全 文 ：Vol. 30 , No. 9
pp. 912 - 915 　Sept. , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 9 期
2004 年 9 月 　912～915 页
小麦光敏雄性不育基因的遗传分析及 RAPD 标记
马翎健　何蓓如　宋喜悦　胡银岗
(西北农林科技大学农学院 ,陕西杨凌 712100)
摘 　要 　通过对小麦光敏雄性不育系 A31 与恢复系 1376 杂交所得的 F2 分离群体育性的分析研究表明 ,F2 分离群体共
582 株的平均结实率为 42116 % ,变异范围为 0～86167 % ,由于受异源胞质的影响 ,F2 群体中可育株平均自交结实率低于
恢复系 1376 的平均结实率。经卡方测验表明 ,F2 群体的育性分离符合一对基因的分离比例 ,所以 ,A31 光敏育性可能由
一对基因控制。以光敏雄性不育系 A31 与其恢复系 1376 杂交所得的 F2 分离群体为材料 ,按 F2 单株的育性分群 ,建立可
育 DNA 池和不育 DNA 池 ,分别以其为模板进行 RAPD 分析 ,用 102base 随机引物进行多态性引物筛选。从 147 供试引物
中筛选出 2 个引物在不育群体和可育群体间扩增出多态性产物。经过进一步对 F2 分离群体的单株检测 ,其中的一个引
物 (S1106)扩增出了得到重复验证和可靠的多态性扩增产物 ,它是与小麦 A31 光敏雄性不育基因连锁的 ,可作为 A31 光
敏不育基因的连锁标记。
关键词 　小麦 ;光敏基因 ;遗传 ;RAPD ;分子标记
中图分类号 : S512
Heredity and RAPD Markers Analysis of Wheat Photoperiod2sensitive Male Sterile
Gene
MA Ling2Jian ,HE Pei2Ru ,SONG Xi2Yue ,HU Yin2Gang
( College of Agronomy , Northwest Sci2Tech University of Agriculture and Forestry , Yangling 712100 , Shaanxi , China)
Abstract 　The fertility of F2 segregating population from the cross A31 ×1376 was studied , and showed that the average
rate of fructification was 42116 % in the segregating populations with a total of 582 plants , the range of variation was 0 -
86167 %1 Through chi2square tests of fertility in F2 segregating population , the proportion of complete sterile plants to fertile
plants was coincided with 3∶1 , so the photo2sensitive fertility might be controlled mainly by a pair of genes1 Bulked DNA
from F2 segregating population of the cross A31 ×1376 were used for RAPD analysis , 147 primers were used for the detec2
tion of polymorphism , two of which had polymorphic amplification products from fertile and sterile populations1 RAPD anal2
ysis of the parents and individuals of F2 segregating population with one primer (S1106) identified the truthfulness and relia2
bility of the polymorphic amplification product1 It suggested that this amplified product was linked with the photoperiod2sen2
sitive male sterile gene , and could be as a linked marker of wheat photoperiod2sensitive male sterile gene1
Key words 　Wheat ;Photoperiod2sensitive male sterile gene ; Genetic ;RAPD ;Molecular marker
　　在作物杂优利用中 ,利用光温敏雄性不育系具
有无需保持系、恢复系多、繁制种术简便、较易选配
出优良的杂交组合等优点 ,在作物杂优利用中占有
十分重要的地位 ,我国杂交水稻两系育种已经取得
重大突破。Sasakuma 等[1 ]在研究小麦核质互作不育
时 ,发现 D2 类细胞质的核代换系具有光温敏特性。
Murai K和 Tsunewaki [2 ,3 ]创造了许多具粗厚山羊草
(Ae1 crassa) 细胞质的不育系 ,称其为“光周期敏感 雄性 不 育”( Photoperiod2sensitive Cytoplasmic MaleSterility ,简称 PCMS) ,并对其遗传特性及恢复等进行了研究。国内外许多学者对 PCMS 小麦的育性表现、育性转换规律、花粉败育特点等进行了研究[4～7 ] 。但对小麦 PCMS基因至今所知甚少。如果能对小麦 PCMS 基因在分子水平上有深入了解 ,不仅对阐明雄性不育机理有重要的理论意义 ,而且对小麦杂种优势利用也将起到重大的推动作用。
繱基金项目 :国家“863”计划项目 (2001AA241043)和陕西省自然科学基金 (2001Sm02)资助项目。
作者简介 :马翎健 (1967 - ) ,男 ,副教授 ,博士 ,主要从事小麦雄性不育和杂种优势利用研究。Tel : 02927036187 　E2mail : malingjian @
1631net
Received(收稿日期) :2003204216 ,Accepted (接受日期) :20032102111

要定位和分离 PCMS 小麦基因 ,首要的是找到
与该基因连锁的分子标记。RAPD 技术[8 ]由于其简
便、快速、经济、有效而迅速被应用于许多作物。利
用该技术已经获得了水稻的光敏雄性不育基因的分
子标记[9 ] 。RAPD 在小麦的遗传图谱构建、标记和
定位目的基因、鉴定品种、种质资源鉴定、杂种优势
预测等方面得到了广泛有效的应用[10～13 ] ,但是 ,利
用此技术对小麦光敏雄性不育基因进行研究 ,尚未
见报道。迄今为止还没有找到与小麦光敏雄性不育
基因连锁的分子标记 ,若找到了 ,就可以进行基因的
定位和分离 ,进而通过生物技术方法创造和选育更
多、更好的小麦光敏雄性不育材料。
1 　材料与方法
111 　试验材料
　　试验材料为西北农林科技大学杂交小麦研究课
题组选育的小麦光周期敏感雄性不育系 A31 ,恢复
系 1376 ,及 A31 ×1376 的 F2 分离群体。
112 　试验方法
11211 　田间试验实施方案
1999 年夏 ,A31 去雄套袋 30 穗 ,用恢复系 1376
授粉 ,收得 F1 种子 ; F1 种子 1999 年在杨凌正常秋
播 ,2000 年夏套袋 100 穗自交 ,收得 F2 种子 ;2001 年
F2 种子及其亲本 A31、1376 同时在甘肃武威甜菜研
究所试验田春播 (4 月 23) ,抽穗后扬花前 (6 月中下
旬) ,单株编号套袋 ,调查花粉育性及结实率 (国
内法) 。
11212 　室内试验
1121211 　DNA 的提取 　　在田间调查育性的基础
上 ,对 A31 ×1376 F2 群体中的不育株和可育株各随
机选取 50 株 ,采用 CTAB 法[14 ]提取总 DNA。
1121212 　RAPD 分析方法 　　(1) 反应样品制备 :在
所提取单株 DNA 中 ,通过花粉育性鉴定及结实率调
查 ,选取完全不育株、高度可育株各 20 株 ,用澳大利
亚 GBS 科学仪器公司的 CINTRA4 型分光光度计检
测 DNA 浓度 ,并将样品稀释至 5 ng/μL。RAPD 分析
前 ,分别将 DNA 质量好的 15 株不育株和可育株以
等体积混合 ,产生不育池和可育池。(2) 反应体系 :
PCR 反应总体积为 25μL ,模板DNA 25 ng ,10 ×buffer
215 μL ( 100 mmol/ L Tris2HCl , pH 910 ; 500 mmol/ L
KCl , 110 % Triton X2100) , 25 mmol/ L MgCl2 210μL
(终浓度 210 mmol/ L) ,215 mmol/ L dNTP 各 1μL (终
浓度 011 mmol/ L) ,引物 012μmol/ L , Taq 酶 110 U。
(3)反应程序 :DNA 扩增在美国 MGREACHE 公司的
PTC2200 型 PCR 仪上进行 ,94 ℃预变性 5 min ,然后
进行 94 ℃45 s ,36 ℃45 s ,72 ℃90 min ,45 个循环后 ,
再在 72 ℃延伸 10 min。扩增完成后 4 ℃保存。(4)
引物及试剂 :供试的 147 个随机引物购自上海生工
生物工程公司 ;其他药品试剂均购自华美生物公司。
(5)结果分析 :每次同时用 A31 (B 亲) 、1376 (R 亲) 以
及不育池 (B 混) 、可育池 (R 混)为模板 ,进行 PCR 扩
增 ,电泳结果通过凝胶成像仪扫描照相、检测。发现
特异带后进行单株验证。
2 　结果与分析
211 　A31 及 F2 分离群体的育性表现
　　A31 在武威生态点 4 月上旬播种已接近完全雄
性不育 (结实率 0175 %) 。本实验通过推迟播种 ,使
A31 光周期敏感时期 (小穗原基分化期 ———四分体
期)恰逢实验当地日长达 A31 育性转换的临界值 ,
结实率为 0 (表 1) 。实验中 ,恢复系 1376 平均结实
率 86130 % ,变异范围 68175 %～93175 %。F2 分离群
体共 582 株的平均结实率为 42116 % ,变异范围为
0～86167 %(表 1) 。如果光敏雄性育性是由 1 对基
因控制 ,在 F2 群体的 582 株中 ,理论上完全不育株
和可育株应分别为 14515 株和 43615 株 ,而实际调
查结果分别为 129 株和 453 株。利用χ2 测验法对
A31 光敏不育基因的遗传进行适合性测验 (表 2) ,
χ2C = 3152 <χ20105M1 (3184) ,说明 F2 中育性表现符合
一对基因的分离比例 ,A31 光敏雄性不育性可能是
由一对基因控制的。F2 群体可育株结实率变异范
围很大 ,其平均结实率仅为 51174 % ,远低于可育亲
本 1376 的平均结实率 (86130 %) 。
表 1 A31 及其 F2 分离群体的自交结实率
Table 1 The mean fertility of A31 and F2 segregating population
材料
Material
平均自交结实率
Mean of fertility
变异范围
Variation
range
调查数量
(株)
No1 of plant
A31 0 0 50
1376 86130 68175 - 93175 50
F2 42116 0 - 86167 582
表 2 F2 分离群体育性表现的卡方测验
Table 2 Chi2square tests of feritility in F2 segregating population
完全不育株
Completely
sterile plants
可育株
Fertile plants
总数
Total
F2 代实际株数 (O)
Observed number 129 453 582
理论株数 ( E)
Theoretical number 14515 43615 582
O2E - 1615 + 1615 0
χ2C 1176 1176 3152
319　9 期 马翎健等 :小麦光敏雄性不育基因的遗传分析及 RAPD 标记 　　　

212 　RAPD 分析
21211 　引物的筛选 　　同时以 R 亲、R 混、B 亲、B
混为模板 ,用供试的 147 个引物进行扩增。在 147
个引物中 ,有 16 个引物无扩增产物 ,说明模板 DNA
上无这些引物的特异结合位点 ;112 个引物在不育
群体和可育群体间都扩增出了条带清晰的图谱 ,且
重复性好 ,但大部分引物没有多态性。扩增产物一
般在 4～9 条 ,最多 13 条 ,分子量从 300～2 500 bp。
21212 　F2 分离群体 RAPD 扩增差异性分析 　　在
筛选的引物中 ,通过不育群体 (B 混) 与可育群体 (R
混) 扩增条带差异性分析 ,有 17 个引物在两扩增图
谱间存在差异。为了使特异条带更具有可靠性和真
实性 ,对有差异的 17 个引物同时用 B 亲、B 混、R
亲、R 混为模板进行再筛选。在筛选中注重几个方
面 : (1)扩增条带重复性较好。(2) 扩增条带在 4～9
条之间。因为条带太少 ,说明引物和模板的结合位
点较少 ,对基因组的扩增不完全 ;条带太多可能有非
特异性扩增产物出现 ,也不利于以后进行克隆测序
等其他分析。(3) 扩增图谱中条带差异应是 B 亲和
B 混与 R 亲和 R 混之间的共同差异。
经过重复筛选表明 ,只有两个引物 S222 (序列
为 AGTCACTCCC) 、S1106 (序列为 CTCGGGATGT) 的
扩增图谱具有稳定、可靠的多态性差异。S222 在 B
亲 (A31)和 B 混的扩增产物中都出现了一条分子量
在 550 bp 左右的特异片段 ,而可育亲本 R 亲 (1376)
和 R 混的扩增产物中都没有该片段 (图 1) ;引物
S1106 在 B 亲和 B 混的扩增产物中有一条 400 bp 左
右的特异片段 (图 2) 。
图 1 引物 S222 扩增的 RAPD 图谱
Fig11 The RAPD pattern amplified by primer S222
M:PCR marker ;1 :B 亲 (A31) ;2 :B 混 (不育池) ;
3 :R 混 (可育池) ;4 :为 R 亲 (1376) 。
M:PCR marker ;1 :Sterile line ;2 :Sterility DNA pool ;
3 :Fertility DNA pool ;4 :Restoring line (1376) 1
图 2 引物 S1106 扩增的 RAPD 图谱
Fig12 The RAPD pattern amplified by primer S1106
M:PCR marker ;1 :B 亲 (A31) ;2 :B 混 (不育池) ;
3 :R 混 (可育池) ;4 :为 R 亲 (1376) 。
M:PCR marker ;1 :Sterile line ;2 :Sterility DNA pool ;
3 :Fertility DNA pool ; 4 :Restoring line (1376) 1
图 3 引物 S1106 单株扩增的 RAPD 图谱
Fig13 The RAPD pattern amplified of individual2plant by primer S1106
M:PCR marker ;1～5 :不育单株 ;6～10 :可育单株。
M:PCR marker ;1 - 5 :Sterile individual2plant ;6 - 10 :Fertile individual2plant .
419 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

21213 　F2 分离群体中各个体 RAPD 分析 　　用筛
选出的存在特异性扩增条带的两个引物 ,对 F2 分离
群体中的不同个体进行 RAPD 分析 ,以验证特异条
带的真实性。经多次重复实验表明 ,引物 S222 在供
试的 F2 不育后代个体中 550 bp 特异条带验证效果
不理想 ,重复性差 ,不能作为稳定可靠的连锁标记。
　　引物 S1106 在供试的 15 个 F2 不育后代个体中
都能扩增到分子量为 400 bp 左右的特异条带 ,而在
可育后代个体中都没有扩增到该片段 ,且重复性较
好 (图 3) 。因此 ,可将引物 S1106 扩增出的多态性产
物 (分子量为 400 bp ,命名为 S1106400) ,作为小麦光
敏雄性不育基因的稳定连锁标记。
3 　结论与讨论
311 　在 A31 光周期敏感时期 (小穗原基分化期 ———
四分体期) 日长达到育性转换的临界值 (1415 h 左
右) ,A31 表现完全雄性不育。经卡方测验表明 ,
A31 ×1376 的 F2 分离群体中的育性分离符合一对基
因 3∶1 的分离比例 ,所以 A31 光敏育性可能是由一
对基因控制的。F2 中可育个体结实率比可育亲本
偏低 ,可能是由于异源胞质仍对育性有一定影响所
致。
312 　本实验利用 RAPD 分析方法之一的混合群体
分离法 (Bulked segregation analysis ,BSA) 来检测光敏
雄性不育小麦 A31 与其恢复系小麦 1376 杂交 F2 后
代的多态性。由于混合群体分析要求把相同表现型
或基因的个体混合 ,所以只有与该表现型或基因有
关的那些差别才能被找到 ,这大大提高了检测出所
研究基因连锁的分子标记的可能性。本实验用通过
筛选得到的引物 S1106 ,从 F2 分离群体中 (不育池与
可育池)扩增到分子量为 400 bp 左右的特异条带 ,
并进行了重复验证 ;又对杂交亲本和供试个体进行
了重复验证 ,证明了这种多态是真实的和可靠的。
据此 ,我们推断 S1106 的该多态性扩增产物是与小
麦 A31 光敏雄性不育基因连锁的 ,可以作为 A31 光
敏不育基因的连锁标记。
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