全 文 ：Vol. 30 , No. 5
pp. 516～518 　May , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 5 期
2004 年 5 月 　516～518 页
研究
简报 烟草黑胫病抗性基因 Bsl ( t)的 RAPD 标记
刘晓侠　王　荔 3 　文国松　杨艳琼 Ξ
(云南农业大学农学与生物技术学院 , 云南昆明 650201)
Screening and Study of RAPD Markers Linked to Tobacco Black Shank Resistance
Gene Bs1( t)
LIU Xiao2Xia ,WANGLi 3 ,WEN Guo2Song ,YANG Yan2Qiong
( College of Agronomy and Biotechnology , Yunnan Agricultural University , Kunming 650201 , Yunnan , China)
　　烟草黑胫病由 Van Breda de Haan[1 ]于 1896 年发现于印
度尼西亚的爪哇 , 它是世界烟草生产中危害最严重的病害
之一 ,同时也是我国烟草的主要病害 [2 ] 。在我国除黑龙江省
尚无发现之外 ,其余各植烟省区均有发生 ,平均发病率为
5 %～12 % ,严重田块高达 75 % ,甚至造成绝收 [3 ,4 ] 。据不完
全统计 ,我国烟草黑胫病平均每年发病面积高达 76 373 hm2 ,
产量损失 2. 869 万吨 ,经济损失超过 1. 23 亿元 ,仅次于烟草
病毒病 [5 ] 。烟草黑胫病自发现一个多世纪以来 ,引起了世界
各产烟国的普遍关注 ,相继投入大量的人力、物力和财力对
其分布、症状、病原、流行、预测及抗病育种、防治药剂和综合
治理等开展了大量的研究 ,但迄今为止 ,中国尚未培育出优
质高抗烟草品种。本研究经过辐射诱变获得了高抗烟草黑
胫病的突变株系 ,通过感病品种红花大金元 ×突变抗病株
系 ,获得杂交 F2 分离群体 ,研究了其抗病遗传规律。利用
RAPD标记和集团分离分析法 (BSA) 筛选 ,找到了与烟草抗
黑胫 病 基 因 Bs1 ( t ) 连 锁 的 RAPD 标 记 OPB023 000 和
OPM112 500 ,其遗传距离分别为 20. 5 cM和 29. 9 cM ,为该基因
的进一步研究、利用及烟草抗病品种的选育积累了基础储
备。
1 　材料与方法
1. 1 　供试材料
　　杂交组合母本为高感黑胫病的烤烟品种红花大金元 ,父
本为本课题组结合辐射诱变技术、细胞工程技术改良筛选的
高抗黑胫病的烟草红花大金元突变株系 [6 ,7 ] (该抗病突变株
系是以60 Co2γ射线照射高感黑胫病的优质烟草品种红花大
金元的花药为诱变手段 ,用烟草黑胫病疫霉菌粗毒素为筛选
剂 ,对烟草花粉植株叶片的愈伤组织 ,进行抗病突变体细胞
的筛选而获得) 。2000 年杂交 ,2001 年种植 F1 代 ,2002 年在
云南农业大学农场种植双亲及 F2 代。
烟草黑胫病 ( Phytophthoraparasitica var. nicotianae) 0 号强
毒菌株由教育部云南农业大学植物病理重点实验室提供。
1. 2 　烟草黑胫病的抗性接种鉴定
采用烟草黑胫病菌 ( Phytophthoraparasitica var. nicotianae)
0 号强毒菌株进行人工茎基部针刺接种 ,在感病对照充分发
病的情况下 (26 ℃左右 ,5～7 d) ,调查记录抗病分离情况 ,2～
3 d 后重复调查 1 次 ,病情鉴定按陈瑞泰的分级标准进行 [3 ] 。
1. 3 　基因组 DNA提取
DNA 微量提取用本课题组在传统 CTAB[8 ,9 ] 法基础上改
进的方法。
1. 4 　PCR反应
随机引物为美国 Operon 公司产品 ,长度皆为 10 bp ,随机
选用其中的 400 个进行扩增筛选 ,PCR 反应体积为 20μL ,其
中含有 10～30 ng 模板 DNA (两个亲本和 F2 代) ,5 mmolΠL
MgCl2 ,0. 2 mmolΠL dNTPs ,0. 2 pmolΠμL 随机引物 ,1 ×缓冲液
(10 mmolΠL Tris2HCl ,pH 9. 0 , 50 mmolΠL KCl) ,1 U Taq DNA 聚
合酶 ,反应于德国公司制造的 Gradient 型 PCR 扩增仪上进
行。引物扩增的条件如下 : 94 ℃预变性 5 min ,94 ℃变性 1
min ,36 ℃复性 1 min ,72 ℃延伸 2 min ,从变性至延伸共 44 个
循环 ,最后 72 ℃延伸 10 min。
1. 5 　数据分析
把随机引物 OPB02 和 OPM11 对 F2 分离群体的扩增结
果 ,用 MapMakerΠEXP 3. 0 作图软件分析 ,计算其连锁距离。Ξ基金项目 :云南省自然科学基金资助项目 (2000C0051M) 。
作者简介 :刘晓侠 (1977 - )女 ,江苏人 ,浙江大学在读博士 ,主要从事作物遗传育种研究。　3 通讯作者 :王荔。Tel :087125227726
Received(收稿日期) :2003208204 ,Accepted(接受日期) :2003211205.

2 　结果与分析
2. 1 　烟草黑胫病抗性鉴定结果与分析
　　首先对高抗黑胫病烟草红花大金元突变体株系 [7 ] 和高
感黑胫病烟草红花大金元品种杂交所获得 F1 代接种鉴定 ,
结果如下 :
表 1 　F1 和 F2 代群体抗性鉴定结果
Table 1 　The reaction of F1 and F2 to Phytophthoraparasitia
via . nicotianae
材料
Material
总株数
Total
抗病个体
Resistant
plants
感病个体
Susceptible
plants
χ2 3R∶1S
F1 450 450 0 —
F2 222 154 68 3. 75 < P0. 05 (3. 84)
感病亲本 (CK) 120 0 120 —
单株抗病性鉴定结果表明 (见表 1) ,F1 代 100 %植株高
抗黑胫病 ,说明此抗病基因为显性基因。
在人工接种病原菌的条件下 ,其 F2 抗病性的整体水平
高于对照亲本 ,说明此抗病性是可遗传的 ,故可用于分子标
记分析。同一细胞株系后代的植株间抗性水平有差异 ,χ2
检验结果显示此突变细胞株系的抗黑胫病性状符合 3∶1 的
分离比 (表 1) ,说明此抗病性主要受一对主效基因控制。
2. 2 　随机引物在两亲本和基因池间筛选结果
用 400 个随机引物对两亲本进行扩增 ,获得 79 个多态
性引物 ,其中抗病亲本、抗病基因池和感病亲本、感病基因池
的带型两两相同的可重复的随机引物是 OPB02 和 OPM11 ,其
多态性位置分别在 3. 0 kb 和 2. 5 kb 处。
2. 3 　F2 分离群体 RAPD 分析
为进一步探索标记 OPB023 000和 OPM112 500与抗病基因间
的连锁关系 ,对 F2 分离群体进行了 RAPD 分析 ,引物 OPB02
和 OPM11 对 222 株 F2 植株的扩增结果分别见图 1、表 2 和图
2、表 3。
表 2 　F2 群体黑胫病抗性分离与引物 OPB02 扩增结果关系
Table2 　The relationship between resistance segregation
and RAPD amplification results of F2 generation
抗性
Resistance marker
株数
No. of plants
有 OPB023 000
With OPB023 000
无 OPB023 000
Without OPB023 000
抗病 Resistant 154 31 123
感病 Susceptible 68 60 8
表 3 　F2 群体黑胫病抗性分离与引物 OPM11 RAPD 分析
Table 3 　The relationship between resistance segregation and RAPD
amplification results of F2 generation
抗性
Resistance marker
株数
No. of plant
有 OPM112 500
With OPM112 500
无 OPM112 500
Without OPM112 500
抗病 Resistant 154 112 42
感病 Susceptible 68 25 43
图 1 　随机引物 OPB02 对烟草 RAPD 扩增结果
Fig. 1 　RAPD amplification of tobacco with random primer OPB02
M:1 kb Marker ;1～14 :F2 代感病个体 ;15～22 :F2 代抗病个体
715　5 期 刘晓侠等 :烟草黑胫病抗性基因 Bs1 ( t)的 RAPD 标记 　　　

图 2 　随机引物 OPM11 对烟草 RAPD 扩增结果
Fig. 2 　RAPD amplification of tobacco with random primer OPM11
M泳道为 :1 kb Marker ;1～13 泳道为 F2 代感病个体 ;15～23 泳道为 F2 代抗病个体
图 3 　RAPD 标记与抗黑胫病基因的连锁图
Fig. 3 　A linkage map of RAPD markers and the resistant gene
　　此图是通过 MapMakerΠEXP3. 0 软件分析的结果 ,表明多
态性引物 OPB02、OPM11 和烟草抗黑胫病基因的连锁关系 ,
随机引物 OPB02 和该抗病基因的连锁距离为 20. 5 cM ,随机
引物 OPM11 和该抗病基因的距离为 29. 9 cM (见图 3) 。
3 　讨论
本研究所用的含 Bs1 ( t) 基因的高抗黑胫病红花大金元
突变株系是经高感黑胫病红花大金元品种辐射诱变获得的 ,
400 个随机引物对两亲本进行扩增 ,其中 79 个引物有多态
性 ,多态性频率达到 19. 75 %。推测烟草基因组可能发生了
多点突变。
虽然所获得的标记与 Bs1 ( t)基因之间连锁距离较大 ,但
本研究对克隆该基因以及辅助育种打下良好的基础 ,若选用
更多引物可进一步缩小其遗传距离 ,将可达到分离、克隆及
辅助育种的目的 ,这方面的工作正在进行中。
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