全 文 ：Vol. 31 , No. 1
pp. 88 - 91 　Jan. , 2005
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 31 卷 第 1 期
2005 年 1 月 　88～91 页
抗条锈小滨麦易位系的鉴定
陆文辉1 ,2 　林小虎1 　李兴峰1 　王黎明1 ,3 　陈寅初2 　王洪刚1 , 3
(1 山东农业大学农学院 ,山东泰安 271018 ;2 新疆农垦科学院 ,新疆石河子 832000 ;3 河南科技大学农学院 ,河南洛阳 471003)
摘 　要 :从八倍体小滨麦与普通小麦杂种后代中筛选到一个农艺性状优良的抗条锈小滨麦种质系山农 0096 ,细胞学观察
结果表明其根尖细胞染色体 2 n = 42 ,花粉母细胞减数分裂中期 Ⅰ(PMC M Ⅰ) 染色体构型为 2 n = 21 Ⅱ;它与小麦亲本的
杂种 F1 PMC MⅠ染色体构型平均值为 2 n = 19 Ⅱ+ 1 Ⅳ。RAPD 分析表明 :在 100 个十聚体核苷酸随机引物中 ,有 3 个引物
在山农 0096 中扩增出滨麦草的特异 DNA 带 ,它们分别记为 S241250 、S38750 、S42640 ,初步确定山农 0096 是一个小滨麦易位
系。以滨麦基因组 DNA 为探针的荧光原位杂交结果进一步表明山农 0096 是小麦与滨麦的小片段易位系。
关键词 :小滨麦 ;易位系 ;细胞学 ;RAPD ; GISH
中图分类号 : S512
Identif ication of Tritileymus Translocation Line with Stripe Rust Resistance
LU Wen2Hui1 ,2 ,LIN Xiao2Hu1 ,LI Xing2Feng1 ,WANGLi2Ming1 ,3 ,CHEN Yin2Chu2 ,WANG Hong2Gang1 , 3
( College of Agronomy , Shandong Agricultural University , Tai’an 271018 , Shandong , China)
Abstract :A Tritileymus germplasm line , Shannong 0096 , with useful agronomic characteristics and good resistance to
stripe rust , was selected from the progeny of Octoploid Tritileymus and common wheat1 The cytological results showed that
the chromosome number of Shannong 0096 in root tip cell was 2 n = 42 , its chromosome configuration at PMC MⅠwas 2 n
= 21 Ⅱ, and mean chromosome configuration of hybrids F1 between it and wheat parent at PMC MⅠwas 2 n = 19Ⅱ+ 1 Ⅳ1
The random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis was made in the Shannong 00961 Among 100 random primers , 3
primers were revealed specific DNA bands of Leymus mollis designated as S241250 ,S38750 ,S42640 respectively1 Therefore
Shannong 0096 can be primarily identified as a Tritileymus translocation Line1 The results of genome in situ hybridization
( GISH) with the probe of Leymus mollis genome DNA , further proved that Shannong 0096 is a wheat2Leymus mollis trans2
location line with small fragment1
Key words : Tritileymus ;Translocation line ;Cytology ;RAPD ; GISH
　　八倍体小滨麦 (Octoploid Tritileymus ,2 n = 56) 是
通过普通小麦 ( Triticum aestivum , AABBDD ,2 n = 42)
与滨麦草 (Leymus mollis ,JJNN ,2 n = 28) 杂交 ,人工合
成的不完全双二倍体[1 ,2 ] ,具有大穗、大粒、多花、蛋
白质含量高 ,抗病、抗倒伏等优良性状。通过八倍体
小滨麦与普通小麦杂交已获得了多个农艺性状好 ,
抗病、优质、高产的异附加系和易位系材料 ,为拓宽
小麦遗传背景、创造新种质、培育新品种奠定了良好
基础。
普通小麦异源易位系的鉴定方法包括形态学观
察[3 ] 、细胞学分析[4 ] 、生化标记鉴定[5 ] 、原位杂交检
测[6 ]等技术 ,而其中以原位杂交检测技术最为直观
有效。迄今为止 ,多数小麦与其近缘野生物种的染
色体间易位都应用原位杂交技术进行鉴定[7 ] 。
RAPD(Random Amplified Polymorphic ,DNA) 技术自诞
生以来 ,由于其具有程序简单、操作方便、成本较低、
模板 DNA 用量少等优点 ,在品种鉴定、遗传作图、遗
传多样性分析等方面得到了广泛的应用。近年来 ,
在外源遗传物质检测方面也有许多报道[8～12 ] 。本研
究对小滨麦种质系山农 0096 ,在抗病性及农艺性状
评价的基础上 ,利用细胞学、RAPD 和 GISH 技术进
一步进行了鉴定。
繱基金项目 : 国家自然科学基金 (30270286) 。
作者简介 : 陆文辉 (1971 - ) ,男 ,新疆石河子人 ,新疆兵团农科院作物所助理研究员 ,在读硕士研究生。研究方向 :生物技术与作物遗
传改良。3 通讯作者 (Corresponding author) :王洪刚。E2mail :hgwang @sdau. edu. cn
Received(收稿日期) :2003209222 ,Accepted(接受日期) : 2004204204.

1 　材料和方法
111 　材料
　　滨麦草 ( Leymus mollis ,JJNN ,2 n = 28) 、八倍体小
滨麦 (Octoploid Tritileymus ,2 n = 56) 引自原中国科学
院西北植物研究所 ,由傅杰先生提供。普通小麦烟
农 15 等均为本实验室保存 ,小滨麦种质系山农 0096
是本实验室从烟农 15 与八倍体小滨麦杂种后代中
选育而成。
112 　方法
11211 　抗条锈鉴定 　　在山东农业大学农学院试
验田和网室进行 ,采取条中 29、30、31 和水源 46 号
混合菌种成株期人工接种。抗性反应分为 5 级 ,即
0 级 :免疫 ;1 级 :高抗 ;2 级 :中抗 ;3 级 :中感 ;4 级 :
高感。
11212 　细胞学鉴定 　　根尖细胞学鉴定是将种子
在 25 ℃培养箱内发芽 ,取适宜根尖冰水浴 24 h ,卡
诺固定液固定 ,铁钒2苏木精染色压片、镜检。花粉
母细胞染色体构型鉴定是取适期的花药 ,卡诺固定
液固定 ,改良卡宝品红染色、压片、镜检。
11213 　RAPD 鉴定　　DNA 的提取采用 Sharps[13 ] 等
提出 ,经 Devos[14 ]等改进的方法。RAPD 扩增引物为
上海生工 (Sangon) 公司生产的十聚体核苷酸。反应
总体积 25100μL ,其中 ,ddH2O 14105μL ,10 ×buffer
215μL ,Mg2 + 210μL ,dNTP 215μL ,引物 112μL , Taq
酶 0125μL ,模板 DNA 215μL。
PCR扩增反应在 PE9600 PCR 仪上进行 ,首先
94 ℃变性 1 min ,72 ℃2 min ,然后每循环 94 ℃变性
15 s ,36 ℃退火 30 s ,72 ℃延伸 1 min ,45 个循环后 ,在
72 ℃保温 4 min。扩增产物用 112 %琼脂糖凝胶电泳
分离 , Tanon GIS 2010 凝胶成像系统观察结果并
照相。　　
11214 　染色体原位杂交分析
(1)染色体制片 :八倍体小滨麦与山农 0096 的
种子在 25 ℃萌发 ,取适宜根尖冰水浴 24 h ,卡诺固
定液固定 1～2 d ,蒸馏水冲洗 ,卡宝品红染色压片 ,
液氮冷冻揭片 ,气干备用。
(2)探针标记 :滨麦 DNA 用 Roche 公司的 Dig2
Nick translation mix 试剂盒通过缺刻平移法进行标
记 ,置 - 20 ℃冰箱储存备用。
(3)原位杂交 :染色体制片用 RNaseE(4μgΠmL ,
2 ×SSC) 37 ℃处理 1 h ,2 ×SSC 室温下漂洗 6 min ,
70 %、100 %酒精脱水各 3 min ,晾干。杂交液按封阻
DNA 4 000 ng(4μL) ,探针DNA 100 ng(2μL) ,80 ℃变
性 5 min ,碎冰 3 min ,每张片子加 2415μL ,85 ℃共变
性 5 min ,然后 37 ℃杂交过夜。
(4)信号检测 :制片进行洗脱后 ,每片加 98μL
5 % BSA(牛血清蛋白) 温育 10 min ,甩干 ,每片加 50
μL Anti2Dig2FITC(2 ngΠμL) ,37 ℃温育 1 h ,然后用 4 ×
SSC洗脱 ,用含 PI的抗褪色剂封片。
(5) 观察照相 :用 OLYMPUS 荧光显微镜观察 ,
Fuji400 彩色胶片照相或 CCD 机采集图象。
2 　结果与分析
211 　种质系山农 0096 的性状特点
　　山农 0096 株高 80 cm 左右 ,繁茂性好 ,分蘖力
强 ,叶色浓绿 ,株形紧凑 ,抗条锈病 ,综合性状优良 ,
植株形态具有双亲的特征。其主要性状特点列于
表 1。
表 1 山农 0096 及其亲本的性状特点
Table 1 Characters of Shannong 0096 and its parents
材料
Material
株型
Type of
plant
穗型
Type of
spike
芒
Awn
株高
Height
(cm)
穗长
Spike
length
(cm)
结实小穗Π穗
(个)
Fertile spikelet
per spike
每穗粒数
Grains per
spike
条锈病抗性
Resistance to
stripe rust
滨麦草 Leymus mollis 匍匐 分枝 无芒 4410 ±1102 　1315 ±1153 - - 免疫
八倍体小滨麦
Octoploid Tritileymus 直立 长方 长芒 8915 ±2116 　1130 ±1106 21 ±1111 30 ±6174 免疫
烟农 15 Yannong 15 直立 长方 无芒 7212 ±1183 　8120 ±0121 18 ±0114 59 ±2155 中抗
山农 0096
Shannong 0096 直立 长方 无芒 8012 ±4120 11120 ±2111 20 ±0135 49 ±4143 免疫
212 　细胞学鉴定
细胞学鉴定结果表明 ,八倍体小滨麦根尖细胞
染色体数目为 2 n = 56 (图版 Ⅰ21) ,花粉母细胞减数 分裂中期 (PMC M Ⅰ)染色体构型为 2 n = 28 Ⅱ(图版Ⅰ22) ;烟农 15 根尖细胞染色体数目 2 n = 42 (图版Ⅰ23) ,花粉母细胞减数分裂中期 Ⅰ( PMC M Ⅰ) 染色
98　第 1 期 陆文辉等 :抗条锈小滨麦易位系的鉴定 　　　

体构型为 2 n = 21 Ⅱ(图版 Ⅰ24) ;山农 0096 的根尖细
胞染色体数目 2 n = 42 (图版 Ⅰ25) ,花粉母细胞减数
分裂中期 I(PMC M Ⅰ) 染色体构型为 2 n = 21 Ⅱ(图
版Ⅰ26) 。将山农 0096 与烟农 15 杂交 ,在杂种 F1 的
PMC M Ⅰ常观察到四价体或三价体与单价体 (图版
Ⅰ27、8) 。
213 　RAPD 鉴定
以滨麦草、八倍体小滨麦、山农 0096、烟农 15 为
材料 ,选用上海生工 (Sangon)公司生产的 100 个十聚
体核苷酸引物进行 PCR 扩增反应 ,扩增产物进行
112 %琼脂糖凝胶电泳。结果表明 ,大部分引物均能
扩增出清晰的 DNA 带 ,不同的引物扩增的带从 1～6
条不等 ,其中有 3 个引物扩增出特异带型 ,并且经过
多次重复 ,带型稳定。引物 S24 在滨麦草、八倍体小
滨麦、山农 0096 中 ,均能扩增出一条 1 250 kb 的带 ,
而在烟农 15 中没有这条带 (图 1) ,将其记为 S241250 ;
引物 S38 在滨麦草、八倍体小滨麦和山农 0096 中扩
增出一条 640 kb 的特异谱带 ,烟农 15 则缺乏这条带
(图 2) ,将其记为 S38640 ;引物 S42 同样在前 3 个材料
中扩增出一条 750 kb 的特征谱带 ,而在烟农 15 中缺
少这条带 (图 3) ,将其记为 S42750 。因此 , S241250 、
S38640 、S42750 均为滨麦草 DNA 的特异扩增产物。由
此证明 ,在山农 0096 中含有滨麦草的遗传物质。
214 　基因组原位杂交
在荧光显微镜下观察 ,用地高辛标记的滨麦草
基因组 DNA 作探针进行的分子原位杂交结果显示 ,
亲本八倍体小滨麦大多数细胞具有 14 条滨麦草染
色体 (图版 Ⅰ29) ,其基本染色体构成为 2 n = 56 =
42Ta + 14Lm ( Ta = 小麦染色体 ,Lm = 滨麦染色体) 。
用滨麦基因组 DNA 为探针 ,对山农 0096 进行的原
位杂交显示 ,在一对中期染色体的端部有杂交信号
(图版 Ⅰ210) ,在前期的细胞中也可以观察到杂交信
号。进一步证明 ,山农 0096 是一个小滨麦易位系。
3 　讨论
311 　关于基因组原位杂交
　　用基因组总 DNA 作探针能够鉴定小麦背景下
的外源染色体或染色体片段 ,由于 GISH 技术不需
要知道外源染色体所属同源群的有关信息 ,也无需
分离、鉴定和筛选特异性探针 ,具有快速、直观等优
点而被广泛应用于分子细胞遗传学研究 ,但对于染
色体组亲缘关系较近的物种及小片段易位系的鉴定
仍比较困难。试验中 ,在掌握 GISH 的基本技术的
基础上 ,制片的好坏与合适的封阻 DNA 浓度是试验
成功的关键 ,染色体制片以酶解法较好 ,能排除细胞
壁干扰 ,染色体分散好 ,但染色体易变形 ,常出现染
色体数目不够等缺点 ;直接压片法 ,细胞染色体形态
好 ,但分散不理想。笔者通过调整酶解时间可以得
到理想的制片。封阻 DNA 是与小麦染色体 DNA 杂
交 ,从而阻止探针 DNA 与非目标序列结合 ,从而得
到清晰无干扰的杂交信号 ,本实验封阻以 50～100∶1
比较合适 ,低于 50 倍时 ,非特异杂交较多 ,高于 100
倍会使检测率下降 ,甚至得不到杂交信号。
312 　小片段易位系的应用价值及产生机理
小片段易位系是向小麦引入外源基因的最有价
值的重组类型 ,代换系、附加系和大片段易位系由于
同时带有较多的不良农艺性状 ,难以直接在生产上
应用。本实验研究的山农 0096 是小麦2滨麦草的小
片段易位系 ,经接种鉴定 ,高抗小麦条锈病 ,农艺性
状优良 ,是一个有较高应用价值的育种材料。小片
段易位系大部分为端部易位系 ,周兖晨鉴定的小滨
09 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷 　

麦易位系 ,牟金叶、刘道峰等鉴定的小偃麦易位系均
是端部易位。目前 ,对非罗伯逊易位 (non2Roberiso2
nian translocation)的机理还不清楚 ,可能与染色体端
粒结构有关 ,深入研究异源染色体间易位机制对遗
传学基础研究和异源染色体的种间转移及其应用是
很有意义的。
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Explanation of Plate Ⅰ
Fig11 :Chromosomes of Octoploid Tritileymus in root tip cell (2 n = 56) ; Fig12 :Chromosome configuration of Octoploid Tritileymus in PMC M Ⅰ(2 n = 28 Ⅱ) ;
Fig13 :Chromosomes of Yannong15 in root tip cell (2 n = 42) ; Fig14 : Chromosome configuration of Yannong15 in PMC MⅠ(2 n = 21 Ⅱ) ;Fig15 :Chromosomes of
Shannong 0096 in root tip cell ,2 n = 42 ; Fig16 :Chromosome configuration of Shannong 0096 in PMC MⅠ,2 n = 21 Ⅱ;Fig17 :Chromosome configuration of hybrid
F1 between Shannong 0096 and Yannong 15 in PMC MⅠ, (2 n = 19 Ⅱ+ 1 Ⅲ+ 1 Ⅰ) ;Fig18 :Chromosome configuration of Hybrid F1 between Shannong 0096 and
Yannong 15 in PMC MⅠ,2 n = 19 Ⅱ+ 1 Ⅳ;Fig19 : GISH to metaphase chromosome of Octoploid Tritileymus root tip cell ;Fig110 : GISH to metaphase chromosome
of Shannong 0096 root tip cell (The arrows indicate two hybridization signals) ;Fig111 : GISH to interphase nuclei of Shannong 0096 root tip cell (The arrows indicate
hybridization signals) 1
19　第 1 期 陆文辉等 :抗条锈小滨麦易位系的鉴定