全 文 ：Vol. 30 , No. 7
pp. 697 - 699 　July , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 7 期
2004 年 7 月 　697～699 页
用微卫星标记定位小麦耐盐突变体的耐盐相关基因
王宏英　张　萃　黄占景　朱正歌　郭光艳　沈银柱 Ξ
(河北师范大学生命科学学院 ,河北石家庄 050016)
摘　要 　以小麦耐盐突变体 RH8706249 ×敏盐突变体 H8706234 (两者为“一粒传”后代) 的 F2 群体作为基因定位群体 ,结
合 BSA 法 (Bulked segregant analysis ,群分法) ,对小麦耐盐突变体的耐盐相关基因进行了微卫星分子标记定位 ,在 246 对微
卫星引物中 ,微卫星标记 Xgwm299 与耐盐相关基因连锁 ,遗传距离为 5. 8 cM ,定位于 3B 染色体的长臂。
关键词 　小麦 ;耐盐突变体 ;耐盐相关基因 ;微卫星 ;BSA
中图分类号 :S512
Mapping of Relative Salt2Tolerance Gene in Wheat Salt2Tolerant Mutant by Using
Microsatellite Marker
WANG Hong2Ying ,ZHANG Cui ,HUANG Zhan2Jing ,ZHU Zheng2Ge ,GUO Guang2Yan ,SHEN Yin2Zhu 3
( College of Life Science , Hebei Normal University , Shijiazhuang 050016 , Hebei , China)
Abstract 　In this experiment , F2 population was used as the population of mapping genes. The F2 population was derived
from the hybrids of wheat salt2tolerant mutant RH8706249 and salt2sensitive mutant H8706234 (both are derived from a sin2
gle seed) . The relative salt2tolerance gene of wheat salt2tolerant mutant was mapped by using microsatellite marker and
BSA. Among the 246 pairs of microsatellite primers , microsatellite marker Xgwm299 linked to the relative salt2tolerance
gene , the genetic distance between them is 5. 8 cM , this gene was located on the 3BL.
Key words 　Wheat ;Salt2tolerant mutant ;Relative salt2tolerance gene ;Microsatellite ;BSA
　　盐碱对作物生长有很大抑制作用 ,严重影响产
量和现代农业的发展。因而培育耐盐作物品种 ,分
离与耐盐性相关的基因具有十分重要的理论和实践
意义。河北师范大学遗传研究室利用化学诱变剂
EMS对小麦品种间杂交 F1 花药愈伤组织进行诱变
筛选后 ,已经得到了一些优良的耐盐突变体[1～3 ] ,为
定位并分离耐盐相关基因打下了基础。随着分子生
物学技术的发展 ,多种基于 DNA 多态性的遗传标记
应运而生 ,并以其独特的优越性被广泛应用于各相
关研究领域。在 DNA 分子标记中 ,微卫星标记 (mi2
crosatellite ,又称 simple sequence repeat ,SSR)因其广泛
均匀分布于整个基因组中并具有高度多态性、共显
性遗传、易于检测和重复性好等优点而倍受青睐。
目前 ,在植物中微卫星标记已被广泛应用于作物遗
传育种、基因定位等各项研究[4～8 ] 。Korzun 等[9 ]基
于微卫星标记丰富的多态性 ,认为它是进行小麦遗
传研究的理想工具。本文报道了利用微卫星标记结
合 BSA 法[10 ] (Bulked segregant analysis ,群分法) 对小
麦耐盐突变体的耐盐相关基因进行定位的结果。
1 　材料与方法
1. 1 　材料
供试材料为小麦耐盐突变体 RH8706249 (简称
49) 、敏盐突变体 H8706234 (简称 34) 及其杂交后代
F1 和 F2 群体。两突变体为濮农 3665/ 百农 3039 F1
经花药培养得到愈伤组织 ,用 EMS 诱变 ,在含 015 %
NaCl 的培养基上筛选后 ,将耐盐愈伤组织转入含
015 % NaCl 的分化培养基上所获得的再生植株同一
单粒的后代[2 ] ; RH8706249 耐盐指数 ≥113 (耐盐级
别为一级) ,H8706234 耐盐指数 ≤015 (耐盐级别为四
级) 。这两个材料经 RAPD 分析 ,按刘春宇[11 ]方法
计算 ,其遗传距离为 01000 8 cM[12 ] 。Ξ基金项目 :国家自然科学基金 (30070471)和河北省自然科学基金 (301103)资助。
作者简介 :王宏英 (1977 - ) ,女 ,硕士 ,河北保定人 ,主要从事分子生物学研究 ,现在清华大学生命科学学院工作。 3 通讯作者 :沈银柱。
Tel :031126049941252230 ,E2mail :Shenyinzhu @hotmail . com
Received(收稿日期) :2003201224 ,Accepted(接受日期) :2003208222.

112 　方法
1. 2. 1 　耐盐级别的划分 　　F2 单株在分蘖盛期采
用分株法[13 ] 一分为二 , 一半栽于盐池 (含盐
0145 %) ,一半栽于甜土池 ,前者用于观察耐盐性 ,后
者作为对照用于取样。根据 F2 单株在盐池的长势
(绿叶面积、抽穗状况、植株高度等) ,参照赵瑞堂[14 ]
的方法 ,将其划分为五个级别 ,一、二、三级为耐盐 ,
四、五级为敏盐[15 ] 。
1. 2. 2 　基因组 DNA 的提取 　　011 g 新鲜较嫩的
小麦叶片在液氮中研磨成粉末状 ,放入 115 mL 的
Eppendorf 管中 ,加 800μL Buffer[011 mol/ L Tris2Cl pH
810 ; 0105 mol/ L EDTA pH 810 ; 015 mol/ L NaCl ;
1132 %( W/ V) SDS ;23 %( V/ V ) β2mercapro ethanol ] ,
充分混匀 ,65 ℃保温 20 min ;加 250μL 预冷的 5 mol/
L KAc ,混匀 ,置冰上 5 min ;12 000 r/ min 离心 10 min ,
取上清液 ,再以同样速度离心 ,取上清液 ,加 600μL
异丙醇沉淀 DNA ,用 70 %乙醇洗 DNA ,干燥后 ,溶于
TE , - 20 ℃保存备用。
1. 2. 3 　BSA(Bulked segregant analysis) 法建池 　　选
取 RH8706249 ×H8706234 F2 群体中的最耐盐单株
(一级) 和最敏盐单株 (五级) ,分别等量混合各株
DNA ,建成 DNA 耐盐池 (T)和敏盐池 (S) 。
1. 2. 4 　微卫星扩增 　　所选引物为 RÊder 等[16 ]发
表的微卫星引物序列 ,由鼎国公司合成。在 20μL
总反应体系中 ,10 ×Buffer 2μL ;115 mmol/ L MgCl2 ;
012 mmol/ L dNTP ;0125 mmol/ L 引物 ; 1 U Taq DNA
聚合酶 ; 100 ng 模板 DNA。PCR 反应在 PTC2100TM
(Programmable Thermal Controller) 扩增仪上进行。扩
增程序为 :94 ℃4 min ;然后 94 ℃1 min ,55 ℃1 min ,
72 ℃1 min ,35 个循环 ;72 ℃10 min ,4 ℃保存。
1. 2. 5 　电泳及银染 　　采用 415 %变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳 ,恒功率 80 W。银染检测。
2 　结果与分析
2. 1 　遗传分析
F2 群体经河北省沧州市农林科学院的人工模
拟盐池 (含盐 0145 %) 鉴定。其中 ,11 株为一级 ;11
株为二级 ;33 株为三级 ;16 株为四级 ;9 株为五级。
F2 群体中耐盐株与敏盐株之比近于 3∶1 (χ2 =
11667 , P > 0110) 。
2. 2 　耐盐突变体耐盐相关基因的定位
用 246 对微卫星引物对耐盐亲本 (49) 和敏盐亲
本 (34)进行 SSR 标记筛选。其中 10 对引物的扩增
产物在两个亲本中存在多态性。在耐盐池、敏盐池
中进行 PCR 扩增进一步检测 ,结果位于 3B 染色体
上的微卫星标记 Xgwm299 在耐盐池和敏盐池之间
存在差异。差异条带的分子量大小约为 200 bp ,初
步认为 SSR 标记 Xgwm299 与小麦耐盐突变体的耐
盐相关基因连锁。
利用 Xgwm299 在 F2 群体 80 个单株中进行 PCR
扩增 ,发现绝大多数耐盐单株的带型与耐盐亲本带
型一致 ,而敏盐单株多与敏盐亲本带型一致 (图 1) 。
表明 Xgwm299 与小麦耐盐突变体的耐盐相关基因
连锁。55 个耐盐单株中 4 株为交换类型 ;在 25 个敏
盐单株中 1 株为交换类型。用 JoinMap1. 4 软件作图
分析 ,其交换值为 518 % ,即 Xgwm299 与该基因的遗
传距离为 518 cM。
3 　讨论
对该 F2 群体单株的耐盐级别统计表明 ,其耐盐
株数与敏盐株数之比符合 3∶1 (χ2 = 11667 , P >
0110) 。表明此耐盐突变体的耐盐性可能受一对主
效基因控制。
BSA 法首次被 Michlmore 等[10 ]利用并成功地筛
图 1 微卫星标记 Xgwm299 在亲本、耐盐池、敏盐池、F1 以及 F2 群体中的扩增结果
Fig. 1 Segregation of a microsatellite marker Xgwm299 linked with the salt2tolerance in F2 population
M:分子量标准 ,49 :耐盐亲本 ,34 :敏盐亲本 ,T:耐盐 DNA 池 ,S :敏盐 DNA 池 ,1～11 :一级耐盐单株 ,12～20 :敏盐单株。
M:Molecular weight marker ;49 :Salt2tolerant parent ;34 :Salt2sensitive parent ;
T:Salt2tolerant pool ;S :Salt2sensitive pool ;1 - 11 : Individuals with A grade of tolerance ;12 - 20 : Individuals with E grade of tolerance.
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选出与莴苣中霜霉菌抗性基因相连锁的标记。BSA
法排除了环境及个体因素的影响 ,使研究者把焦点
集中在植物基因组的特定区域。而在实际建池时基
因池的大小主要取决于目的区域内已定位标记位点
的密度。密度小 ,植株数可减少 ;密度大 ,植株数要
增加。另外与所用材料间遗传背景差异的大小也有
一定关系。差异大的应选 10 个以上的植株建池 ,差
异小的应选较少的植株建池。这样就可以避免建池
株数过多则多态性检出率较低 ;株数过少取样的随
机误差增大 ,多态性位点就会不真实的弊端。根据
SSR 标记在小麦染色体中的分布情况及 F2 的群体
大小 ,以及本实验中所选两个亲本为“一粒传”后代 ,
遗传背景十分接近的具体情况 ,我们分别选取 9 株
建池 ,既达到了淡化遗传背景的目的 ,又保证了检出
的多态性较为真实。
就数量性状而言 ,一般受多基因控制 ,易受环境
条件影响 ,因此田间选择效果不佳。如果用 SSR 标
记可将复杂的数量性状进行分解 ,像研究控制质量
性状的基因一样对控制数量性状的多个基因分别进
行研究。而且 ,微卫星标记呈共显性遗传 ,信息含量
高 ,在植物基因组中 50 %～80 %为重复序列 ,因此
用这一标记建立遗传连锁图也极其有效。SSR 标记
既具有 RFLP 技术结果稳定可靠、重复性好的优点 ;
又具有 RAPD 技术快速直接简便的特点。随着微卫
星标记图谱密度的增加和技术的发展 ,微卫星标记
技术将在基因定位中发挥更大的作用。
本实验采用微卫星技术结合 BSA 法筛选到 1
个与小麦耐盐突变体耐盐相关基因连锁的分子标记
Xgwm299 ,定位在 3B 染色体长臂上。Xgwm299 与耐
盐突变体的耐盐基因的遗传距离为 518 cM。
本实验中先后共筛选了 246 对微卫星引物 ,仅
有 1 对在亲本、两个池、F1 及 F2 单株中存在稳定的
差异 ,一方面说明我们所选用的亲本的遗传背景非
常接近 ,用大量引物筛选到的差异可靠性更高 ;另一
方面说明小麦中的微卫星标记尚不够密集 ,有待进
一步填补。
致 　谢 : 北京市农林科学院作物研究所分子遗传育
种研究室王立新副研究员、生物技术中心赵茂林博
士在论文的完成过程中给予了精心指导 ,在此表示
感谢 !
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