全 文 ：Vol. 30 , No. 12
pp. 1179 - 1184 　Dec. , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 12 期
2004 年 12 月 　1179～1184 页
小麦新品种“川农 16”低分子量谷蛋白亚基新基因的分子克隆
龙　海　魏育明　颜泽洪　郑有良 Ξ
(四川农业大学小麦研究所 ,四川都江堰 611830)
摘　要 　采用 PCR 方法从小麦 ( Triticum aestivum L. )新品种“川农 16”中克隆得到一个低分子量谷蛋白亚基 (LMW2GS) 新
基因 LMWCN1622 ( GenBank No. AY296753) 。该基因具有LMW2GS基因的典型结构特征 ,编码区全长 906 bp ,编码 301 个氨
基酸。推导氨基酸序列比较显示 ,LMWCN1622 与已报道的 LMW2GS 基因 ,尤其是 Glu2A3 位点编码的基因序列有很高的
一致性。
关键词 　小麦 ;品种 ;低分子量谷蛋白亚基 ;基因克隆
中图分类号 :S512
Molecular Cloning of A Novel Low2molecular2weight Glutenin Subunit Gene
from Wheat ( Triticum aestivum L. ) Cultivar“Chuannong 16”
LONG Hai , WEI Yu2Ming , YAN Ze2Hong , ZHENG You2Liang3
( Triticeae Research Institute , Sichuan Agricultural University , Dujiangyan 611830 , Sichuan , China)
Abstract 　Using PCR2amplification method , the coding sequences of a novel low2molecular2weight glutenin gene , LM2
WCN1622 ( GenBank No. AY296753) , was isolated from the genomic DNA of wheat cultivar Chuannong 16. The full coding
region of this gene was composed of 906 nucleotides , and could be translated into a protein of 301 amino acids. LM2
WCN1622 is a typical low2molecular2weight glutenin subunit (LMW2GS) gene. The deduced amino2acid sequences compari2
son suggested that LMWCN1622 had a high degree of identity with the reported LMW2GS genes , especially those of which
encoded by the Glu2A3 locus. It’s necessary to clarify the chromosomal localization of this gene and its effect on baking
quality in wheat .
Key words 　Wheat ( Triticum aestivum L. ) ; Cultivar ; Low2molecular2weight glutenin subunit ; Gene cloning
　　小麦谷蛋白 (glutenin) 和醇溶蛋白 (gliadin) 是种
子贮藏蛋白的主要成分。醇溶蛋白是单体蛋白 ,而
谷蛋白是由蛋白质亚基 (subunit) 通过分子内和分子
间的化学键 (包括二硫键和其他一些非共价键)形成
的可溶性复合体[1 ] 。根据在 SDS2PAGE 上的迁移率
可将这些亚基分为高分子量谷蛋白亚基 (high2mole2
cular2weight glutenin subunit ,HMW2GS) 和低分子量谷
蛋白亚基 (low2molecular2weight glutenin subunit ,LMW2
GS) [2 ]两类。
根据分子量和等电点的不同 ,可将 LMW2GS 分
为 B、C、D 三种类型[3 ] 。它们主要受 1A、1B、1D 染色
体短臂上的 Glu2A3、Glu2B3 和 Glu2D3 位点控制 ,统
称 Glu23 位点。人们早就认识到低分子量谷蛋白亚
基对小麦加工品质有重要的影响[2 ,4～6 ] 。LMW2GS 基因的克隆使人们对它有了更深入的了解。虽然已有一些LMW2GS基因部分或完整序列的报道[1 ,7～20 ] ,但想弄清其整个基因家族的信息 ,工作还远远不够。本文报道从小麦品种“川农 16”中分离克隆的 LMW2GS新基因。1 　材料和方法1. 1 　材料　　小麦 (Triticum aestivum L. ) 栽培新品种“川农16”,是由四川农业大学小麦研究所选育的高产、优质弱筋小麦新品种 ,分别于 2002 年和 2003 年通过四川省和国家审定。1. 2 　方法1. 2. 1 　DNA 提取 　　植物总 DNA 的提取按Ξ基金项目 :国家“十五“攻关项目 (2001BA511B11) 。
作者简介 :龙海 (1979 - ) ,男 ,作物遗传育种专业在读硕士。3 通讯作者 :郑有良。Tel :083522882336 ,E2mail :grmb @sicau. edu. cn
Received(收稿日期) :2003210220 ,Accepted (接受日期) : 2004204204.

Bielefeldt2Ohmann 等 (1997) [21 ]的方法进行。
1. 2. 2 　LMW2GS基因编码区 PCR 扩增 　　根据 Co2
lot 等 ( 1989) [11 ] 发表的 LMW2GS 基因 LMWG21D1
(GenBank No. X13306) 设计了扩增低分子量谷蛋白
编码区的一对引物 , P1 为 5′2ATGAAGACCTTC2
CTCGTCTTTGC23′; P2 为 5′2TCAGTAGG CACCAACTC2
CGGTGC23′。该对引物分别位于 LMW2GS 基因编码
区的信号肽和 C 末端。PCR 反应混合物包括 5μL
10 ×PCR buffer ,2 mmolΠL MgCl2 ,0. 2 mmolΠL dNTP ,引
物各 150 ng ,1. 5 U Ex TaqTM DNA 聚合酶 ( TaKaRa) ,
100 ng 模板 DNA ,加双蒸水至总量 50μL。PCR 反应
程序为 : 94 ℃预变性 4 min ;然后 94 ℃变性 1 min、
60 ℃退火 45 s、68 ℃延伸 1 min ,共 35 个循环 ;最后
68 ℃延伸 5 min。PCR 反应在 Peltier Thermal Cycler
(MJ Research , USA)中进行。
1. 2. 3 　PCR 产物回收和克隆 　　以 1 %的琼脂糖
和 Watson DNA 胶回收试剂盒 (上海华舜生物) 回收
目的 DNA 片段 ,连入 pBlueScript SK( + Π- )2T 载体
[按 Bielefeldt2Ohmann 等 (1997) [21 ] 的方法制备 ]。连
接反应混合物总体积 20μL 中包括 50 ng pBlueScript
SK2T载体、2μL 10 ×连接酶缓冲液、350 U T4 连接
酶和回收的目的 DNA 片段 ,在 16 ℃恒温条件下连接
过夜。按 CaCl2 法制备感受态细胞[22 ] ,热击转化按
标准程序进行。转化菌液中加入 400 μL 预热至
37 ℃的 LB 液体培养基 ,37 ℃低速培养 40 min 后 ,取
200μL 菌液与 4μL 0. 1 molΠL IPTG和 40μL 的 20 %
X2gal 均匀涂布于含有 50μgΠmL 氨苄青霉素的LB 固
体平板上 ,37 ℃恒温培养 12～16 h。
1. 2. 4 　筛选阳性克隆 　　挑取白色单菌落于涂布
有 IPTG和 X2gal 的氨苄LB 固体平板上扩大培养 ,并
挑取蓝斑作为对照。对菌体进行 PCR 扩增 ,筛选阳
性克隆。PCR 反应所用引物、条件与 LMW2GS 基因
编码区扩增反应相同。
1. 2. 5 　LMW2GS 序列测定及分析 　　基因序列测
定由 TaKaRa 公司完成。序列分析利用 NCBI网站的
相关软件进行。
2 　结果与分析
2. 1 　PCR扩增、目的片段克隆和测序
　　PCR 扩增产物用 1 %的琼脂糖凝胶电泳检测为
一条 900 bp 左右的带 (图 1) 。将目的片段回收纯化
后连接到 pBlueScript SK( + Π2)2T载体上并转化到大
肠杆菌中。对白斑进行 PCR 扩增 ,确认为阳性克隆
后进行测序。使用 ORFfider 和 Blastp 进行序列分
析 ,发现其中一个序列与已公布的 LMW2GS 基因非
常类似但又不完全相同 (最高一致性为 93 %) 。由
于在 PCR 扩增时采用了保真效果很好的 Ex TaqTM
DNA 聚合酶 ( TaKaRa) ,以及较高的退火温度 ,可以
在最大程度上确保扩增的忠实性。因此认为克隆得
到的是一个低分子量谷蛋白亚基新基因 ,将其命名
为 LMWCN1622。
图 1 川农 16 LMW2GS 基因的 PCR 扩增
Fig. 1 Amplified LMW2GS gene with
primers P1ΠP2 from Chuannong 16
箭头所指为 0. 9 kb 的扩增产物 ,M:DNA marker。
Arrow shows 0. 9 kb PCR product , M:DNA marker.
2. 2 　LMWCN1622 的核苷酸及氨基酸序列
LMWCN1622 的完整编码区核苷酸序列全长 906
bp ,无内含子 ,是一个典型的LMW2GS基因序列。根
据通用三联体密码 ,可翻译成含 301 个氨基酸残基
的蛋白质。包含有由 20 个氨基酸残基组成的信号
肽 ,紧接其后的是由 13 个氨基酸残基组成的 N 端保
守区。
N 末端区之后是重复区和 C末端区。重复区由
86 个氨基酸残基组成 ,富含脯氨酸和谷氨酰胺。C
末端区由 182 个氨基酸残基组成。
2. 3 　氨基酸序列比较
在 NCBI 网站上使用 blastp 程序将 LMWCN1622
与其他低分子量谷蛋白基因序列进行了比对 ,发现
LMWCN1622 与已报道的 LMW2GS 基因具有很高的
一致性 (70 %～93 %) 。对与 LMWCN1622 一致性非
常高的前 5 个基因序列 (表 1) 事先去除重复区进行
了比较 (图 3) 。各基因的重复区序列在图 4 中
列出。
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图 2 LMWCN1622 的核苷酸及推导的氨基酸序列
Fig. 2 Nucleotide and deduced amino2acid sequence of LMWCN1622
表 1 LMW2GS 基因
Table 1 LMW2GS genes
GenBank 序号
GenBank
accession No.
克隆类型
Clone type
位点
Locus
与 LMWCN1622 的一致性
Identity with
LMWCN1622 参考文献Reference
AB062868 cDNA Glu2A3 93 % Ikeda T M et al . (2002) [20 ]
AB062869 cDNA Glu2A3 93 % Ikeda T M et al . (2002) [20 ]
AB062872 cDNA Glu2A3 93 % Ikeda T M et al . (2002) [20 ]
AJ293099 PCR Glu2A3 93 % D’Ovidio et al . (2000) ,直接引用 ncbi 站点上的序列
(http :ΠΠwww. ncbi . nlm. nih. govΠentrezΠviewer. fcgi ? db = nucleotide & val = 9931206)
AB062870 cDNA Glu2D3 89 % Ikeda T M et al . (2002) [20 ]
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“. ”显示缺失 ,“3 ”显示终止密码
The repetitive domain is not included.“. ”shows deletion ,“3 ”shows stop codons
图 3 LMW2GS 基因推导氨基酸序列比较
Fig. 3 Comparison of deduced amino2acid sequences of LMW2GS genes
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图 4 LMW2GS 基因重复区序列比较
Fig. 4 The repeat motifs comparison among the repetitive domains of LMW2glutenins
　　比较发现 ,这些基因非重复区氨基酸序列具有
很高的一致性 ,最高达 97 %。信号肽序列 ( Ⅰ) 高度
保守 ,仅 LMWCN1622 的 13 位上为丙氨酸 (A) ,而其
他 5 个基因在该位上是缬氨酸 (V) 。N 末端区 ( Ⅱ)
也非常保守 ,LMWCN1622 在该区的第 4 位有一个不
同于另 5 个基因的精氨酸 (R) 。它们在第 5 位上都
有一个半胱氨酸残基 ,这在已知的 LMW2GS 基因中
普遍存在[23 ] 。
接下来的 C末端区可细分为 3 个区。Ⅲ区是 C
末端区中一个极端保守的区域 ,变异极小。该区中 ,
LMWCN1622 的序列与这 5 个基因高度相似 ,都含有
5 个半胱氨酸残基 ,且位置保守 ,但在第 38、59、68、
72 上分别有一个不同于其他的氨基酸残基。Ⅳ区
富含谷氨酰胺 ,都含有一个保守的半胱氨酸残基。
C末端区的尾部 ( Ⅴ) 也是一个保守区域 ,含有一个
半胱氨酸残基。
重复区 (图 32B) 富含谷氨酰胺和脯氨酸 ,开始
和结尾都是 3 个谷氨酰胺。这 6 个基因重复区长度
差异不大 ,除了 AB062870 (11 个) ,都含有 13 个重复
单元。这些重复单元可在核苷酸水平上概括为一个
模型 CCA122 TTT T(C) CA ( G) CAA ( G) CAA124 (Cassidy
等 1998) 。一些特异的单元可以用单个碱基的变异
来解释 ,比如 TFPQQ 中的苏氨酸 ( T) 可以理解为是
由编码脯氨酸 ( P) 的密码子发生突变而产生 (CCA
突变为 ACA) 。
3 　讨论
根据分子量和等电点的不同 ,可将 LMW2GS 分
为B、C、D 三种类型[3 ] 。其中 B 型和 C 型亚基的分
子量分别为 40～50 kDa 和 30～40 kDa[24 ] 。根据
LMWCN1622 的氨基酸序列推算的分子量为 30～40
kDa ,应属于 C 型亚基。推导的氨基酸序列显示
LMWCN1622 具有与 Cassidy 等 ( 1998 ) [17 ] 建立的
LMW2GS基因模型一致的、清晰的基因序列结构。
根据LMW2GS 的 N2末端氨基酸序列可将其分
为LMW2s 型和 LMW2m 型 ,其起始氨基酸分别为丝
氨酸 (S)和甲硫氨酸 (M) 。LMW2s 型亚基占主要部
分 ,其 N2末端区氨基酸序列以 SHIPGL2开始。LMW2
m 型 则 主 要 有 METSHIPGL2、METSRIPGL2以 及
METSCIPGL2三种不同的 N2末端序列 ,以第一种居
多。而在推导的氨基酸序列中 ,以 METSCIPGL2序列
最为典型[23 ] 。LMWCN1622 属于 LMW2m 型 ,其 N2末
端序列为 METRCIPGL2 ,该序列在 D 基因组物种中
有报道[18 ] 。
LMWCN1622 中有 8 个保守的半胱氨酸 (图 2) ,
C2末端区有 6 个完全保守 ,同样情况也出现在γ2醇
溶蛋白中。这 6 个半胱氨酸残基可能形成分子内二
硫键 ,而另外 2 个自由的半胱氨酸残基 (一个位于
N2末端区 ,另一个位于 C2末端区或重复区) 则可能
形成分子间二硫键[25 ] 。这样 ,LMW2GS 就能和自身
或者与 HMW2GS一起形成蛋白质多聚体。
氨基酸序列比较显示 , LMWCN1622 与另 5 个
LMW2GS基因序列在信号肽、N2末端区以及 C2末端
区均具有很高的一致性 ,且重复区的差异也不大。
一致性最高的前 4 个基因都由 Glu2A3 编码。虽然
引物由 Glu2D3 位点编码基因设计 ,但由于该类蛋白
质基因的高度同源性 ,无法确定 LMWCN1622 是由
Glu2A3、Glu2B3 和 Glu2D3 中哪一个位点所编码 ,其对
小麦加工品质的影响也尚待研究。
3811　12 期 龙 　海等 :小麦新品种“川农 16”低分子量谷蛋白亚基新基因的分子克隆 　　　

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