全 文 ：第 27 卷 第 6 期 作　物　学　报 V o l. 27, N o. 6
2001 年 11 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA N ov. , 2001
基因枪介导法向小麦导入黄花叶病毒复制酶基因的研究Ξ
徐惠君1　庞俊兰1　叶兴国1　杜丽璞1　李连城1　辛志勇1　马有志1
陈剑平2　陈　炯2　程顺和3　吴宏亚3
(1中国农业科学院作物育种栽培研究所, 农业部作物遗传育种重点实验室, 北京 100081; 2 浙江省农业科学院植物病毒省
重点实验室, 浙江杭州 310021; 3 江苏省里下河地区农科所, 江苏扬州 225002)
提　要　筛选出适宜小麦转化的优良基因型扬麦 158 和扬麦 10 号。以扬麦 158 幼胚愈伤组织为受体,
利用基因枪介导法将含有小麦黄花叶病毒复制酶基因 (W YM V 2N ib8) 的 p ubiN ib8质粒转入了小麦。T 0 代
经 PCR 扩增分析, 获得了 14 株含W YM V 2N ib8 基因的转化植株, 转化率为 0. 43%。T 1、T 2 代跟踪分
子检测和 T 2 代田间病毒抗性鉴定结果表明, 获得了 4 个抗W YM V 的转基因株系。
关键词　小麦; 黄花叶病毒; 复制酶基因; 基因枪; 转化
Study on the Gene Tran sferr ing of N ib8 in to W hea t for It′s
Resistance to the Y ellow M osa ic V irus by Bom bardm en t
XU H u i2Jun1　PAN G Jun2L an1　YE X ing2Guo 1　DU L i2Pu1　L IL ian2Chen1
X IN ZH I2Yong1　M A You2Zh i　CH EN J ian2P in2　CH EN Jun2　CH EN Shun2H e3
W U Hong2Ya3
(1 M inistry K ey L ab f or C rop Genetics and B reed ing , Ch inese A cad emy of A g ricu ltu ra l S ciences, B eij ing 100081; 2V irology
L abora tory of Z he j iang A cad emy of A g ricu ltu ra l S ciences, H ang z hou 310021; 3L ix iahe A g ricu ltu ra l Institu te of J iang su
p rov ince, Y ang z hou 225002, Ch ina)
Abstract 　　 Tw o w heat geno types w ith h igh t issue cu ltu re ab ility, Yangm ai 158 and
Yangm ai 10, w ere screened from ten comm ercia l variet ies fo r the fo llow ing tran sfo rm at ion.
T hen, the seven days imm atu re em b ryo ca lli of Yangm ai 158 u sed as recep to r of N ib8 target
gene, w h ich w as iso la ted from w heat yellow m o saic viru s, w ere bom barded by b io list ic
part icle. 237 resistan t p lan t lets to 3～ 5 m göL B ia lapho s w ere ach ieved on the select ion
m edium. By PCR analysis in the T 0 genera t ion, fou rteen tran sgen ic p lan ts w ere iden t if ied
w ith a tran sfo rm at ion frequency of 0. 43%. Fou r tran sgen ic w heat lines st rongly resistan t to
the d isease w ere ob ta ined com b in ing the m o lecu lar test of T 1, T 2 and W YM V field test of
T 2.
Key words　　W heat; W heat yellow m o saic viru s; RNA 2dependen t RNA po lym erase;
B io list ic part icle; T ran sfo rm at ion.Ξ 中国2欧盟合作研究项目 IC182CT 9620049。
作者简介: 徐惠君 (19402 ) , 女, 江苏宜兴人; 研究员, 主要从事小麦组培和遗传转化研究; T el: 010268919765
Fax: 010268975212 E2m ail: zyx in@public3. b ta. net. cn
收稿日期: 2001204228, 接受日期: 2001206220
Received on: 2001204228, A ccep ted on: 2001206220

植物基因工程的发展为防治小麦黄花叶病毒 (W heat Yellow M o saic V iru s W YM V ) 开辟
了新途径[ 1～ 2 ]。1985 年 Sanfo rd John 首先提出病原体引发抗性的概念, 即利用病毒的某些基
因, 如外壳蛋白基因和复制酶基因, 通过人工合成和改造并将其转入植物, 使植物对病毒产
生抗性。1986 年, Pow ell2A bel 等[ 3 ]将烟草花叶病毒 (TM V ) 的外壳蛋白基因导入烟草, 获得
了首例抗 TM V 的转基因植株。由外壳蛋白基因介导的抗性已在黄瓜花叶病毒 (CM V )、苜蓿
花叶病毒 (AM V )、马铃薯X 病毒 (PV X)、马铃薯 Y 病毒 (PV Y)、烟草线条病毒 (T StV )、水稻
条纹叶枯病毒 (R SV )等主要病毒的抗性方面成功应用[ 4, 5 ]。植物病毒复制酶属于依赖于RNA
的 RNA 聚合酶 (RNA 2dependen t RNA po lym erase, R dRp ) , 是病毒基因组编码的自身复制
酶不可缺少的一部分。由病毒复制酶基因介导的转基因植株对病毒和RNA 的侵染均有很高
的抗性[ 2 ]。类似研究在禾本科作物尚未见成功报道。本研究的目的是利用基因枪法将W YM V 2
N ib8 基因导入感病小麦品种, 获得转基因小麦。
1　材料和方法
1. 1　小麦材料
供试小麦品种包括扬麦 158、扬麦 5 号、扬麦 6 号、扬麦 9 号、扬麦 10 号、942141、盐
92216 等, 由江苏省里下河地区农科所提供。
1. 2　外植体和靶材料
取授粉后 14d 左右的幼胚为外植体, 接种在 SD 2 培养基[ 6 ]上, 黑暗条件下 (26℃) 诱导愈
伤组织, 7d 后将愈伤组织集中在培养皿中央, 经 0. 4 m o löL 渗透压培养基 (SD 2 添加 0. 2
m o löL 甘露醇, 0. 2 m o löL 山梨)醇处理 4～ 6h 做基因枪轰击之用。
图 1　　重组DNA 质粒 pU biN ib8构造
F ig. 1　　General construction of p lasm id
pU biN ib8 used in th is study
1. 3　质粒D NA
质粒 p ubiN ib8由浙江省农科院植物病毒实
验室提供[ 7 ] (图 1) pAHC20由美国 Peter Q un il
教授赠送 (图 2)。质粒上的W YM V 2N ib8 基
因 (1212 bp , 从扬州地区的病毒株系中分离
得到) 和筛选基因 ba r (0. 6 kb) 均由 ub iqu t in
(2. 0 kb) 启动子控制。质粒DNA 提取采用
碱裂法。
图 2　　质粒 PA HC20 构造
F ig. 2　　General m ap of p lasm id pA HC20
1. 3　基因枪法共转化
将质粒DNA p ubiN ib8和pAHC20按 1∶1
体积充分混合, 包裹在直径 1. 6 Λm 金
粉微粒上。采用 PD S21000öH e 基因枪
轰击靶材料 (B ia2Rod 公司生产)。轰击
后的愈伤组织继续在原渗透压培养基上
处理 16～ 18h, 然后转入 SD 2 培养基黑
暗条件下 (26℃)恢复培养 2 周[ 8 ]。
1. 4　转化体筛选和植株再生
恢复培养后的愈伤组织移到 1ö2M S+ NAA 1 m göL + KT 1 m göL + B ia lapho s 3～ 5 m gö
L 的培养基上诱导分化 3 周 (每日 10h 光照, 24℃) [ 9 ] , 出现绿芽分化后转无激素培养基 (1ö
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2M S+ B ia lapho s 3～ 4 m göL ) 上直到小苗伸长 (光照与温度同前) , 小苗长到 1～ 2 cm 时, 移
入1ö2M S+ IAA 0. 5 m göL + B ia lapho s 3 m göL 的培养基上壮苗, 再生植株生长到适宜大小
(苗高 6～ 8 cm , 根系较好见图B )时移入花盆, 置于温室。
1. 5　PCR 扩增、Southern 杂交和 RT—PCR 分析
采用酚2氯仿法提取转基因小麦植株中基因组DNA 做模板, 进行 PCR 扩增, 引物为 5’2
CT TCCAA CA T TCT GA TCA T 23’、5’2T T GGA GCTCAA T GCTA TC23’, PCR 产物在 0.
8% 琼脂糖胶上电泳后转至尼龙膜上, 采用碱变性法吸印。Sou thern 杂交分析参照 Sam b rock
等的方法进行, 以 pU biN ib8基因作探针, 采用 Α232p dCT P 随机引物法 (引物由上海生物工程公司
合成) 进行标记和分子杂交。总RNA 的提取参照 TR ZOL 试剂盒 (G IBCOBRL ) 说明书进行。
用适量的不含 RNA 酶处理总 RNA , 以防 DNA 污染, 反转录参照 SU PER SCR IPT TM
P ream p lif ica t ion 系统 (G IBCOBRL ) 的说明书进行, 引物采用 0ligo (dt) 12～ 18, 反转录酶为
Suoerscrip tÊ , PCR 分析同上所述。
1. 6　转基因植株抗病性鉴定
T 2 转基因植株抗病性鉴定在江苏省里下河地区农科所病圃进行, 毒土来源于江苏省宜
兴重病区, 以抗源宁 9312、仪宁小麦、扬辐 93211 和宁丰小麦为抗病对照, 扬麦 158 为感病
对照。采用 0～ 3 级的方法统计病株发病及 3 级以上重病株, 重复 3 次。
2　结果和分析
2. 1　小麦优良基因筛选
中国小麦黄花叶病毒病的重发区在以江苏省扬州地区为主的长江中、下游麦区。近 20 年
来, 扬州里下河地区农科所育成的一批小麦品种如扬麦 3 号、扬麦 5 号、扬麦 158 等都是长江
中、下游的主栽品种, 面积推广均在百万公顷以上。因此, 本研究中我们以里下河地区农科所
育成的扬麦 158 等 10 个品种 (系) 为实验材料 (除 88256 抗小麦黄花叶病毒外, 其余 9 个品种
均感病) , 从中筛选培养力高的基因型, 作为遗传转化的受体, 便于生产利用。在 1996～ 1997
年先后二次取这 10 个材料授粉后 14d 左右的幼胚进行培养, 统计其出愈率和分化能力, 评价
幼胚培养效果 (表 1)。
表 1　　扬州地区主要小麦品种 (系)幼胚培养力比较
Table 1　　Tissue culture respon se of some commerc ia l wheat var ieties from Yangzhou reg ion
基因型
Geno type
W YM V 抗性
Response
to W YM V
　
接种幼胚数
Imm ature
em bryo s used
　
出愈率 (% )
F requency
of callus
induction
再生植株3
Regeneration
p lan tlets
　
每胚产生绿苗数株
P lan tlets
from each
em bryo
Yangm ai 158　扬麦 158 号 S 73 100 289 3. 96
942141 S 116 100 374 3. 22
Yangm ai 10　扬麦 10 号 S 123 100 455 3. 70
Yangm ai9　扬麦 9 号 S 92 100 230 2. 50
Yangm ai5　扬麦 5 号 S 89 100 129 1. 45
Yangm ai6　扬麦 6 号 S 83 100 64 0. 77
93263 S 97 100 37 0. 38
902140 S 68 100 245 2. 50
Yan92216　盐 92216 S 101 100 80 0. 80
88256 R 123 100 15 0. 12
　　3 为幼胚愈伤组织继代一次以后再进行分化所得苗数
　　3 the p lan tlets regenerated after sub2cu ltu re callus once.
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结果表明, 供试材料其幼胚在 SD 2 培养基上均能形成愈伤组织, 但愈伤组织质量及分化
能力差距甚大。扬麦 158、扬麦 10 号、942141、扬麦 9 号、902140 这 5 个材料平均每胚分化绿
苗数为 3. 96、3. 70、3. 22、2. 50、2. 50 株, 分别为 88256 的 33 倍、31 倍、21 倍和 21 倍。扬麦
158、扬麦 10 号、942141 已提供合作单位英国洛桑试验站、苏格兰作物科学院和德国马普协
会育种所利用, 作为转化的受体, 取得了较好结果[ 10 ]。
2. 2　转基因植株 T0 的获得及 PCR 检测
我们采用了高培养力的扬麦 158 (图A ) 作遗传转化的受体材料, 其幼胚愈伤组织用包裹
质粒 p ubiN ib8、pAHC20的微粒子弹基因枪轰击。1999 年我们先后做了 3 批转化试验, 共轰出了
3240 块愈伤组织, 在愈伤组织分化及小植株生长过程中, 经过 3～ 5 m göL B ia lapho s 3 次筛
选, 最后获得了 237 株抗B ia lapho s 再生植株 (图B ) , 移入温室花盆后死亡 69 株, 成活 168
株 (表 2) , 成活植株全部提取基因组DNA 进行 PCR 扩增和 PCR 2Sou thern 分析, 发现其中
的 14 株具有与阳性植株基因相同的 1212bp 片段, 而对照扬麦 158 无此片段 (图C)。进一步
以W YM V 2N ib8 基因作探针, 对 PCR 产物进行 Sou thern 杂交, PCR 2Sou thern 结果证明扩增
出的特异片段来自W YM V 2N ib8 基因(图D )。分子检测结果表明, 本实验的转化率为 0. 43%。
表 2　　基因枪轰击扬麦 158 幼胚愈伤组织结果
Table 2　　Tran sformation result of the bombardmen ted call i of Yangma i 158
试验　
Experim ents
轰击胚数
C slli
bom bard2
m ented
筛选后获得再生植株
Resistan t p lan tlets
ob tained on
selection m edium
移栽成活株
Survial
p lan ts in
greenhouse
PCR +
PCR po sit ive
p lan ts
　
频率
T ransfo rm ation
efficiency (% )
1 945 163 121 4 0. 42
2 810 12 8 0 0
3 1485 62 39 10 0. 67
合计　To tal 3240 237 168 14 0. 43
表 3　　T1 代转基因株系 PCR、PCR-Southern 检测结果
Table 3　　Result of the T1 tran sgen ic l ines tested
by PCR and PCR-Southern
转基因株系代号
L ine
检测株数
P lan ts tested
PCR 和 Southern+
PCR and Southern+
1 8 1
2 2 1
3 5 2
4 4 1
5 6 2
6 6 1
7 7 1
8 2 1
9 7 1
10 7 2
11 4 1
12 4 1
合计　To tal 65 15
2. 3　转基因植株 T1 代跟踪分子检测
由于温室温度偏低, 在 14 株 T 0 代转
基因植株中, 我们套袋自交获得 12 株种
子, 但每株种子偏少。按株系将这些种子
播入试验地。苗期提取 65 株基因组
DNA , 进行 PCR 扩增分析, 并进一步进
行 Sou thern 杂交 (图 E)。表 3 结果表明小
麦W YM V 2N ib8 基因已整合到转基因植
株基因组中。12 个株系后代均有分离, 具
有N ib8 基因片段的阳性植株为 15 株, 占
总检测株数的 23. 1% (表 3)。
2. 4　转基因株系T2 代RT-PCR 分析及抗
病性鉴定
提取 T 2 代转基因植株总 RNA 作模
板, 进行R T 2PCR 扩增, 扩增结果见图 F, 反转录时加反转录酶的 5 个转基因株系中, 除 8
以外其余 4 个株系的扩增带与用质粒做模板得到的扩增带相同, 说明外源基因在转基因植株
1966 期　　　　　　　徐惠君等: 基因枪介导法向小麦导入黄花叶病毒复制酶基因的研究　　　　　　　　

的RNA 水平上得到表达。
表 4　　转基因植株抗WYM V 病毒鉴定结果
Table 4　　F ield test of the tran sgen ic plan ts for WYM V resistance
编号
O rder
鉴定株数
P lan ts
tested
感病株数
Sensit ive
p lan ts
3 级感病株数
Sensit ive
p lan ts heavily
发病率
Sensit ive
frequency
N 12 19 0 0 0. 0000
N 13 48 0 0 0. 0000
N 14 42 0 0 0. 0000
N 15 46 1 0 0. 0217
Yangm ai158 (CK1) 46 22 4 0. 4783
N ing9312 (CK2) 46 2 0 0. 0435
Yin ing w heat (CK3) 44 1 0 0. 0227
N infeng w heat (CK2) 48 2 0 0. 0417
Yangfu 93- 11 (CK2) 46 4 0 0. 0870
　　T 0、T 1 代经分子检测
的 15 个转 p ubiN ib8 基因株系
在江苏省里下河地区农科所
病毒圃进行抗性鉴定, 结果
见表 4。在 15 个株系中, 有
11 个株系的发病率与感病
亲本扬麦 158 相似, 说明这
11 个株系基因功能不表达。
但另有 4 个株系N 12、N 13、
N 14、N 15 表现高抗, 其中
N 12、N 13、N 14、感病株数
为 0, 发病率为 0, N 15 仅有
1 株轻度感染, 发病率为 2. 17% , 远远低于感病对照扬麦 158 的发病率 (47. 83% ) , 也略低于
4 个抗源的发病率 (分别为 4. 35%、2. 27%、4. 17%、8. 70% ) (表 4) , 说明通过基因枪转化,
我们获得了抗小麦W YM V 的转基因小麦。
3　讨论
适宜的转化受体是小麦遗传转化成功的重要因素之一。在小麦转化研究中很有影响力的
几篇报道都是以模式小麦品种Bobw h ite 为受体[ 11～ 14 ] , 如Cheng 等 (1997) 首次用农杆菌介导
获得转基因植株, A ltpeter 等 (1996) 用基因枪介导获得小麦转基因植株。我们认为转基因研
究最终目的为走向产业化。优良的转化受体应具有 3 个条件: ① 该品种缺少这一功能基因;
② 生产上正在大面积种植或即将推广的优良品系; ③ 兼有良好的培养能力。本试验筛选出
的扬麦 158、扬麦 10 号具备了上述条件, 是极好的小麦转化受体。扬麦 158 不仅在本实验中
取得较好的结果, 在我们实验室另一个基因 PEm ucp l的转化中也取得较好的效果 (待发表)。欧
共体合作项目伙伴英国苏格兰作物研究院利用基因枪轰击扬麦 10 号获得了 8 株转基因植株
(转化率 0. 53% ) [ 10 ]。美国内布拉斯加大学与我们合作, 用农杆菌介导法转化扬麦 10 号 168
个幼胚愈伤组织, 获得了 4 株转基因植株 (转化率 2. 38% , 待发表)。
一般认为转基因植株 T 1 代的分离应为 3∶1[ 14～ 16 ]。Cheng 等、戴顺洪等、陶利珍等在小
麦、水稻转N PT 2Ê、GU S、R TBV 2CP 等基因的研究中, 转基因植株 T 1 代遗传分析基本上
呈孟德尔式分离 (3∶1) , 本研究结果 T 1 代分子检测中N ib8+ ∶N ib8- 为 15∶50, 不符合孟德
尔定律, 可能是因为 T 1 代群体太小或其它未知因素所致。
本试验 T 2 代抗病性鉴定中, 有 11 个转基因株系, 虽然分子检测证明外源基因已整合到
基因组中, 但小麦W YM V 的发病率与受体扬麦 158 相似, 表明外源功能基因没有表达, 基
因发生了沉默。随着转基因技术在各个应用领域的深入和发展, 转基因沉默现象已引起越来
越多的关注[ 15～ 17 ]。一般认为转基因的拷贝数和构型、整合位点、转基因的转录水平, 环境和
发育因子都与转基因沉默有关, 沉默可能发生在转录水平, 也可能在转录后水平、我们准备
继续做转基因植株拷贝数的分析, 探讨沉默可能发生的原因。
我们利用基因枪介导法将N ib8 复制酶基因导入了优良小麦品种扬麦 158, 获得了 4 个高
296　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　27 卷

抗小麦黄花叶病的株系。下一步我们拟对N ib8 基因的遗传行为进行详细研究, 对转基因的
抗病性进一步鉴定, 同时利用品种间杂交法将N ib8 基因转入其他小麦品种。
参　考　文　献
1　李洗铣, 北京: 中国农业科技出版社, 1993, 30～ 34
2　成卓敏, 生物技术通报, 1997 (4) : 11～ 13
3　Pow ell, A. , N eison, R. S. , Bavun, D. E. , et al. , S cience, 1996, 232: 738～ 747
4　刘进元, 余荔华. 生物工程进展, 1994, 14 (2) : 31～ 34
5　田颖川, 秦晓峰, 王桂玲等, 中国科学 (B 辑) , 1990, 8: 822～ 831
6　徐惠君, 辛志勇, 刘四新等, 遗传学报, 1996, 23 (5) : 376～ 381
7　Chen, J. , Chen, J. , Yang, J. , et al. , P lan t P a tholog g , 2000, 49, 370～ 374
8　徐惠君, Steinb iss, H. H. , Sohn, A. , 等, 云南大学学报, 1999, 21: 26～ 27
9　叶兴国, 徐惠君, 杜丽璞等, 农业生物技术学报, 2000, 8: 71～ 74
10　A dam s, A. J , Genetic engineering to imp rove Ch ines w heat: in troduction of stab le resistance to so il2brone mo saic viruse
as a p ro toype system [R ]. 2000, EC IN CO P rogramm e, Contract: IC182CT 9620049, final repo rt
11　A ltpeter, F. , V asil, V. , Srivastava, V. , et al. , P lan t Cell R ep orts, 1996, 16: 12～ 17
12　Stoger, E. , W illiam s, S. , Ch ristou, P. , et al. , M olecu lar B reed ing , 1999, 5: 65～ 73
13　Zhou, H. , A rrow sm ith, J. W. , F romm , M. E. , et al. , P lan t Cell R ep orts, 1995, 15: 159～ 163
14　Cheng, M. , F ry, J. E. , Pang, S. , et al. , P lan t p hy siol, 1997, 115: 971～ 980
15　华志华, 黄大年. 生命科学, 1999, 11 (2) : 51～ 53
16　李　艳, 李　毅, 陈章良. 生物工程学报, 1999, 15 (1) : 1～ 5
17　刘　昕, 傅荣昭, 蔡民华, 李文彬, 生物工程进展, 1998, 18 (4) : 53～ 56
Explana tion of Pla te É
A. Shoo t regeneration from the calli of Yangm ai 158; B. T ransfo rm ed p lan ts resistan t to B ialapho s; C. PCR analysis of
T 0 p lan ts w ith N ib8 gene: 1. PCR m arker 2. po sit ive contro l 3. negative contro l. 4～ 8. po sit ive p lan ts; D. PCR - Southern
analysis of the T 0 p lan ts: 1. po sit ive contro l. 2. negative contro l. 3～ 7. po sit ive p lan ts; E. Southern b lo t of the T 1 p lan ts:
1. po sit ive contro l. 2. negative contro l. 3～ 8. po sit ive p lan ts; F. RT - PCR analysis of N ib8 gene in the T 2 p lan ts: 1. PCR
M ark. 2. po sit ive contro l. 3. negative contro l. 4. reaction w ithout reverse transcrip tase of transgenic p lan ts. 5～ 7, 9.
Reaction w ith reverse transcrip tase of transgenic p lan ts. 8. A n escape reaction; G. F ield test of the T 2 t ransgenic p lan ts fo r
W YM V resistance: left: transgenic p lan ts. righ t: sensit ive contro l.
3966 期　　　　　　　徐惠君等: 基因枪介导法向小麦导入黄花叶病毒复制酶基因的研究