、E) 显示, 经 H indË 酶切的转
基因植株均出现一条约 12. 2 kb 的杂交条带, 经
H indË + Sm aÉ 双酶切的转基因植株均出现一条约
2. 2 kb 的杂交条带, 而非转基因植株未出现任何杂
交条带, 表明所获得的转基因植株中B t 基因是完
整的单拷贝形式整合于水稻的基因组中。
为了研究 X a21 基因受体基因组的整合情况,
对双抗转基因植株进行了 PCR 分析, 图 F 显示了
部分转基因植株的检测结果。转基因植株经引物 P1
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和 P2 扩增后均产生一条约 1. 4 kb 的特异扩增带,
而对照没有相应的扩增带, 证明了 X a21 基因已整
合到受体基因组中。
2. 3　双抗转基因植株的抗虫性及抗病性鉴定
在室内用转基因的水稻和未转基因的水稻幼嫩
叶片饲喂水稻二化螟。未转基因水稻饲喂的二化
螟, 虫体生长粗壮; 转基因水稻饲喂的二化螟, 生
长非常缓慢且瘦弱。田间抗虫性调查显示, 在 8 月
5 号稻纵卷叶螟大发生期, 转基因水稻几乎没有受
到卷叶螟的危害, 而对照遭受严重危害, 剑叶和倒
二叶花白一片。在 9 月 15 日调查由于螟虫危害而
引起白穗的情况 (图 G) , 对照品种中国 91 受害十
分严重, 白穗率高达 50% , 而转基因水稻的白穗率
低于 1%。
对双抗转基因植株抗病性检测结果显示, 转基
因植株高度抗水稻白叶枯病菌, 接种的转基因植株
叶片病斑面积小于整个叶片的 5% (表 1)。
2. 4　外源基因在转基因植株后代中的遗传
B t 转基因纯合稳定单株与不同的常规粳稻品
种进行杂交, 根据Basta 抗性表现, 在BC1 分离群
体中符合 1∶1 分离, 在 F 2 分离群体中符合 3∶1
分离 (表 2) , 证明了B t 基因是以单显性位点整合,
遵循孟德尔分离规律。
表 1　　不同水稻株系对白叶枯菌系的抗性表现
Table 1　　Resistance reaction of different r ice l ines to seven stra ins of Xanthom onas oryzae pv. oryzae
品种 (株系)
Cultivar
(L ine)
病斑面积　L esion area (% )
菌系 Strains
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7
平均
A verage
　
病级
L esion
scoring
抗病性
Resistance
reaction
中国 91 37. 82 15. 67 24. 12 40. 75 22. 61 7. 23 18. 34 23. 79 6 感 (S)
1 4. 67 5. 21 3. 22 4. 99 2. 38 2. 01 2. 23 3. 53 1 抗 (R)
2 5. 21 3. 22 4. 99 2. 38 2. 01 2. 23 3. 50 3. 36 1 抗 (R)
3 6. 32 5. 28 3. 63 4. 92 2. 17 1. 05 3. 29 3. 81 1 抗 (R)
4 6. 23 5. 61 2. 98 4. 52 2. 72 1. 92 3. 76 3. 96 1 抗 (R)
5 6. 73 5. 80 3. 25 5. 09 2. 45 1. 64 3. 90 4. 12 1 抗 (R)
　　注: 1 至 5 为 T 2 代转 X a21 基因水稻阳性植株
　　Note: 1 to 5 indicate X a21 transgenic rice positive p lants in T 2 population
表 2　　B t 水稻杂交后代 Basta 阳性株与阴性株的分离比
Table 2　　Segregation ratio of Basta positive and negative plants in the progen ies of B t r ice
crossed to r ice var ieties cultivated in Huanghua i area
组合
Cross
　
世代
Generation
　
抗性株数
No. of resistant
p lants
敏感株数
No. of suscep tibility
p lants
期望比例
Ratio of expected
segregation
ς2C
圣稻 301öT 91 BC1 110 125 1∶1 0. 958
Shangdao301öT 91 F2 732 237 3∶1 0. 152
豫粳 6öT 91 BC1 128 132 1∶1 0. 726
Yujing6öT 91 F2 816 285 3∶1 1. 459
　　df= 1, ς2(0. 05) = 3. 841.
表 3　　T1 水稻单株 GUS 染色分离比
Table 3　　Segregation ratio of GUS sta in ing in progen ies of different T1 transgen ic r ice l ines
材料
M aterial
　
世代
Generation
　
阳性株数
GU S positive
p lants
阴性株数
GU S negative
p lants
期望比例
Ratio of expected
segregation
ς2C
1 T 1 321 122 3∶1 1. 491
2 T 1 345 109 3∶1 0. 238
3 T 1 357 128 3∶1 0. 501
4 T 1 342 108 3∶1 0. 240
　　df= 1, ς2(0. 05) = 3. 841.
　　对来自 4 个 X a21 转基因系的 T 1 代单株进行
GU S 检测, 统计 GU S 染色的阴阳性植株数, 经卡
方测验证明其分离比例为 3∶1, 证明了 X a21 基因
是以单显性整合的。
3　讨论
利用转基因技术将B t 基因或 X a21 基因导入
水稻提高抗虫或抗病性已有成功报道[ 2～ 8 ]。但是,
9586 期　　　　　　　　王爱菊等: 利用B t 基因和 X a21 基因转化获得抗螟虫、白叶枯病的转基因水稻　　　　　　　　　　

理想的水稻品种要求抗病抗虫。因此把抗病和抗虫
基因聚合到同一遗传背景并培育出可供生产上利用
的双抗水稻新品种是本研究解决的关键问题。将几
个抗性基因导入同一植株中有几种方式, 其中先将
一个基因导入植物, 然后转入另一基因。由于受体
中国 91 经组培和转化, 结实率降低, 并且转B t 基
因的中国 91 诱导的愈伤组织质量太差, 很难进行
转化。利用转B t 基因的水稻中国 91 与生产上推广
品种杂交, 根据标记基因选择, 获得了纯合稳定,
综合性状优良的转B t 基因水稻株系, 并以此为受
体, 进行 X a21 基因的转化, 获得了双抗转基因水
稻植株。同时, 对已获得的单抗转基因水稻 (含B t
基因或 X a21 基因) , 通过有性杂交的方法聚合B t
基因和 X a21 基因的研究也在进行中。
转基因水稻成功运用取决于外源基因在植物体
中保持遗传的稳定性, 有的报道证明转基因作物的
外源基因能够保持遗传的稳定性, 有的试验证明外
源基因在遗传传递中是不稳定的[ 12 ]。本研究发现转
B t 基因纯合稳定水稻已稳定遗传至第 9 代, 并且连
续 3 年分单株种植转B t 基因株系 100 余个, 根据
Basta 检测, 没有发现基因沉默现象, 并且Basta 阳
性株与抗螟虫是协同表达的。为了证明外源基因的
遗传模式, 我们利用B t 转基因纯合稳定株系与常
规品种杂交, 根据Basta 抗性检测结果, B t 基因在
BC1 分离群体中符合 1∶1 分离, 在 F 2 分离群体中
符合 3∶1 分离, 证明B t 基因是以单显性整合遵循
孟德尔分离规律。同时根据 X a21 基因的 T 1 代
GU S 检测结果, 证明 X a21 基因也是以单位点显性
基因方式遗传。上述结果表明, 通过有性杂交及转
基因技术相结合聚合外源基因培育抗病虫水稻是切
实可行的。
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图　版　说　明
A. 成熟种胚愈伤组织诱导。　B. 抗性愈伤组织筛选。　C. T 0 代转基因苗除草剂 (Basta)抗性鉴定。　D、E. 分别为H indË 单酶切
和 H indË + Sm aÉ 双酶切B t 转基因水稻的 Southern 杂交分析。　1: 阳性对照, 　2～ 5: 来自BX1 株系转基因植株, 　6～ 9: 来自BX2 株系
转基因植株, 　10～ 13: 来自BX3 株系转基因植株, 　14～ 17: 来自BX4 株系转基因植株, 　18～ 21: 来自XB 5 株系转基因植株, 　22: 阴
性对照。　F. T 2 代X a21 转基因水稻的 PCR 分析, 　1. M arker DL 2000, 　2. 阳性对照, 　3. 阴性对照, 　4. 4～ 10 阳性植株。G. 转B t 基
因水稻和对照中国 91 田间抗虫情况, 左: 转基因水稻, 右: 对照。
Explana tion of pla te
A. Calli induced from m ature em bryo of rice. 　B. Resistant calli selected w ith PPT. 　C. Basta resistant detection in T 0 transgenic p lants.
　D、E: Southern blo t analysis of transgenic p lants genom ic DNA , digested w ith H indË and H indË + Sm aÉ . 　1: Positive contro l. 　2～ 5:
T ransgenic p lants DNA from BX1 p rogeny. 　6～ 9: T ransgenic p lants DNA from BX2 p rogeny. 　10～ 13: T ransgenic p lants DNA from BX3
p rogeny. 　14～ 17: T ransgenic p lants DNA from BX4 p rogeny. 　18～ 21: T ransgenic p lants DNA from BX5 p rogeny. 　22. N egative contro l.
F. PCR analysis of transgenic rice p lants for X a21 gene. 　1: M arker DL 2000. 　2: Positive contro l. 　3: N egative contro l. 　4: 4～ 10 positive
p lants. G. F ield resistance of B t transgenic rice and un2transfom ed rice Zhongguo91 to stem borer. L eft: B t transgenic rice p lants, R igh t: Con2
tro l.
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