全 文 ：第 29 卷 第 2 期 作 物 学 报 V ol. 29, N o. 2
2003 年 3 月 315～ 320 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 315～ 320 M ar. , 2003
大麦 BYDV 抗性的印迹杂交分析α
赵彦宏1, 2 李润植1, 3 刘 征1 焦芳婵1 毛 雪1 张东旭3
(1山西农业大学农业生物工程中心, 山西太谷 030801; 2 浙江大学农业与生物技术学院, 浙江杭州 310029; 3浙江师范大学生命科学院, 浙江
金华 321004)
摘 要 大麦抗黄矮病毒 (BYDV ) 育种面临的主要困难之一, 就是常规生物学抗性检测技术不能准确地进行抗性检测
和抗性基因筛选。本文在前人的基础上, 以大麦黄矮病毒 PAV 株系和R PV 株系基因组中的特异核酸序列为探针, 应
用斑点印迹杂交分析技术, 建立了一套简单、快速、有效的BYDV 抗性检测方法和抗性基因 (Y d 2)的筛选方法; 同时也
建立了一套适用于大麦BYDV 抗性检测的较为有效的带毒蚜虫饲养和管理方法。选用了 12 个已知抗性和基因型的大
麦品种 (系)进行抗性检测, 结果证实了这一抗性检测技术体系的可靠性与有效性。
关键词 大麦; 大麦黄矮病毒; 蚜虫; Y d 2 基因; 抗性检测; 斑点印迹杂交
中图分类号: S512 文献标识码: A
D ot-blot Hybr id iza tion Ana lysis of Resistance to BYD V in Barley
ZHAO Yan2Hong1 L I R un2Zh i2, 3 L IU Zheng2 J IAO Fang2Chan1 M AO Xue2 ZHAN G Dong2Xu3
(1 Center f or A g ricultural B iotechnology of S hanx i A g riculture U niversity , T aigu 030801, China; 2 Institu te of A g riculture and B iotechnology of
Z hej iang U niversity , H angzhou 310029, China; 3 Intitu te of L if e S cience of Z hej iang N orm al U niversity , J inghua 321004, China)
Abstract O ne of the m ajo r difficulties in barley breeding resistan t to BYDV is that traditional techn iques of
bio logical resistance assays can no t perfo rm resistance assays and resistan t genes screen ing accurately. U sing
specific nucleic acids sequence derived from the genom es of BYDV 2PAV and BYDV 2R PV strain s as the p robes
and the m ethod of Do t2blo t hybridization analysis, the autho rs developed a set of simp le, quick and efficien t
m ethods on BYDV resistan t assay and screen ing of resistan t gene (Y d 2) on the basis of p recurso rs. M eanw h ile,
a system of viruliferous aph ids raising and m anagem en t w as also established. F inally, the autho rs confirm ed the
reliability and efficiency of the resistance assay system using 12 barley cultivars w ith know n resistance and
geno types.
Key words Barley; Barley yellow dw arf virus (BYDV ) ; A ph id; Y d 2 gene; R esistance assay; Do t2blo t
hybridization
大麦黄矮病毒 (Barly Yellow Dw arf V irus, 简称
BYDV ) 是由蚜虫传播的侵染大麦[ 1 ]、小麦[ 1 ]、燕
麦[ 1 ]、水稻[ 2 ]、玉米[ 2 ]和黑麦[ 3 ]等禾谷类作物及禾
本科杂草共 150 多种植物的最严重的病毒[ 4 ]。全世
界各大洲麦类作物产区 ( 50 多个国家) 均遭受
BYDV 危害, 禾谷类作物由于该病害所造成的损失
年平均为 11%～ 33% , 有些地区甚至高达 86% [ 5 ]。
防治这一病害最有效的途径就是通过抗病育种
的方法, 将抗大麦黄矮病的基因导入优良品种[ 6 ]。
在大麦中, 已发现了几个抗性基因[ 7 ] , 其中从埃塞
俄比亚大麦资源中发现的 Y d 2 基因是惟一用于育种
的抗大麦黄矮病的基因[ 8 ]。然而, 抗BYDV 育种所α 基金项目: 山西省留学归国人员科研基金项目。编号: L 980012
作者简介: 赵彦宏 (19732) , 男, 山西农业大学硕士毕业, 现为浙江大学农业与生物技术学院在读博士研究生。
3 通讯作者: 李润植, 男, 1959 年生, 博士, 教授, 山西农业大学农业生物工程中心。E2m ail: 〈yhz@ sohu. com〉, Tel: (0354) 6288374
Received on (收稿日期) : 2001211202, A ccep ted on (接受日期) : 2002203207
面临的最大困难之一是常规的生物学抗性检测方法
很难准确地测出大麦植株的抗性水平, 这就限制了
Y d 2 基因及其它抗黄矮病基因在育种中的广泛应
用。常规生物学抗性检测方法主要是通过植株的发
病症状等表现型来判断其抗性的, 易受环境条件等
因素的影响, 而且不能有效地确定蚜虫的传毒力及
病毒的交叉感染等。为克服这一困难, 人们相继建
立了酶联免疫技术 (EL ISA )、单克隆抗体、R T 2
PCR 等方法, 抗性检测的准确性有所提高, 但也存
在着技术难度大等局限性。
因此, 建立一套准确、快速、有效的抗性检测
与抗性基因筛选的方法对提高大麦抗BYDV 育种
的速度及效率尤为重要。在国外曾有人用斑点印迹
杂交分析法 (Do t2blo t hybridization analysis) 进行过
抗性检测, 但未见其详细报道。本文在前人的基础
上, 以大麦和BYDV 2PAV 株系为研究试材, 应用
斑点印迹杂交分析技术, 欲探寻一套准确、快速、
且有效的抗性检测及抗性基因型筛选的技术体系。
1 材料与方法
1. 1 材料
本文所用的大麦材料共 12 个, 其中包括 3 个
不含 Y d 2 基因的大麦品种 (系) 即 P rocto r、A tlas 和
CM ; 9 个含有 Y d 2 基因的大麦品种 (系)即A tlas68、
CM 67、 U C337、 U C566、 F rank lin、 Shannon、
Sutter、V enus 和V ixen; 在这些大麦材料中A tlas
(Y d -2 )和A tlas68 (Y d +2 ) , CM (Y d -2 ) 和CM 67 (Y d +2 )
以及 P rocto r (Y d -2 ) 和 Shannon (Y d +2 ) 为 3 对近等基
因系 (N IL S ) ; 另外, 用于繁殖病毒与蚜虫的燕麦
材料为 Stout。这些材料均由澳大利亚A delaide 大
学植物科学系 Symons 教授研究小组惠赠。
1. 2 带毒蚜虫的饲养和管理
蚜虫 (禾谷缢管蚜, R hop alosip hum p ad i) 和
BYDV 2PAV 株系均在生长培养箱中的燕麦 (S tou t)
植株上进行繁殖和保存, 昼夜温度为 22℃ö18℃,
光照为 14 höd。燕麦种在防虫网笼中的小花盆里,
3w 龄幼苗用于繁殖毒蚜。接种后 14～ 24d 时, 其上
繁殖的毒蚜, 可用于抗性检测[ 9 ]。
1. 3 大麦 BYD V 抗性的检测
当待测大麦幼苗长到 4～ 5 叶期时, 用细毛笔
接种毒蚜, 每株至少接 20 头蚜虫。接种 48h 后, 喷
施乐果杀死, 大麦植株继续生长在培养箱 (昼夜温
度为 22℃ö18℃, 光照为 14 höd) 内的防虫网笼中。
用斑点印迹杂交分析法来测定大麦植株的带毒量,
从而确定其抗性水平。
斑点印迹杂交分析所用的 2 个探针为BYDV 2
PAV 探针和BYDV 2R PV 探针, 分别来自 PAV 和
R PV 的RNA 基因组[ 10～ 12 ] , 均由澳大利亚A delaide
大学植物科学系 Symons 教授研究小组惠赠。
RNA 探针的体外转录合成及32 P 标记参见
Sam brook J. 等编著的M olecular C lon ing [ 13 ]。
大麦总核酸的提取方法见参考文献[ 14 ]。用于
斑点印迹杂交的核酸样品 , 不加RN aseA 酶 , 置
- 20℃条件下保存备用。
用于定量分析的样品调到相同浓度; 取 10 ΛL
样品点到H ybond2N + 膜 (Am ersham , U SA ) 上, 干燥
5～ 10 m in, 并用 60 M J 紫外线交联仪将核酸固定到
H ybond2N + 膜上; 用 2×SSC 冲洗 H ybond2N + 膜至
少 5 m in; 然后在杂交管内进行预杂交和杂交。
65℃下, 在预杂交液 (5 mL 变性甲醛, 2. 5 mL
20×SSC, 2. 5 mL 50×D enhardt 溶液, 1mL 1 molö
L 磷酸缓冲液 pH 6. 8, 1 mL 10% SD S, 100 ΛL 10
m gömL 鲑 精 DNA , 100 ΛL 10 m gömL 酵 母
tRNA )中至少预杂交 4h。
50 ΛL 32 P 标记的 RNA 探针先在 80℃下变性
10 m in, 很快放在冰上冰浴 5 m in, 加入到杂交管里
的反应液中, 65℃下杂交过夜。
将膜放在 2×SSC, 0. 1% SD S (室温) 中漂洗 3
次, 每次 5 m in; 然后再在 0. 1×SSC, 0. 1% SD S
(68℃)中漂洗 2 次, 每次 10 m in。
将漂洗后的杂交膜压夹在 X 胶片和磷光感应
膜间, 在室温下曝光 1～ 48h, 冲洗X 胶片; 用磷光
计直接读取磷光感应膜上各样点的放射性读数。
2 结果与分析
2. 1 带毒蚜虫的繁殖及其传毒力的测定
燕麦植株移入毒蚜网笼中 14～ 22 天时, 蚜虫
的数量达到高峰。24 天时, BYDV 在植株体内处于
相当高的水平, 表现出黄矮病的典型症状。如叶片
失绿, 出现枯斑。随着植株的迅速枯死, 蚜虫数量
逐渐减少。
分别在燕麦感染 PAV 后 14、16、18、20、22
和 24 天时取其茎叶提取总核酸, 并将其分别点样
于 H ybond2N + 膜上, 同时还点有未经BYDV 感染
的健株总核酸样点 (- ve)与被R PV 和 PAV 交叉感
染的燕麦总核酸样点 (+ ve)作为对照, 然后用 PAV
613 作 物 学 报 29 卷
探针和 R PV 探针分别与膜杂交。结果表明 (图 1) ,
除健株的核酸样点外, 其它样点均与 PAV 探针高
度杂交; 而所有样点中仅有被 PAV 和R PV 交叉感
染的核酸样点与 R PV 探针杂交。这说明, 在燕麦
上所繁殖的病毒为 PAV , 没有被 R PV 交叉污染。
也就是说, 本研究所设计的带毒蚜虫饲养系统是有
效的, 这一毒蚜繁殖系统保证了在燕麦进入毒蚜网
笼后 14～ 24d 时, 就能繁殖出大量的带有BYDV 2
PAV 的蚜虫用于接种, 而且燕麦中的病毒含量水
平很高。
图 1 用斑点印迹杂交检测经毒蚜侵染后的燕麦植株中的BYDV 2PAV
F ig. 1 Dot2blo t hybridization for the detection of BYDV 2PAV in oat p lants infected by viruliferous aphids
2. 2 不同大麦品种 (系) BYD V 抗性的检测
为了验证抗性检测系统的有效性和蚜虫的传毒
能力, 用带有BYDV 2PAV 的蚜虫侵染供试的 12 个
大麦品种 (系)。48h 后, 用乐果杀死蚜虫。待被侵
染植株继续生长 2w 时, 从其茎叶组织中提取总核
酸, 用放射性标记的BYDV 2PAV 探针进行斑点印
迹 杂交。结果表明, 所有的大麦品种 (系) 都被
BYDV 2PAV 所侵染。因此, 由这一系统所繁殖的
蚜虫都具有很高的传毒性, 能使所要鉴定的植株
100% 感染病毒 (图 2)。
图 2 斑点印迹杂交分析法检测经带毒蚜虫侵染后的
12 个大麦品种 (系)植株中的BYDV 2PAV
F ig. 2 Dot2blo t hybridization analysis for the detection
of BYDV 2PAV in 12 barley cultivars infected
by viruliferous aphids
接种结束后 4w 时, 测定染毒植株的矮化程度
和坏死程度, 并与严格控制而未被病毒感染的植株
进行比较 (表 1)。所有不含 Y d 2 基因的植株均表现
出高度的矮化和黄化。P rocto r (Y d -2 ) 表现为中等感
病, A tlas(Y d -2 )和CM (Y d -2 )表现为高度感病, 在 4
周后, 完全枯死; 而含有 Y d 2 基因的植株只表现出
轻微的症状, 如叶子发脆, 轻度矮化和出现一些枯
斑。可见, Y d +2 大麦植株和 Y d -2 大麦植株在对
BYDV 2PAV 的忍耐性上的差异非常明显。Y d +2 品
种中, 生长快的品种 (A tlas68, CM 67, U C337 和
U C566) 要比生长慢的品种 (F rank lin, Shannon,
Sutter, V enus 和V ixen)发病轻。
2. 3 斑点印迹杂交测出的放射性读数与 BYD V 病
毒量之间的关系
为了建立能够检测染毒大麦中病毒含量差异的
定量斑点印迹杂交方法, 我们应用磷光计测定斑点
印迹杂交后各样点的放射性读数, 试图通过比较放
射性读数的多少, 来分析各样品植株抗性的高低,
这就需要弄清病毒含量与放射性读数之间的关系。
在燕麦 (Stout) 被带毒蚜虫接种结束后第 14 天
时, 取其茎叶组织, 提取总核酸, 然后经过一系列
的 稀 释 , 形 成 不 同 的 浓 度 (0. 05、0. 10、0. 15、
0. 20、0. 25、0. 30、0. 35、0. 40、0. 45、0. 50 Λgö15ΛL ) ; 用探针进行斑点印迹杂交, 然后用磷光计测
出其放射性读数; 以总核酸浓度为横轴, 以放射性
读数为纵轴, 作图 (图 3)。从图中可以看出, 总核酸
浓度与放射性读数之间呈线性关系。因为病毒浓度
与总核酸浓度呈正相关, 可以认为病毒浓度与放射
7132 期 赵彦宏等: 大麦BYDV 抗性的印迹杂交分析
性读数之间也呈线性关系, 即放射性强弱能够反映
出所测样本中病毒含量高低。因此, 我们可以应用这
种技术, 定量地测出染毒大麦体内病毒量的差异。
表 1 感染 BYDV-PAV 的 12 个大麦品种抗性的表观评价
Table 1 Visual rating of 12 barley cultivars infected with BYDV-PAV
大麦品种 (系)
Barley cultivar
A tlas A tlas68 CM CM 67 P roctor Shannon F ranklin Sutter U C337 U C566 V enus V ixen
对照
Contro l
表型分级
V isual rating
1 4 1 4 2 3 3 3 4 4 3 3 5
表型分级: V isual rating:
1 完全矮化与黄化, 叶片坏死, 染毒 4 周后枯死。 Total dw arfing, comp lete yellow ing and necrosis of leaves, resultingin death 4 w eeks
after infection.
2 严重矮化, 高度黄化, 叶片上有枯斑, 不结实, 没有抗性。 Severe dw arfing, h igh degree of yellow and leaf necrosis, unable to set fertile
seed, no resistance.
3 存在矮化, 适度黄化, 叶片上枯斑较少, 能结实, 有一定抗性。 Dw arfing p resent, m ild leaf yellow and som e necrosis, fertile seed set,
m ild resistance.
4 轻度矮化, 稍微黄化, 叶片稍脆, 高抗。 Som e dw arfing, little yellow ing or necrosis, som e leaf brittleness, h igh ly resistant.
5 健株。 Health.
图 3 被BYDV 2PAV 侵染的燕麦总核浓度与
放性读数间的线性关系
F ig. 3 The linear relationsh ip betw een radioactive
counts and nucleic acid concentration from
oat p lants infected w ith BYDV 2PAV
2. 4 A tla s 和A tla s68 根与茎中 BYD V 病毒含量的
差异
用带毒的蚜虫侵染 A tlas68 ( Y d +2 ) 与 A tlas
(Y d -2 )的大麦苗各 6 株, 分别在接种结束后第 2 天、
5 天和 8 天时, 提取根与茎的总核酸, 并点样于
H ybond2N + 膜上, 用带有放射性标记的 BYDV 2
PAV 探针与之杂交。结果发现, 在接种结束后, 第
2 天, 未检测到病毒量的差异。在接种结束后第 5
天, A tlas68 (Y d +2 ) 茎中的病毒含量明显比 A tlas
(Y d -2 ) 的低 ( t 测验: P > 0. 01) , 然而, A tlas68 与
A tlas 根中的病毒含量差异更大 ( t 测验: P > 0. 01)
(图 4)。这就表明 Y d +2 品种较 Y d -2 品种含毒量低,
同时这也证实了该抗性检测方法是行之有效的。因
此, 在植株外观病症未表达之前, 就可用这种方法
确定出大麦品种的抗性来, 因为植株体内病毒含量
越低, 其品种的抗性就越高。在接种结束后第 8 天,
根与茎中病毒量的差异亦明显, 但差异程度小于第
5 天时的样品。由此可以看出, 用斑点印迹杂交分
析方法检测 Y d +2 与 Y d -2 大麦品种 (系) 的抗性时,
用根作为材料较好, 而且最好在接种结束后第 5
天, 进行抗性检测。
图 4 用定量斑点印迹杂交分析法检测抗、感病大麦
品种 (系)茎与根中的病毒含量 (接种结束后第 5 天时)
F ig. 4 Q uantitative dot2blo t m easuring virus content
of BYDV 2PAV in shoots and roots of resistant and
suscep tible varieties (5 th day after infected)
2. 5 12 个大麦品种 (系)根中 BYD V 含量的差异
用BYDV 2PAV 侵染供试的 12 个已知抗性水
平的大麦品种 (系) , 在接种结束后第 5 天, 从其根
中提取总核酸, 用分光光度计测出各自的核酸浓
度, 然后把等量的每个核酸样本点在H ybond2N + 膜
813 作 物 学 报 29 卷
上, 用放射性标记的 PAV 探针进行定量斑点印迹
杂交分析。结果表明, Y d +2 大麦品种 (系) 的放射性
水平明显低于 Y d -2 大麦品种 (系) ( t 测验: P >
0. 01) , 这就表明 Y d +2 大麦品种 (系) 的病毒含量均
比 Y d -2 大麦品种 (系)的病毒含量低。因此, 在病症
明显表现出来之前, 就可用该技术定量地测出 Y d +2
大麦品种 (系) 与 Y d -2 大麦品种 (系) 植株中病毒含
量的差异 (图 5) , 进而鉴定出品种抗性水平和 Y d 2
基因型。由此可见, 该检测方法在确定大麦对
BYDV 的抗性水平方面是很有效的。
图 5 用定量斑点印迹杂交分析方法检测 12 个大麦
品种 (系)根中的病毒含量
F ig. 5 Q uantitative dot2blo t m easuring virus content of
BYDV 2PAV in root m aterial from 12 barley cultivars
3 讨论
3. 1 带毒蚜虫饲养与管理
带毒蚜虫的饲养与繁殖是大麦BYDV 抗性检
测的一个关键环节。本文综合了前人的毒蚜饲养与
管理方法[ 9, 15～ 18 ] , 克服了其中存在的一些问题, 设
计出一套可靠且有效的带毒蚜虫饲养与管理方法。
我们认为, 繁殖毒蚜最好在生长培养箱中进行, 昼
夜温度为 22℃ö18℃, 光照为 14 höd, 在燕麦植株
放入毒蚜网笼中 14～ 24d 时, 其上的虫口密度达到
了最大, 而且蚜虫体内病毒量也达到了高峰[ 9 ]。此
时, 蚜虫传毒力最高, 可用于抗性鉴定。在鉴定时,
每株大麦苗上应至少接 20 头毒蚜, 这样既保证了
大麦的染毒率, 同时也避免了接毒的剂量影响[ 18 ]。
本文所设计的毒蚜繁殖方法的另一重要改进之处,
在于引入了斑点印迹杂交分析技术。采用该技术可
以检测蚜虫在不同时期的带毒情况与蚜虫的传毒
力。经本研究证实, 采用该蚜虫管理系统生产出的
蚜虫可使大麦的染毒率达到 100%。因此, 我们认
为这种方法是可靠且有效的。
3. 2 抗性的定量检测与 Yd 2 基因的筛选
尽管蚜虫具有较高的传毒力, 能够传染大麦植
株, 但是由于生长条件的不同和 Y d 2 基因在不同的
遗传背景下有效性的变化, 常常会影响抗性的检测
与 Y d 2 基因的筛选[ 19 ]。Catherall等[ 19 ]研究报道, 只
含有单拷贝 Y d 2 基因的大麦 (Y d +2 öY d -2 ) 在不同的
遗传背景下, 其抗性 (即 Y d 2 基因的有效性) 有所变
化, 从高抗到高感, 而且往往易与感病的大麦植株
(Y d -2 öY d -2 )混淆。正由于这些原因, 大麦BYDV 抗
性的检测和 Y d 2 基因的筛选变得更为复杂。
为了尽量避免生长环境的影响, 本文探寻到一
个既有利于大麦正常生长, 又有利于BYDV 2PAV
在大麦体内复制和诱导病症充分表达的抗性检测条
件。我们认为, 待检测的染毒大麦也应置于培养箱
中生长, 昼夜温度为 22℃ö18℃, 光照为 14 höd。
实验结果表明, 这是减少环境影响的较为理想的抗
性检测条件。
常规的生物学抗性检测, 主要是通过植株染毒
后的发病症状等表现型 (如叶片黄化度、植株矮化
度、产量和干重等) 来判断其抗性的, 易受环境等
因素的影响, 而且耗时耗力。尽管发病植株生长在
有利于诱导病状表达的条件下, 也只能是通过发病
症状对其抗性进行定性的评价, 很难精确地定量检
测, 而且也只能粗略地区分开 Y d 2 基因的抗病纯合
体 (Y d +2 öY d +2 )和不含 Y d 2 基因的感病纯合体 (Y d -2 ö
Y d -2 )。
本文将斑点印迹杂交分析技术引入了大麦
BYDV 抗性检测之中, 建立了通过测定大麦植株体
内所含病毒量的多少, 来确定大麦抗性水平的定量
斑点印迹杂交抗性检测体系。用病毒含量来确定大
麦BYDV 抗性要比用表观症状更为直接、更为准
确, 而且受外界环境的影响要相对小一些。将斑点
印迹杂交和放射性测量相结合, 测算出染毒大麦体
内的病毒含量, 最后根据病毒含量的多少定量地测
出大麦的抗性水平。
采用斑点印迹杂交分析的抗性检测方法对
A tlas68 和A tlas 根与茎中的病毒含量进行了检测,
发现 Y d +2 和 Y d -2 大麦品种 (系) 根与茎中的病毒含
量差异明显, 而且在根中的差异尤为明显。该方法
不仅能定量地测出 Y d +2 öY d +2 与 Y d -2 öY d -2 大麦材
料的抗性水平, 而且也能有效地测出 Y d +2 öY d -2 大
麦材料的抗性水平。在接种结束后第 5 天时, 就可
9132 期 赵彦宏等: 大麦BYDV 抗性的印迹杂交分析
用这种方法进行抗性检测。检测所获得的结果与先
前所采用酶联免疫检测法 (EL ISA )测出的结果相一
致。因此, 本文所发展的这种抗性检测技术是大麦
BYDV 抗性检测的一种改进, 是一种准确、快速、
有效的检测方法。
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023 作 物 学 报 29 卷