全 文 ：　　　　　　　　　　　　　
第26卷 第3期 作　物　学　报 V ol. 26, N o. 3
2000 年5月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA M ay, 2000
以成熟胚盾片作为受体的籼稻基因枪法遗传转化X
陶利珍　凌定厚
(中国科学院华南植物研究所, 广东 广州, 510650)
提　要　以水稻成熟种子的盾片用作基因枪 (PD S21000 ö H e) 轰击的外植体, 将包含 hp h 和 g us 基因的
质粒 p IL TAB227导入籼稻Basm ati21, 在靶组织轰击后8周, 获得抗性再生植株, 经点杂交和 Southern
杂交证实外源基因整合到水稻基因组, 在后代中观察到外源基因呈单一位点的孟德尔式分离。本文还
探讨了有关因子对基因瞬时表达的影响, 寻求各因子和靶组织的最佳配合。
关键词　籼稻; 转化; 成熟胚
Indica R ice Tran sforma tion by Biol isticM ethod Using Scutel lum of M a-
ture Seed Embryo a s the Explan t
TAO L i2Zhen　L IN G D ing2Hou
(S outh China Institu te of B otany , A cad em ia S inica, Guangzhou, 510650)
Abstract　Swollen in tact scutellum after germ ination of m ature seed em bryo w as used as the ex2
p lan t fo r particle bom bardm en t, the p lasm id p IL TAB227 w ith g us and hp h genes under the
CaM V 35S p romoter w as in troduced in to elite indica rice variety Basm atil. R esistan t p lan ts w ere
obtained eigh t w eek s after bom bardm en t. Do t blo t and Southern blo t of genom ic DNA of trans2
gen ic p lan ts(T 0) confirm ed the hp h gene in tegrated in rice genom e, V2 test show ed that the seg2
regation of fo reign hp h gene w as acco rdance w ith theM endelian fash ion at one locus in T 1 gener2
ation. In o rder to obtain the stable trausfo r m ation, the best com bination of differen t facto rs in2
cluding target tissues and p retreatm en t of bom bardm en t w ere investiqated by Gus transien t ex2
p ression.
Key words　 Indica rice; T ransfo rm ation; M ature em bryo
稻属栽培种的两个亚种粳稻和籼稻中, 籼稻的种植约占栽培稻面积80% 左右, 籼稻由于
再生频率低, 目前它的转化还很困难。籼稻的遗传转化有原生质体转化法[ 1 ] , 基因枪法[ 2 ] , 农
杆菌介导法[ 3 ]、电激法[ 4 ]在一些实验室已获得成功。其中基因枪法由于操作简便, 试验的重
复性好, 已成为水稻转化广泛采用的方法。用于籼稻基因枪转化的外植体已成功的有幼胚[ 2 ]、
胚性悬浮细胞系[ 5 ]和胚性愈伤[ 6 ]。本研究, 我们尝试用成熟胚的盾片作转化外植体, 旨在探
索一种简便、快速获得转基因植株的方法。
X 本文为国家自然科学基金 (3047445)、广东省自然科学基金 (940496) 及美国 Rockefeller Foundation (1994200012
02420)资助课题部分研究结果
收稿日期: 1998209225, 接收日期: 1999206217

1　材料和方法
1. 1　籼稻品种
Basm ati21 种子, 由张世平博士提供 (T he Scipp s R esearch Institu te, CA , U SA )。
1. 2　靶材料的准备
取成熟去壳的水稻种子表面灭菌后, 接种于NB 培养基 (N 6培养基大量元素和B 5培养基
微量元素及维生素组成) , 添加2, 42D 2. 0 m g ö L , 黑暗条件下培养2～ 3d 后, 种子开始萌发
(图版 É 21) , 3～ 5d 后用解剖刀将完整的膨大的盾片从胚乳上分离下来, 并切去胚芽鞘 (图版
É 23) , 平放在同样培养基的靶床中间, 准备轰击用。
1. 3　质粒载体
质粒 p IL TAB 227[ 5 ]含有 uidA (g us) 和 hp h 基因, 分别由 CaM V 35S 启动子驱动。该质粒
由D r. C laude M Fauquet 提供 (T he Scipp s R esearch Institu te, CA , U SA )。
1. 4　转化
转化试验采用 PD S21000 ö H e 基因枪 (B io2R ad 公司) , 将5 Lg 质粒DNA 包裹到金粉微粒
表面上。金粉悬浮液的制备按厂商推荐的条件, 将洗涤过的悬浮于50% 无菌甘油的3 m g 直径
1. 0 Lm 金粉悬浮液与DNA 充分混合, 加50 LL 2. 5 molö L CaC l2和20 LL 0. 1 molö L 亚精胺,
使DNA 包裹到金粉微粒表面上, 用无水乙醇洗涤一次, 重新悬浮金粉微粒于60 LL 无水乙醇
中备用。将盛靶材料的平皿置于静止屏下8 cm , 真空度25 inch H g, 可裂膜的压力范围从900
～ 1550 p si, 试验设置重复, 每3 m g 金粉悬浮液可轰击6次, 每个靶材料轰击2次。为了解不同
可裂膜压力对 g us 基因瞬时表达及靶材料成活力的影响, 取一半轰击后的靶组织作 GU S 瞬
时表达分析, 另一半靶组织检查基因的稳定转化。
1. 5　抗性愈伤组织的筛选和植株的再生
靶组织轰击后继续在NB 培养基上培养3～ 4 d, 再转入添加300 m g ö L 水解酪蛋白、
2 m g ö L、2, 42D 和30 m g ö L 潮霉素B (hygB, Calbiochem ) 的NB 筛选培养基上进行选择, 置
黑暗条件下25～ 26 ℃培养2～ 3周后, 将靶组织上新长出的愈伤, 转到含潮霉素B 50 m g ö L、
2, 42D 1. 5 m g ö L、BA 0. 5 m g ö L、0. 26% 植物凝胶固化的NB 培养基上作进一步选择, 为了
提高植株再生频率, 经过这一步选择后, 将抗性愈伤置黑暗条件下干燥处理5～ 6 h。转入NB
分化培养基, 包含300 m g ö L 水解酪蛋白, 2. 0 m g ö L BA , 0. 5 m g ö L KT , 30 g ö L 麦芽糖和50
m g ö L 潮霉素B , 4 g ö L 琼脂糖固化, 每天16 h 光照条件25～ 26 ℃培养。再生出的小植株, 转
入生根培养基, 含1 ö 2M S 无机盐成分, 30 g ö L 蔗糖, 50 m g ö L 潮霉素B , 2. 0 m g ö L 多效唑和
0. 26% 植物凝胶固化, 待苗8～ 10 cm 高时, 将植株转入土壤, 在温室或大田生长成熟。
1. 6　GUS 分析
g us 基因的组织化学分析, 根据 Jefferson 等 (1987) [ 7 ]的方法进行。靶材料轰击后48 h 进
行 g us 基因瞬时表达分析, 盾片组织呈现蓝色点, 表明 g us 基因表达。在解剖镜下统计蓝点
数。转基因植株 (T 0代)取不同器官切段进行 GU S 染色鉴定; 对 T 1代, 不同个体各剪小段叶
片进行 GU S 染色, 考察 g us 基因在后代中分离情况。
1. 7　转基因植株后代潮霉素抗性分析
转基因植株的种子 (T 1代)去壳, 无菌播种于1 ö 2 M S 培养基, 在光照条件下, 培养6d, 将
萌发的幼苗转入含50 m g ö L 潮霉素B1 ö 2M S 培养基中进行筛选, 2周后分别统计抗潮霉素和
敏感的植株数。成活的抗性植株移植于秧田, 随后定植于大田作进一步研究之用。
682　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26卷

1. 8　点杂交及 Southern 杂交分析
根据D ellapo rta 等 (1983) [ 8 ]的方法提取叶片组织的总DNA , 点杂交采用 Sam brook [ 9 ]的方
法。Southern 印迹杂交中, 每个独立转化株叶片DNA 用B am H É , H ind¸ 内切酶消化, 每一
植株酶解和未酶解的DNA 各取10 Lg 在0. 8% 琼脂糖凝胶上电泳, 2 V ö cm 电泳过夜, 然后将
DNA 转移到 positively charged 尼龙膜 (Boeh ringer M annheim )。琼脂糖酶 (Boeh ringer
M annheim ) 用作 hp h 基因探针的分离纯化, 用随机引物标记试剂盒 (P rom ega) (232P2dCT P 标
记, 进行杂交。洗膜及X 光片放射自显影根据 Sam brook (1989) [ 9 ]的方法进行。
2　试验结果
2. 1　可裂膜临界压力对 GUS 瞬时表达的影响
本研究试验了不同的可裂膜临界压力递送外源DNA 到水稻盾片后对基因瞬时表达的影
响。当用1. 0 Lm 金粉微粒按基因枪厂商推荐的条件, 包裹5 Lg DNA 到3 m g 金粉微粒表面,
g us 基因瞬时表达随着可裂膜压力的升高而得到提高 (图1) , 但是当可裂膜临界压力为1550
p si 时, 发现靶组织轰击后在筛选培养基上不能恢复生长, 几乎全部褐化, 死亡, 这表明外植
体在轰击时, 由于金粉微粒速度过高, 导致细胞以致命损伤。试验同时观察了可裂膜压力为
1100 p si和1300 p si时, 在初步筛选时靶组织的生长未见完全的抑制。
2. 2　外源D NA 不同用量对 GUS 瞬时表达的影响
为了研究导入质粒DNA 的最适用量与 g us 基因瞬时转化的关系, 本试验采用了DNA 用
量范围是0. 5～ 1. 83 Lg ö 枪, 图2显示了DNA 用量与 GU S 瞬时表达的剂量效应。当DNA 用
量为0. 83 Lg ö 枪, 轰击2次, 每盘靶材料上的蓝点数平均为1276, 当DNA 用量高于0. 83 Lg ö
枪, GU S 瞬时转化效率下降。
图1　　可裂圆片的临界压力对 GU S 瞬时表达的影响
F ig. 1　　Effect of the p ressure of Rup ture D isk on
GU S transient exp ression in scutellum tissue
图2　　质粒DNA 的不同用量对 GU S 瞬时表达的影响
F ig. 2　　Effect of DNA quantity coated to the particle
on GU S transient exp ression in scutellum tissue
2. 3　不同受体靶组织 (外植体)的 GUS 瞬时表达
试验比较了Basm ati21的幼穗、悬浮细胞系 (液体培养6周)、愈伤组织, 成熟胚的盾片作
为基因枪轰击的靶组织, 轰击后48h 分别检查 GU S 的瞬时表达 (图3)。每盘靶材料蓝点数以
盾片最高, 幼穗、愈伤组织次之, 悬浮细胞系最低。
7823期　　　　　　　　　　陶利珍等: 以成熟胚盾片作为受体的籼稻基因枪法遗传转化　　　　　　　　

图3　　不同外植体为靶组织对 GU S 瞬时表达的影响
F ig. 3　　GU S transient exp ression in different
exp lants after bom bardm ent
2. 4　盾片外植体的稳定转化
2. 4. 1　盾片外植体的转化与不同外植体的转化
效率　　在以盾片为外植体的稳定转化试验中,
基因枪轰击的DNA 用量为0. 83 Lg ö 枪, 轰击2次,
可裂膜压力为1300 p si。图版 É 22为盾片靶组织
g us 基因瞬时表达。图版 É 24显示抗性植株再生。
以盾片为外植体, 试验共获得了22株独立转化体
(表1) , 在田间生长成熟, 结实正常、可育。与非
转化株相比, 未见有植株形态或育性的异常改变。
图版 É 25显示由盾片外植体获得的正常可育转基
因植株, 图版 É 26显示了转基因植株种子 GU S 染
色情况, 在种子胚乳部分可见微弱的蓝色, 表明 g us 基因在植株不同器官的表达是有差异的。
本试验还对Basm ati21不同外植体为靶组织的转化效率进行了比较 (表1)。表1显示了Basm ati2
1的不同外植体稳定转化的结果, 当采用盾片外植体时, 每轰击100个盾片组织平均获得6个
左右抗潮霉素的转基因植株。悬浮细胞系 (液体培养6周) 作靶材料, 每轰击一个培养皿内的
悬浮细胞系可获得3. 4个抗性植株。盾片、愈伤、悬浮细胞系为受体转化效率分别为6. 03、5.
85、3. 5。对 GU S 瞬时表达仅次于盾片的幼穗, 以幼穗为外植体, 通过轰击后在选择压的作
用下, 诱导幼穗去分化, 经愈伤组织、植株再生途径和外植体直接出芽途径, 但未获得稳定
的转化体。由表1可知, 盾片外植体比愈伤的转化效率稍高, 这与 GU S 瞬时表达 (图3)结果一
致, 比悬浮细胞系转化效率明显增高。
图4　　转基因植株 (T 0代) hph 基因点杂交分析
1: 阳性对照, 质粒 p lL TAB227; 2: 阴性对照,
未转化的植株; 3～ 24: 分别表示不同的抗性植株。
F ig. 4　　Dot blo t analysis of hph gene in
transgenic p lant (T 0)
No. 1: Positive contro l, DNA from p lasm id p lL TAB227;
No. 2: negative contro l, untransform ed p lant; No. 3～ 24:
genom ic DNA from different resistant p lants.
2. 4. 2　盾片外植体的转基因植株DNA
点杂交和 Southern 杂交分析　　22个抗
H ygB 再生植株基因组DNA 点杂交都显
示了阳性杂交信号 (图4) , 对阳性转化株
进行 Southern 杂交, 检查外源 DNA 的
整合样式, 图5证实了转株基因组中 hp h
基因的存在, 未转化对照植株没有显示
杂交带。当未酶解的基因组DNA 和 hp h
探针杂交时, 在高分子量区域显示很宽
的带, 表明外源基因的整合。所分析的四
个转化体都含有2个或2个以上的杂交带,
有的含有高于1. 6 kb 杂交带, 表明外源
基因整合到基因组时, 质粒DNA 的B am H É 或H ind¸ 酶切位点发生改变。
2. 5　转基因植株在后代 (T1)的分离
试验分析了8个 T 0代转化体在 T 1代H yg r 和 GU S 性状的分离 (表2) , 转化体 (T 0代) 在田
间生长成熟, 收获其种子, 无菌播种于1 ö 2 M S 培养基, 种子萌发后5～ 6d, 剪取叶片分析
GU S 染色 (图版 É 27) , 图版 É 28显示 T 1代幼苗对潮霉素B 抗性的分离。试验结果见表2, 就
hp h 基因的表达而言, 7个株系表现3 ÷ 1 (H yg r: H ygs) 的分离比, 表明 hp h 基因的抗性遗传符
合孟德尔式的一个显性基因位点的遗传。很有趣的是B 2S24株系所有个体全部表现为抗
882　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26卷

表1　　Basmati-1不同外植体的转化效率
Table 1　　The eff ic iency of transformation of different explant
外植体
Exp lant
轰击的靶组织数a
No. of target tissue
bom bardeda
T 0植株数b
T 0 p lantsb
转化效率c
T ransform ation
efficiencyc
Scutella 365 22 6. 03
Callus 752 44 5. 85
Suspension 7 24 3. 4
Panicle 150 0
以愈伤组织作靶材料, 其数目以块计数; 悬浮细胞系作靶材料,
以培养皿为单位计数。b. 抗50 m g ö L 潮霉素B 的再生植株数。c.
靶组织是愈伤的, 转化效率指每100块愈伤再生的抗潮霉素B 植
株数; 悬浮细胞系作靶材料, 转化效率指每个培养皿内轰击的靶
组织, 再生抗潮霉素B 植株数。
a. The num ber unit of callus bom barded is designated as p iece, that
of suspension cell bom barded is designated as p late.
b. T 0 p lants resistant to hygrom ycin (50 m g ö L ).
c. T ransform ation efficiency is defined as num ber of hygrom ycin re2
sistant T 0 p lants per 100 calli o r suspension cells of per p late.
H ygB, 没有分离。
2. 6　T1植株的 Southern 杂交分析
以 Southern 杂交分析了转基因
植株B 2S26 T 1代的4个单株与原转基
因植株 (T 0) hp h 基因整合样式 (图6)。
这4个 hp h 阳性 T 1植株, 均含有1. 6
kb 的片段和2个高于1. 6 kb 的片段,
与原转化体B2S26的杂交式样一致。
只是 T 1的3个单株在高于1. 6 kb 处两
条带的杂交信号比原转化体弱, 但未
观察到这几个单株对H ygB 的抗性有
任何差异。
3　讨论
选择适当的外植体作为转化的靶
组织是获得转化成功的最重要因素之
一。基因枪法对靶材料的要求有三方
面: 第一, 必须有大量而均一的靶组织群体, 第二必须是胚性具再生能力可再生的组织, 第
三在重复继代和选择后能维持植株的再生。已经报道的用作籼稻基因枪转化的外植体有幼
图5　　转基因植株 (T 0代) hph 基因 Southern 杂交分析
1: 阳性对照, 质粒 p IL TAB227; 2: 阴性对照, 未转化
的植株; 3～ 4: 分别为未酶解和酶解的B2S22转化体
DNA ; 5～ 6: B2S217; 7～ 8: B2S21; 9～ 10: B2S23.
F ig. 5　　Southern blo t analysis of hph gene in transgenic
p lants(T 0 generation)
L ane 1: Positive contro l, DNA from p lasm id p IL TAB227;
lane 2: negative contro l, genom ic DNA from untransform ed
p lant; lane 3～ 4: undigested and digested DNA of B2S22
transform ant; lane 5～ 6: B2S217; lane 7～ 8: B2S21;
lane 9～ 10: B2S23.
图6　　转基因植株后代 (T 1) hph 基因 Southern 杂交分析
1: 阳性对照; 2: 阴性对照; 3: B2S26转基因植株;
4- 7: B2S26自交一代 (T 1) 4个单株.
F ig. 6　　Southern blo t analysis in the offsp ring
of transgenic p lant (T 1 generation)
9823期　　　　　　　　　　陶利珍等: 以成熟胚盾片作为受体的籼稻基因枪法遗传转化　　　　　　　　

胚[ 2 ]、胚性愈伤组织[ 6 ] , 胚性悬浮细胞系[ 5 ]。幼胚作靶组织的优点是可缩短培养周期, 但取材
受季节限制, 且分离幼胚费时, 操作极易受细菌污染; 愈伤可直接作为转化的受体, 在本研
究中, 愈伤组织作为靶材料, g us 基因的瞬时表达和稳定转化都很好 (图3, 表1) , 但是对于籼
稻品种的转化, 要获得足够数量, 均一性好, 再生能力强, 适于转化的愈伤组织并非容易; 悬
浮细胞系作籼稻外植体可使培养物迅速扩增, 方便于转化, 但培养周期相对较长, 且再生效
率较低, 因此可根据不同籼稻品种的特点, 选择适宜的转化受体材料。
表2　　转基因植株后代 (T1)潮霉素性状和 GUS 表达分离试验
Table 2　　Segregation of Hygr tra it and Gus expression in the progeny of transgen ic plants(T1 generation)
株系编号
No. of P lant
line
T 0代表现型
T 0 Phenotype
Hyg Gus
T 1代植株数
No. of T 1 p lant
Hygr Hygs
V2 (3 ÷ 1)
T 1代植株数
No. of T 1 p lant
Gus+ Gus2
V2 (3 ÷ 1)
B2S21 R Gus+ 23 7 0 23 7 0
B2S23 R Gus+ 24 10 0. 16 24 10 0. 16
B2S24 R Gus- 31 0 0 31
B2S26 R Gus+ 21 11 1. 04 21 11 1. 04
B2S27 R Gus- 46 11 0. 71 46 11 0. 71
B2S28 R Gus- 22 6 0. 05 0 28
B2S212 R Gus- 14 5 0. 02 0 19
B2S217 R Gus- 22 7 0. 01 0 29
　　注: 显著水平取0. 01, 0. 05时, V2值分别为3. 84和6. 63. Hygr 抗潮霉素B, Hygs: 对潮霉素B 敏感。
　　V alue of the 95% and 99% confidence level in the Chi square. Hygr: resistant to hygrom ycin B, Hygs: sensitive to hy2
grom ycin B.
本试验选择籼稻成熟胚作靶组织, 准备靶材料操作简便, 大大缩短了组培的时间, 仅需8
周就获得了抗性再生植株, 避免长时期离体培养而导致的体细胞无性系变异。本实验获得的
22株独立转化体在 T 0代及 T 1代均未观察到任何可见的变异, 这就显示了成熟胚之盾片作为
靶组织的优越性。人们已经在转基因群体中发现了体细胞无性变异引起的植株表型和性状功
能性变异, 如原生质体法获得的转基因植株中发现的育性和植株形态变异[ 10 ] , D ale 和M c2
partland [ 11 ]认为外源DNA 导入可能使值株受到三方面影响: (1) 组培诱导的变异, (2) 插入
突变, (3) 外源基因多效性。Bao 等 (1996) [ 12 ]用RA PD 方法分析来源于原生质体法的转基因
植株, 发现存在着广泛的基因组DNA 变异, 且变异是由离体培养产生, 而没有证据说明变异
是外源基因本身导致的。A rencibia 等 (1998) [ 13 ]认为直接基因转移法 (基因枪法, 电激愈伤组
织法) , 比原生质体法和农杆菌介导法较少引起植物基因组的变异, 建议人们在获得工程植
株为育种利用时, 应考虑选择适当的转化方法。同样在采用某种转化方法时, 我们也应根据
不同的试验目的考虑选择适当的外植体作为转化受体, 有若干例子表明在有的植物中采用不
同来源的外植体, 体细胞无性系变异频率不同[ 14, 15 ] , 当然很大一部分变异是离体培养时产
生, 而且随着培养时间的延长而增高[ 16 ]。
本试验发现一例 B 2S24 转化株 (见表2) , 它在 T 1代所有个体均为抗潮霉素B 的表现型,
类似的现象在H iei等 (1996) [ 17 ]报道的农杆菌介导的转化中也有报道。出现这种现象, 据推测
有二种可能: 第一种情况B 2S24是 hp h 基因的纯合体, T 0代的基因型为 hp h ö hp h, 基因枪导入
的 hp h 基因正好插入在一对同源染色体的同一位点; 第二种情况是在同一染色体上 hp h 基因
有2个插入位点, V2值 (V2测验)为1 ÷ 14, 符合预期的15 ÷ 1的分离比。
092　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26卷

参　考　文　献
1　Data S K, K Data, I Po trykus. B ioö T echnology , 1990, 8: 736～ 740
2　Christou P, Ford TL , Kofron M. B ioö T echnology , 1991, 9: 957～ 962
3　Rath id H , S Yokoi, K Toriyam a et al. P lant Cell R eports, 1996, 15: 727～ 730
4　Xu X, B L i. P lant Cell R eports, 1994, 13: 237～ 242
5　Zhang S, L ili Chen, R Q u, et al. P lant Cell R eports, 1996, 15: 465～ 469
6　L i L , R Q u, de A Kochko, et al. P lant Cell R eports, 1993, 15: 250～ 255
7　Jefferson R A. P lant M olecular B iology R eports, 1987, 5: 387～ 405
8　Dellaporta SL , J W ood, J B H icks. P lant M ol. B iol. R ep , 1993, 1: 19～ 20
9　Sam brook J, E F F ritsch, T M aniatis. M olecular C loning , Cold S p ring H arbor L aboratory P ress, 1989. 486～ 487
10　Zhang HM , H Yang, EL Rech, et al. P lant Cell R eports, 1998, 7: 379～ 384
11　Dale PJ , HC M cpartland. T heor A pp l Genet, 1992, 84: 585～ 591
12　Bao PH, S Granata, S Castiglione, et al. T ransgen R es, 1996, 5: 97～ 103
13　A rencibia A , E Gentinetta, E Cuzzoni, et al. M olecular B reed ing , 1998, 4: 99～ 109
14　A. M. V an Harten, H. Bouter, C. B roertjes, E uphy tica, 1981, 30: 1～ 8
15　K. W akasa. J ap. J . B reed ing 1979, 29: 13～ 22
16　黄百渠. 植物体细胞遗传学简明教程. 长春: 东北师范大学出版社1991. 261～ 262
17　H ier Y, T Kom ari. In: R ice Genetics ¸ , International R ice R esearch Institu te, P hilipp ines, 1996. 131～ 141
Explana tion of pla tes
1. Scutella of m ature seeds sw elled on NB m edium
2. Gus transient exp ression in scutellum tissue 48 h after bom bardm ent
3. M orphology of scutellum tissue under the stereoscop ic m icroscope 5d after inoculation
4. P lant regeneration of resistant calli
5. Norm al and fertile transgenic p lant
6. Gus staining analysis of the seeds p roduced by a transgenic p lant
7. Gus assay of leaf segm ents from the p rogeny of transgenic p lants(T 1 generation)
8. Segregation of HygR trait in the p rogeny of transgenic p lants(T 1 generation)
1923期　　　　　　　　　　陶利珍等: 以成熟胚盾片作为受体的籼稻基因枪法遗传转化