全 文 ：第 30 卷 第 3 期
2004 年 3 月 　297～298 页 　 　
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
　 　 Vol. 30 , No. 3
pp. 297～298 　Mar. , 2004
研究
简报 农杆菌介导豇豆胰蛋白酶抑制剂基因( cpti)在玉米中的遗传转化
伍晓丽1 　朱　祯2 , 3 　李晚忱1 　潘光堂1 　曹墨菊1 　荣廷昭1 , 3 Ξ
(1 四川农业大学玉米研究所 ,四川雅安 625014 ;2 中国科学院遗传与发育研究所 ,北京 100101)
Agrobacterium2mediated Delivery of Cowpea Trypsin Inhibitor Gene into Maize
Plant
WU Xiao2Li1 , ZHU Zhen2 , 3 , LI Wan2Chen1 , PAN Guang2Tang1 , CAO Mo2Ju1 , RONG Ting2Zhao1 , 3
(1 Maize Research Center , Sichuan Agricultural University , Ya’an 625014 , Sichuan ; 2 601 Group of Institute of Genetics and Developmental Biology , Chinese A2
cademy of Sciences , Beijing 100101 , China)
　　在众多玉米转化方法中 ,农杆菌法是很有发展潜力的手
段之一 ,它具有诸多优点 :操作简便 ,一次性处理材料量大 ,
成本低 ,可转化的外源 DNA 长 ,且外源基因大多为单拷贝插
入。
本实验用含质粒 pBUSCK2Hyg的根癌农杆菌感染玉米胚
性愈伤组织 ,获得了转化植株。pBUSCK2Hyg 含豇豆胰蛋白
酶抑制剂基因 cpti ,CPTI对玉米螟、粘虫、玉米根叶甲等多种
害虫具广谱抗性。
1 　材料与方法
1. 1 　受体材料
　　四川农业大学玉米所选育的优良自交系 182599 的幼胚
诱导的胚性愈伤组织。
菌株 :LBA4404 ,由中国科学院遗传与发育研究所提供。
质粒 :pBUSCK2Hyg ,由中国科学院遗传与发育研究所构
建 ,含目的基因 cpti ,标记基因 hpt。
1. 2 　转化和培养
从 YEB 平板上刮取少量工程菌 ,接种于含卡那霉素 50
mg/ L、利福霉素 25 mg/ L 的 YEB 液体培养基中 ,28 ℃遮光振
荡过夜 (约 14 h) ,以 2 %转接量接种于 20 mL 无抗生素 YEB
培养液中 ,振荡培养至 OD600约为 0. 5 ,加乙酰丁香酮至终浓
度 100μmol/ L ,浸泡外植体 15 min 后 ,接种于共培养基 ,28 ℃
暗培养 3 d ,接种于恢复培养基 ,4～5 d 后转入 HygB 浓度依
次为 5、10、15 mg/ L 的筛选培养基上连续筛选 3 轮 ,每轮 4
周。在 2 000 lx 光照 ,27 ℃下进行分化。小苗长至 4～5 cm
时 ,转入壮苗培养基 ,待长出健壮新根即移栽入土。
1. 3 　PCR检测
提取再生植株叶片基因组 DNA ,作 PCR 检测 ,引物序列
如下 :
5′端引物 :5′2AAAATGAAGAGCACCATCTTC23′
3′端引物 :5′2TCTAGAGTTCATCTTTCTCATC23′
1. 4 　Southern blot
以 cpti 片段作探针 , PCR 阳性植株基因组 DNA 为模板
进行 Southern 杂交检测 ,方法按王关林[1 ] 。
2 　结果与分析
2. 1 　分子检测结果
2. 1. 1 　PCR 检测 　约 9 %的抗性植株能扩增出一条 415 bp
的特异带 ,同阳性对照扩增带大小相同 ,而阴性对照则无此
带 (图 1) 。
图 1 T0 代再生植株 PCR检测
Fig. 1 PCR assay of T0 plants
M:Marker ;1～5 :阳性植株 ;6 :阴性对照 ;7 :阳性对照
M: Marker ;1 —5 : Positive plants ;6 : Negative plant ;7 : pBUSCK2Hyg
2. 1. 2 　Southern blot 　为了进一步证实该扩增带即是外源基Ξ基金项目 :国家自然科学基金 (30070476)和四川省生物技术专题资助。
作者简介 :伍晓丽 (1978 - ) ,女 ,四川简阳人 ,四川农业大学玉米研究所在读硕士 ,研究方向作物遗传育种。3通讯作者 :荣廷昭 ,朱　祯。
Received(收稿日期) :2002210208 ,Accepted (接受日期) : 2003204218.

因片段 ,取部分 PCR 阳性植株作 Southern blot ,结果如图 2。
图 2 T0 代再生植株 Southern blot 分析
Fig. 2 Southern blot analysis of PCR2positive T0 plants
A : Hind Ⅲ酶切质粒 pBUSCK2Hyg 作阳性对照 ; B : Hind Ⅲ酶
切未转化植株基因组 DNA 作阴性对照 ; C ,D , E: Hind Ⅲ酶切
PCR 阳性植株基因组 DNA
A :pBUSCK2Hyg/ Hind Ⅲ;B :Negative plant/ Hind Ⅲ; C ,D , E:
Positive plants/ Hind Ⅲ
在图 2 中 ,C、E 均有杂交条带 ,证明外源基因已经整合
到了基因组中。
2. 2 　转化过程中各因素对转化效率的影响
2. 2. 1 　受体材料侵染前后的培养条件 　表 1 中 ,处理 A1 和
A2、B1 和 B2 间的结果差异显著 ,可见 ,愈伤侵染前经一段时
间预培养 ,其生理状态达最佳 ,有利于提高侵染效率。反之 ,
若愈伤在同一培养基上培养的时间太长 ,则转化效果很差。
这同李国圣等[2 ]的观察相符 ,他们观察到愈伤组织在继代后
4～13 d 处于对数生长期 ,此时细胞分生活跃 ,容易受到农杆
菌侵染。而愈伤侵染后在无筛选剂的培养基上恢复数天 ,生
理机能可得到较好的恢复 ,抗潮霉素能力比较强。
表 1 侵染前后对外植体不同处理对抗性
愈伤出愈率的影响
Table 1 Effect of different treatments to callus before and after
transformation on the rate of resistant callus
处理
Treatment
侵染愈伤总数 (块)
Number of calli
transformed(piece)
抗性愈伤数 (块)
Number of resistant
calli (piece)
抗性愈伤率
The rate of resistant
calli
A1 59 7 11. 86 %
A2 56 0 0
B1 42 11 26. 19 %
B2 65 7 10. 77 %
　　注 :A1 - 侵染前愈伤继代 1 次 ,预培养 7～8 d ;A2 —侵染前愈伤
已经生长 22 d ;B1 —侵染后恢复 4～5 d ;B2 —侵染后直接进行筛
选。
Notes :A1 —Pre2culture the calli for 7 —8 days on fresh medium before
transformation ;A2 —The calli used had been staying on the same
medium for 22 days ;B1 —Let the calli stay on hygromycin2 free
medium for 4～5 days after transformation ;B2 —Place the calli
on selective medium directly after transformation.
2. 2. 2 　农杆菌的摇菌条件比较 　如表 2 中处理 C1、C2 所
示 ,C2 的处理效果明显优于 C1 ,可能是由于连续在含抗生素
的平板上生长 ,菌的生理状态不佳 ,在无抗生素的液体培养
基中培养 2 h 有利于其活力的恢复。同理 ,在菌液转接时 ,
采用离心后重悬的方法效果优于直接转接 (见表 2 处理 D1、
D2) ,也是由于前者避免了菌液中所含抗生素进入新鲜 YEB
液体培养基 ,影响菌的活化。
表 2 农杆菌菌液制备中的几个比较实验
Table 2 The comparison of several treatments in the preparation
of Agrobacteria suspension
处理
Treatment
菌液状态
The quality of the suspension
C1 振荡培养 16 h 后菌液较稀 ,色泽黯淡呈土黄色 ,死菌多 ,不适合侵染
C2 振荡培养 16 h 后菌液浓稠而均匀 ,呈较新鲜的金黄色 ,死菌少 ,适合侵染
D1 振荡培养 3 h 后菌液 OD600约 0. 357 ,死菌多 ,不适合侵染
D2 振荡培养 3 h 后菌液 OD600约 0. 512 ,死菌少 ,适合侵染
E1 振荡培养 4 h 后菌液 OD600约 0. 253
E2 振荡培养 4 h 后菌液 OD600约 0. 460
　　注 :C1 —第一次摇菌时抗生素和菌同时加入培养基 ; C2 —菌振
荡培养 2 h 后加入抗生素。D1 —菌液转接时以 5 %的量直接
加入到新鲜 YEB 液体培养基中。D2 —菌液转接时取同上等
量菌液离心 ,菌体沉淀重悬于新鲜 YEB 液体培养基。E1 —
乙酰丁香酮在转接的同时加入菌液 ; E2 —侵染时在菌液中加
入乙酰丁香酮。
Notes :C1 —Add antibiotic to the YEB medium at the same time when
Agrobacteria was added into it . C2 —Add antibiotic to the YEB
medium 2 hours after adding Agrobacteria into it . D1 —To subcul2
ture the Agrobacteria , add the suspension to fresh YEB liquid
medium by 5 % directly. D2 —Centrifuge the same amount of A2
grobacteria suspension and add deposition to fresh YEB liquid
medium. E1 —Add As to the medium when Agrobacteria was sub2
cultured to it . E2 —Add As to the Agrobacteria suspension at the
same time when calli were put into it .
从表 2 中处理 E1、E2 可看出 ,乙酰丁香酮加得越早 ,对
摇菌效果的负面影响越大。因为其溶剂是二甲基亚砜 ,对细
菌有毒害作用。为了不影响摇菌质量 ,我们在侵染时才在菌
液中加入乙酰丁香酮。
在 135 株 T0 代再生植株中 ,有 12 株阳性可育个体 ,迄今
已得到了它们的 T2 代种子 ,对 T1 代植株的检测筛选工作正
在进行中。
3 　讨论
农杆菌的侵染活力对转化效率影响很大 ,而对侵染活力
高低 ,目前大多只能凭借侵染时菌液 OD 值、颜色、浓度和侵
染后的转化效率来粗略推断。笔者认为如果能根据农杆菌
生理生化指标 (如菌液 pH、菌体中某种特定酶的活性等) 建
立一套能够快速、准确、定量检测农杆菌液侵染活力高低的
技术体系 ,将会极大地提高转化效率 ,缩短实验进程 ,节省大
量的人力、物力和时间。
References
[1 ] Wang G2L (王关林) ,Fang H2G(方宏进) . 植物基因工程原理与技
术. 北京 :科学出版社 ,1998. 614 —623
[2 ] Li G2S(李国圣) . The transformation of maize callus and the regeneration
of ppt ———resistant plants. Chinese Science Bulletin(科学通报) ,2000 ,
45 :2 181 —2 184
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