全 文 ：Vol. 29 , No. 5
pp. 797～800 　Sept , 2003
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 29 卷 第 5 期
2003 年 7 月 　797～800 页
研究
简报
低能离子束介导大豆 DNA 的小麦雄性不育变异体蛋白水解酶
分析
姬生栋1 　秦广雍2 　耿　飒1 　夏　民1 　朱晓鹏1 　徐存拴1 　霍裕平2 Ξ
(1河南师范大学生命科学学院 ,河南新乡 453002 ; 2 郑州大学物理工程学院 ,河南郑州 450052)
Analysis of Properties and Types of Proteinases in Wheat Male Sterility Variants
with Soybean DNA Mediated by Low Energy Ion Beam
J I Sheng2Dong1 　QIN Guang2Yong2 　GENG Sa1 　XIA Min1 　ZHU Xiao2Peng1 　XU Cun2Shuan1 　HUO Yu2Ping2
(1 College of Life Science , Henan Normal University , Xinxiang , Henan 453002 ; 2 Industrial Institute of Zhengzhou University , Zhengzhou Henan 450052 , China)
　　离子束介导转基因技术 [1 ,2 ]为远缘分子杂交育种开辟了
一条新途径。近年来 ,这项技术引起了越来越多的育种工作
者的关注和应用 [3 ,4 ] ,我们运用这项技术 ,将大豆 DNA 导入
小麦 ,在当代就获得了一批性状优良的新株系 [4 ] 。通过对新
材料的连续筛选 ,在第 3 代发现有个别材料分离出雄性不育
变异株 (见表 1) 。我们利用复性电泳技术对雄性不育株和
可育株的蛋白水解酶进行比较和分析。
酶是基因和性状的联接物 ,同工酶是从分子水平鉴别遗
传变异或基因转移的一种有效手段 ,可作为基因表达的一种
良好标志 ,有人通过分析转化植株同工酶谱 ,根据酶带缺失 ,
酶活强弱等现象来验证直接导入的 DNA 引起调控代谢系统
和基因表达的改变等的作用 [5 ,6 ] 。关于小麦雄性不育的发生
与酶的作用已有一些报道 ,有人认为 ,细胞质不育系与其保
持系相比 ,在过氧化物酶谱和酶活等方面存在显著差异 ,并
认为过氧化物酶的异常与雄性不育有关 [7 ,8 ] 。
蛋白水解酶在细胞的代谢过程中起重要作用 ,与蛋白质
的降解、特异修饰等有关 [9 ] ,因此 ,研究介导大豆 DNA 片断
的小麦第 3 代雄性不育植株的蛋白水解酶种类和性质 ,可为
进一步研究低能离子辅助外源 DNA 片段转移至受体后 ,如
何影响受体的基因表达及其调控的改变提供理论依据。
1 　材料与方法
1. 1 　材料
　　供试材料为离子束辅助大豆 DNA 转移至新麦 9 号的第
3 代小麦株系 (见表 1) ,种植于河南省新乡市农业科学研究
所小麦试验田。
表 1 远缘分子杂交小麦雄性不育变异体主要形态特征
Table 1 Major characters of wheat male sterility variants
类型
Type
对照 a
Control a
株系 b 　Strain b
b1 b2 b3
株系 c 　Strain c
c1 c2 c3
株系 d 　Strain d
d1 d2
株高 Plant high (cm) 69 49 67 67 75 50 50 68 68
熟期 (月/ 日)
Mature stage (MonthΠDay) 6/ 2 6/ 7 6/ 2 6/ 3 6/ 2 6/ 3 6/ 2 6/ 2 6/ 4
雄性育性 Male fertile F S F S F S F S F
二代株高
High of the second
generation (cm)
68 67 51 67
　　注 :a :对照 ;b、c、d :分别表示 3 个株系 ;1、2、3 :表示 3 种变异体 ; F :可育 ;S :败育。下同。
Notes : a : Stands for control ; b , c and d : three strain of wheat ; 1 ,2 and 3 : three variants ; F : fertile ; S : sterility. The same below.
基金项目 :国家“十五”科技攻关项目 (2001BA302B203 ) ,河南省“十五”重点科技攻关项目 ( 0124020315 ) 。
作者简介 :姬生栋 (1963 - ) ,男 ,河南焦作人 ,主要从事小麦育种及生理研究和教学工作。
Received(收稿日期) :2002211204 ,Accepted(接受日期) :2003205201.

1. 2 　方法
1. 2. 1 　样品的采集与处理
在小麦灌浆后期 ,取小麦旗叶 ,迅速放入冰壶 ,带回实验
室后放入液氮备用。制备电泳样品时 ,将叶片加石英砂在液
氮中研磨 ,冰浴匀浆 (样品提取液为 0. 9 % NaCl 溶液) ,然后
4 ℃离心 (10000 ×g , 15 min) ,取上清液分装于 Eppendorf 管
中 ,保存于 - 80 ℃备用。
1. 2. 2 　蛋白质浓度测定及复性电泳
按 Neuhoff 等 [10 ]的方法测定样品的蛋白质浓度。复性电
泳技术 (SDS2G2PAGE明胶原位消化法) 是一种电泳后仍可保
持酶生物学活性 ,适用于研究各类酶分子量、性质和作用的
方法 [15 ] 。复性电泳 ( SDS2G2PAGE) 方法按 Neuhaus2Steinmetz
等 [11 ]略有改动 ,分离胶浓度为 10 % ,浓缩胶浓度为 5 % ,每个
泳道加样品的总蛋白量为 50μg ,电泳在 4 ℃恒压进行。电泳
后将胶板放入 250 mL 洗涤液中 ( TritonX2100 12 mL , Tris2base
3. 03 g , 加双蒸水 500 mL , 调 pH 7. 0) 洗涤 30 min ,然后再用
单蒸水洗 2 次 ,双蒸水洗 1 次 ,每次 5 min ,洗涤后 ,将胶板放
入孵育液 (3. 7 g Gly , 0. 37g CaCl2 ·2H2O , 加入 500 mL 双蒸
水)中洗涤5 min ,而后置于新孵育液中 ,孵育液 pH 值分别为
5. 0、7. 0、8. 5 ,37 ℃恒温箱孵育 24 h ,最后参照 Laemmli 方
法 [12 ]进行固定、染色、脱色、照相。
1. 2. 3 　主要试剂
Acrylamide (USB) 、Bisacrylamide ( Fluka) 、Gelatin ( Sigma) 、
TEMED (Bio2Rad) 、SDS ( Gibco) 、Tris2base ( Gibco) 、TritonX2100
(FARCO)等 ,均为分析纯及以上。
2 　结果
2. 1 　pH 5. 0 时蛋白水解酶种类和活性
　　由图 1A 和表 2 可以看出 ,对照 a 中共检到 80、72、68、47
kD 4 条酶带 ,其中 47 kD 活性极弱 ,72 kD 蛋白水解酶活性较
强。株系 b 中 ,可育株 b2 比 a 多检到一条 110 kD 酶带 ,且活
性较弱 ,其他带型与 a 基本一致。在不育株 b1 中检到 4 条酶
带 ,分别为 47、68、72、110 kD ,且活性均较弱 ,但 47 kD 酶活相
对比 a 和 b2 的酶活强。另一不育株 b3 的带型与对照相似 ,
仅 47 kD 酶活性比对照强 ,其他 3 条酶带活性均比对照弱。
不育株 b1 和 b3 的总酶活均比可育株 b2 和 a 弱。
在株系 c 中 ,可育株 c1 检到 5 条酶带 ,比可育株 c3 多检
到一条 40 kD 的弱带。不育株 c2 带型与 c3 相似 ,但 47 kD 酶
带活性比 c1 和 c3 强 ,c2 蛋白水解酶总酶活比 c1 和 c3 弱。
在株系 d 中 ,不育株 d1 检到 4 条酶带 ,带型与 a 相似 ,d1
酶带活性比可育株 d2 稍强。可育株 d2 中检到 68、72、80 kD 3
条酶带。
2. 2 　pH 7. 0 时蛋白水解酶种类和活性
在 pH 7. 0 时 ,各株系变异体及对照蛋白水解酶谱变化
见图 1B 和表 2 ,对照 a 检到 4 条酶带 ,分别为 68、72、80、95
kD ,其中 72 kD 活性很强 ,95 kD 活性很弱。株系 b 中 ,可育株
b2 的带型与 a 相似 ,但 95 kD 酶活比 a 强。不育株 b1 中共检
到 4 条酶带 ,分别为 68、72、110 和 220 kD ,其中 110 kD 酶带活
性较强 ,220 kD 活性极弱。不育株 b3 比 b2 多检出 3 条酶带 ,
分别是 47 kD(活性弱) 、220 kD(活性很弱) 和 260 kD(活性很
弱) 。
株系 c 分离出 3 种类型变异体 (表 1) ,c1 和 c3 均可育 ,与
a 相比 ,c1 多检出 47 kD 一条酶带 ,c3 多检出 220 和 260 kD 两
条弱带。不育株 c2 带型与 c3 相似 ,但相对应的 68、72 和 80
kD 酶带活性均比 c1 和 c3 弱。
在株系 d 中 ,不育株 d1 共检出 4 条酶带 ,分别为 68、72、
80 和 95 kD ,与可育株 d2 蛋白水解酶酶带相似 ,d1 中 68 kD 酶
活稍高于 d2 ,d1 总酶活比 d2 稍高。
图 1 不同 pH条件下小麦雄性不育变异体叶片蛋白水解酶谱
Fig. 1 Zymograph of wheat leaves of male sterility
variants under different pH
A :pH 5. 0 ; B :pH 7. 0 ; C:pH 8. 5
2. 3 　pH 8. 5 时蛋白水解酶种类和活性
从表 2 和图 1C中可以看出 ,对照 a 共检到 3 条酶带 ,分
别为 68、72 和 80 kD ,可育株 b2 比 a 多检到一条 95 kD 弱带。
不育株 b1 仅检到两条酶带 ,72 和 95 kD ,且活性较弱。不育
株 b3 检到 3 条酶带 ,与 a 带型相似。不育株 b1 和 b3 的总酶
活均比 a 和 b2 弱。
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株系 c 中 ,两种类型可育株 c1 和 c3 中均检到 68、72 和
80 kD 3 条活性较强的酶带 ,c1 中多的检到 1 条 95 kD 弱带。
不育株 c2 检到的酶带与 c1 相似 ,但相对应的 68、80 和 95 kD
酶带酶活性 c2 比 c1 弱。
株系 d 中出现两种类型变异体 ,可育株 d2 检到 68、72、80
和 95 kD 4 条酶带 ,不育株 d1 比 d2 少检到 1 条 95 kD 的弱带 ,
d1 总酶活比 d2 稍弱。
表 2 雄性不育小麦叶片蛋白水解酶的种类和活性
Table 2 Types and activity of proteinases in leaves of wheat male sterility variants
pH
分子质量 (MW)
(kD)
对照 (a)
Control a
株系 b 　Strain b
b1 b2 b3
株系 c 　Strain c
c1 c2 c3
株系 d 　Strain d
d1 d2
5. 0 40 +
47 + 2 + + 2 + + + + +
68 2 + + 2 + 2 + 2 + 2 + 2 + + +
72 3 + + 3 + 2 + 3 + 3 + 3 + 2 + 2 +
80 + 2 + + + + + + +
110 + +
7. 0 47 + +
68 3 + + 3 + 3 + 3 + 2 + 3 + 2 + 2 +
72 4 + + 4 + 3 + 4 + 3 + 4 + 3 + 3 +
80 2 + 2 + + 2 + + 2 + + +
95 + 2 + + + + + + +
110 3 +
220 + + + +
260 + + +
8. 5 68 3 + 3 + + 3 + 2 + 3 + + +
72 4 + + 4 + 2 + 4 + 4 + 4 + 2 + 2 +
80 3 + 3 + + 3 + + 3 + + +
95 + + + + +
　　注 :蛋白水解酶活性表示方法 : + 活性弱　2 + 活性较弱　3 + 活性强　4 + 活性很强。
Notes : Indication of activity of proteinases 　+ weak 　2 + general 　3 + strong 　4 + stronger.
3 　讨论
离子束介导外源 DNA 的小麦在第 3 代个别株系中分离
出部分雄性不育变异体。它们与对照和同株系可育植株叶
片的蛋白水解酶复性电泳酶谱结果表明 ,不育植株蛋白水解
酶种类和性质与对照和同株系可育植株间存在明显差别。
这种蛋白水解酶谱的差异与张花等 [8 ]对雄性不育小麦过氧
化物酶的研究结果类似 ,他们对小麦 7 个同核异质不育系的
POD酶谱进行了分析 ,认为 POD 酶谱的差异是细胞质基因
对过氧化物酶基因的表达有调控作用 ,不育系过氧化物酶谱
带的变化可能是雄性不育发生的原因之一。株系 b 和 c 的
不育株变异体总酶活在 3 种 pH 值条件下 ,均比对照和本株
系可育株弱 ,这一结果与马翎健等 [13 ] 报道的牡山羊草细胞
质小麦核代换系的育性与其 SOD、CAT的酶活性呈正相关的
结论相一致。但是 ,在株系 d 中 ,不育株 d1 在 pH 5. 0 时 ,它
的总酶活却比可育株稍强 ,而在 pH 8. 5 时 ,d2 又比 d1 的总
酶活稍弱 ,这说明单从某种 pH 条件下得到的蛋白水解酶活
性强弱来解释可育株与不育株的关系并不确切。不同株系
间及可育株与不育株间总酶活出现的这种差异 ,有待进一步
研究。不育株 b1 检到的 110 kD 蛋白水解酶带是所分析的几
种不育变异体中 b1 所独有的 ,以及在 pH 5. 0 时不育株 b1 和
b3 中检到的 47 kD 酶带活性比可育株 b2 强等 ,对这些特殊
蛋白水解酶的进一步研究 ,将为揭示不育机理提供一定的理
论依据。在株系 b、c、d 中 ,不育株蛋白水解酶带型存在明显
差别 ,这可能是由于外源 DNA 片段随机进入受体所致。杨
景成等 [14 ]研究了外源λDNA 导入普通小麦的雄性不育变
异 ,认为外源 DNA 整合进受体基因组 ,打破了受体原有的核
苷酸顺序 ,改变了其基因的表达和调控 ,从而引起后代变异。
从导入外源 DNA 的小麦株系第 3 代变异体的蛋白水解酶种
类和性质看 ,未导入外源 DNA 的对照株 a 与株系 b、c、d 的各
个变异体蛋白水解酶种类和性质存在一定差异 ,说明离子束
介导外源 DNA 的第 3 代小麦变异体中可能仍保留着外源
DNA片段 ,即转入小麦中的外源 DNA 片段 ,在第 3 代并未完
全丢失、沉默。朱新产等 [6 ]发现将大赖草 DNA 导入小麦 ,其
变异后代出现了 POD 等同功酶的差异酶带 ,酶带缺失 ,酶活
改变 ,认为是由于直接导入的 DNA 可能引起调控代谢系统
的改变或调控基因的表达。株系 c 中 ,在 pH 5. 0 和 8. 5 时 ,
变异株 c3 与对照 a 的蛋白水解酶谱基本一致 ,但在 pH 7. 0
时变异株 c3 比对照 a 多检到了 260 和 220 kD 两条弱带 ,这
说明 ,用蛋白水解酶分析小麦变异后代 ,至少要在酸性、中
性、碱性条件下各选择一个适宜 pH 值 ,尽量避免因 pH 选点
不广而造成分析误差。
997　5 期 姬生栋等 : 低能离子束介导大豆 DNA 的小麦雄性不育变异体蛋白水解酶分析 　　　

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重　要　启　示
2004 年起本刊 (《作物学报》)由双月刊改为月刊 ,96 面Π期 ,定价 20 元Π期。特此敬告。
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