全 文 ：第 28 卷 第 3 期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 3
2002 年 5 月　 289～ 293 页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 289～ 293　M ay, 2002
应用微室饲养培养系统诱导水稻和小麦合子及早期原胚的生长Ξ
赵　洁3 　姚成义　周　嫦　杨弘远
(武汉大学生命科学学院, 植物发育生物学教育部重点实验室, 湖北武汉 430072)
摘　要　从两个水稻品种、4 种外植体来源的愈伤组织中, 筛选出幼胚愈伤组织, 通过反复继代和悬浮培养, 建立了具
旺盛分裂能力的胚性悬浮细胞系。胚性悬浮细胞为圆球形、单个或聚集成多细胞团; 细胞以多方向分裂; 并具有长期
的分裂能力。以胚性悬浮细胞系作为饲养细胞, 采用微室饲养培养系统诱导了水稻和小麦合子及授粉后 1～ 2 d 早期原
胚的生长。结果表明: 水稻合子分裂成多细胞团; 1d 原胚发育成球形胚; 2 d 原胚通过器官发生途径再生植株。小麦合
子和 2～ 8 胞原胚能分裂多次, 形成细胞团。无饲养细胞的微室培养不能诱导合子和早期原胚分裂; 且胚性悬浮细胞的
饲养效果优于小颗粒愈伤组织。
关键词　水稻; 小麦; 饲养细胞; 微室培养; 合子; 早期原胚
中图分类号: Q 94, S511　　　文献标识码: A
Growth of Zygotes and Early Proembryos in R ice and W hea t Using M icroculture
System with Feeder Cells
ZHAO J ie3 　YAO Cheng2Yi　ZHOU Chang　YAN G Hong2Yuan
(K ey L aboratory of M O E f or P lant D evelopm ental B iology , College of L if e S cience, W uhan U niversity , W uhan 430072, China)
Abstract　 In o rder to induce the grow th of zygo tes and the early p roem bryos of rice (O ry za sativa L. ) and
w heat (T riticum aestivum L. ) , an efficien t rice suspended cell line as a feeder system w as established. Fo r th is
purpose, calli w ere induced from two cultivars and four k inds of exp lan ts, i. e. an ther, young pan icle, young
em bryo and m ature em bryo. T he calli o riginated from young em bryos w ere selected as the best to build up an
em bryon ic suspended cell line w ith vigo rous division th rough con tinuous subculture and cell suspension culture.
T he em bryon ic cells w ere spherical shaped, single o r gathered in to m ulticellu lar clusters. Zygo tes and early
p roem bryos of rice and w heat 1～ 2 days after po llination w ere iso lated and inoculated in M illicell
(m icrocham ber) and co2cultivated w ith the feeder cells in Petri d ishes. Zygo tes of bo th rice and w heat could
divide in to m ulticellu lar structures. T he 12day2o ld early p roem bryos of rice w ith 4232 cells could develop in to
globular em bryos, w h ile the 22day2o ld p roem bryos could develop and regenerate p lan tlets via the w ay of
o rganogenesis. U sing suspended feeder cell system of rice, w e w ere also able to induce 2～ 8 celled p roem bryos
of w heat to divide in to m ulticellu lar structures. W ithout feeder cells, the zygo tes and early p roem bryos canno t
divide in M illicell culture. T he division frequency of 22day o ld p roem bryos in rice w as h igher in co2cultivation
w ith suspended em bryon ic feeder cells than in that w ith sm all granular calli.
Key words　O ry za sativa L. ; T riticum aestivum L. ; Feeder cell; M icroculture; Zygo te; Early p roem bryo
　　禾本科植物水稻和小麦是极为重要的粮食作
物, 其幼胚和原胚培养已获成功[ 1～ 4 ]。但更早期原
胚培养迄今仍存在困难。其难度在于: 早期原胚太
小, 难以分离, 且分离的数量有限; 培养方法欠佳,
尚难以诱导其发育。为此, 我们曾采用小滴培养法
培养水稻 2～ 4 d 原胚, 获得了再生植株[ 5 ]。但是,
该法操作较繁琐, 诱导频率偏低, 且未能诱导更小
原胚的分裂和生长。Ξ 基金项目: 国家重点基础研究发展规划项目 (“973”项目) (G1999053908) ; 国家自然科学基金项目 (39970049)。
作者简介: 赵　洁 (1959 年 6 月出生) , 女, 江苏人, 教授, 博士。研究方向: 植物发育生物学及植物细胞工程。　　3 通讯作者。
Received on (收稿日期) : 2001206204, A ccep ted on (接受日期) : 2001208223

随着植物性细胞实验系统的建立, 一些植物受
精卵 (合子) 的分离和培养技术已获成功[ 6～ 9 ]。特别
是禾谷类作物的玉米、大麦和小麦, 在国外此类研
究已成体系, 但在国内尚属空白。因此, 我们立足
亚洲地区最重要的粮食作物之一——水稻, 1998
年在国际上首次报道了我们建立的水稻卵细胞和合
子分离技术[ 10 ] , 并试图建立其合子和早期原胚的培
养技术, 以及进一步开展植物早期胚胎发育过程中
的细胞生物学、生理生化及分子生物学等方面的研
究。
本研究在分离技术[ 10 ]和原有小滴培养技术基
础上[ 5 ] , 改进方法, 并着重建立了胚性悬浮细胞系
和微室饲养培养技术, 诱导了水稻和小麦合子及授
粉后 1～ 2 d 早期原胚的离体生长和发育。这一实
验系统的建立为离体条件下研究植物早期胚胎发育
机理、建立植物合子和原胚遗传转化体系以及作物
遗传改良提供了一个良好的实验系统。
1　材料和方法
1. 1　材料
选用盆栽水稻 (O ry za sativa L. )品种春江 05 和
孝感 01 作为诱导愈伤组织和建立悬浮细胞系的材
料。选用水稻品种春江 05 和小麦 (T riticum aestivum
L. )品种鄂麦 1 号作为合子和原胚培养材料。
1. 2　取材与消毒
将幼穗、颖花和子房用 70% 乙醇消毒 0. 5 m in,
0. 1% 升汞消毒 8～ 12 m in, 无菌水清洗 3～ 4 次。
将成熟的水稻种子按上述方法消毒后, 用无菌水浸
泡 3～ 4 小时, 再消毒 1 次。
在O lympus CK2 倒置显微镜下, 用玻璃微针
从授粉后 4～ 5 d 的子房中解剖出幼胚; 1. 5 cm 长
幼穗剪成 0. 5 cm 长的切段; 从颖花中取出花药; 从
种子中剥离种胚。将上述 4 种外植体接入诱导培养
基, 以诱导愈伤组织。
1. 3　合子和原胚的分离
从授粉后 6～ 10 h 和 1～ 2 d 的子房中分离合子
及原胚, 方法按前文[ 5, 10 ]进行。分离后, 将材料接
入微室中进行培养。
1. 4　培养方法和培养基
1. 4. 1　饲养细胞系的建立　　愈伤组织诱导培养:
培养基为N 6+ 1～ 2 m göL 2, 42D + 0. 5～ 1 m göL
KT + 300 m göL 水解乳蛋白 (L H ) + 360 m göL 的 4
种氨基酸 (AA ) (谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸和甘
氨酸) + 3% 蔗糖 (S) (幼胚为 8% 麦芽糖) + 1% 琼
脂 (A ) (幼胚培养基中不加琼脂)。按常规组培方法
接种上述 4 种水稻外植体, 培养在恒温培养箱内,
25±1℃, 12 小时光照。
愈伤组织继代培养: 培养基为N 6+ 0. 5～ 1. 5
m göL 2, 42D + 0. 2～ 0. 5 m göL 62BA + 300 m göL
L H + 360 m göL 4 种AA + 3% S+ 1%A。其它培养
条件同愈伤组织诱导培养。水稻愈伤组织每 15～ 20
d 继代一次。
悬浮细胞培养: 培养基除不加琼脂外, 其他与
愈伤组织继代培养基相同。在每 50～ 60 mL 培养基
中接 4～ 5 g 愈伤组织, 置恒温摇床上振荡培养, 转
速为 160～ 180 röm in, 26±2℃, 弱光。前一个月每
3～ 5 d 更换一次新鲜培养基, 之后每 5～ 7 d 更换
一次, 并不断增加蔗糖浓度, 以提高渗透压。
1. 4. 2　合子和早期原胚的培养　　合子培养基:
Km 8p + 1. 0 m göL 2, 42D + 0. 5 m göL 62BA + 300
m göL L H + 360 m göL 4 种AA + 10% 椰乳汁 (CM )
+ 8%～ 9% (小麦)或 10%～ 11% (水稻)麦芽糖。
原胚培养基:
(1) K1 培养基: Km 8p + 1. 0 m göL 2, 42D +
1. 0 m göL 62BA + 300 m göL L H + 360 m göL 4 种
AA + 10% CM + 8% 麦芽糖。
(2) K2 培养基: Km 8p+ 1. 0 m göL NAA + 1. 0
m göL 62BA + 其它同 K1
微室饲养培养法: 将分离的合子和 1～ 2 d 早
期原胚 (游离或包裹在珠心组织内) 接入微室
(M illicell2CM P ICM 012 50 M ILL IPOR E) 中, 每一
微室含 0. 1～ 0. 2 mL 培养基, 4～ 6 个原胚; 微室置
入含 1. 0 mL 悬浮细胞的培养皿 (3. 0 cm 直径) ; 25
±1℃恒温培养箱内暗培养。微室底部为半透性薄
膜, 通过此膜, 微室内外的营养物质进行交换, 达
到饲养目的 (图 1)。水稻 2 d 原胚除采用上述方法
外, 还采用无饲养细胞培养或 0. 5～ 3 mm 大小的
愈伤组织为饲养细胞的微室饲养培养, 以作对照。
　　植株再生培养 15～ 20 d 后, 将 2 d 原胚形成的
愈伤组织转入分化培养基中, 诱导植株再生。分化
培养基为N 6+ 0. 5 m göL 62BA + 0. 2 m göL IAA +
3% S+ 1% A。其它培养条件与愈伤组织诱导培养
相同。
上述培养基 pH 值均调至 5. 8。
用 50 ΛgömL 荧光素二醋酸酯 (FDA ) 鉴定合子
和原胚的生活力。在O lympus IM T 22Petri d ish倒置
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图 1　微室饲养培养装置图解
F ig. 1　Feeder m icroculture system
显微镜下进行荧光和明视野观察并摄影。
2　结果
2. 1　水稻饲养细胞系的建立
2. 1. 1　愈伤组织诱导与继代培养　　采用水稻品
种春江 05 的 4 种外植体: 花药、幼穗、幼胚和成熟
胚, 诱导愈伤组织。结果表明, 培养 15 d 后, 各种
外植体均能形成肉眼可见的小细胞团; 然而, 细胞
形态和颜色各不相同; 诱导频率亦有差异, 分别为
13% , 35% , 100% 和 40%。其中幼胚诱导率最高,
细胞可向各方向分裂与生长; 15 d 后, 形成 1～ 2
mm 的乳白色愈伤组织。幼穗培养 15 d 后, 颖花上
出现形状不规则、浅黄色、2～ 3 mm 大小的细胞
团。另一品种孝感 01 幼穗小细胞团呈灰褐色, 诱导
频率偏低, 仅为 10%。
来源于不同外植体的细胞团经反复继代培养形
成大团愈伤组织; 3～ 5 月后, 各愈伤组织具不同的
形态特点和生长速率。其中, 幼胚和幼穗来源的愈
伤组织浅黄色、颗粒状、松散、生长速度快, 适于
悬浮培养, 因而, 将春江 05 幼穗愈伤组织、幼胚愈
伤组织 (图版É : 1) 以及孝感 01 幼穗愈伤组织分别
作为悬浮细胞培养的材料。
2. 1. 2　悬浮细胞培养　　将上述 3 种愈伤组织分
别进行悬浮培养, 表现出不同的细胞分裂特点和生
长速率, 从中筛选出春江 05 幼胚愈伤组织悬浮细
胞系。培养初期, 此细胞团大小不均匀, 有较大愈
伤组织块, 亦有呈褐色死亡的细胞团。3 个月后,
经反复继代筛选, 获得松散、均匀、淡黄色、生长
速度快的悬浮细胞系 (图版É : 2)。悬浮细胞为圆
球形胚性细胞, 单个或聚集成多细胞团, 细胞以多
方向分裂 (图版É : 3) , 反复继代培养仍保持旺盛
的分裂能力和胚胎发生能力。因此, 以此类悬浮细
胞作为饲养细胞。
春江 05 幼穗愈伤组织悬浮细胞呈团块状, 生
长稍慢, 色泽为黄褐色。孝感 01 幼穗愈伤组织悬浮
细胞松散、灰褐色、生长慢; 细胞为长形非胚性细
胞 (图版É : 4) , 多以纵向分裂, 少数横分裂和不规
则分裂。两细胞系质量欠佳, 继代数月后被淘汰。
2. 2　合子离体分裂
水稻合子在有饲养细胞的微室培养中, 第一次
分裂频率可达 50%～ 60% , 并且发育成多细胞团的
频率可达 15%～ 30%。合子培养 1～ 2 d 后, 体积减
小、胞质浓密, 并开始分裂。水稻合子一般分裂为
大小不均等的 22细胞原胚, 之后形成十字形的 42细
胞原胚, 进一步分裂为圆球形的多细胞原胚 (图版É : 5, 6)。但在无饲养细胞的微室培养中, 合子不
能分裂, 褐化死亡。
小麦合子与水稻合子一样, 在无饲养细胞的微
室培养中, 未见分裂。在有饲养细胞的微室培养
中, 小麦合子一般分裂成大小两个不均等的半圆形
的 2—细胞原胚, 或分裂成具有一个圆球形的小细
胞和一个月牙形的大细胞的 2- 细胞原胚 (图版É :
7～ 9) , 并能继续分裂。
2. 3　水稻早期原胚离体发育与植株再生
水稻授粉后 2 d 原胚约 70～ 100 Λm , 由 32 个
以上的细胞组成, 梨形、未分化 ( 图版É : 10)。我
们用悬浮细胞和小颗粒愈伤组织为饲养细胞, 以无
饲养细胞为对照组, 在微室中培养 2 d 原胚。结果
表明, 悬浮细胞的饲养效果明显高于 0. 5～ 1 mm
和 2～ 3 mm 大小的愈伤组织; 无饲养细胞的微室
培养不能诱导其生长 (表 1)。在培养 4～ 6 d 中, 2 d
原胚仍按体内胚胎发育途径继续生长, 保持原胚原
有形状 (图版É : 11, 12, 图版Ê : 13) 。之后, 多数
逐渐不规则生长, 形成愈伤组织。愈伤组织转入分
化培养基后, 一般先分化芽或芽丛, 尔后分化根,
形成完整植株 (图版Ê : 14) , 分化率可达 60%～
70%。
水稻授粉后 1 d 原胚约为 4- 32 个细胞 (图版Ê : 15, 16)。由于分离的难度, 少数原胚被包裹在
几层珠心组织内。培养 3～ 5 d 后, 4～ 8 胞原胚分
裂成多细胞团 (图版Ê : 17) ; 16～ 32 胞原胚能形成
球形胚, 并突破珠孔端的珠心组织向外生长 (图版Ê : 18, 19)。之后, 胚体大部冲出, 脱离珠心组织而
独立生长。
1923 期　　　　　　　　　赵　洁等: 应用微室饲养培养系统诱导水稻和小麦合子及早期原胚的生长　　　　　　　　　

表 1　饲养细胞对水稻 2d 原胚生长的效应
Table 1　Effect of feeder cel l on the growth
of 2 d-old proem bryos in r ice
饲养细胞
Feeder cell
接种原胚数 (个)
No. of p roem bryos
inoculated
K1 K2
原胚生长
The grow th of p roem bryos
数目 (个)
No.
频率 (% )
F requency
K1 K2 K1 K2
无
No
26 22 0 0 0 0
悬浮细胞
Suspended
cells
48 67 31 55 64. 6 82. 1
0. 5～ 1 mm
愈伤组织
Callus
64 50 24 34 37. 5 68. 0
2～ 3 mm
愈伤组织
Callus
37 44 11 27 29. 7 61. 4
2. 4　小麦早期原胚离体分裂
我们采用水稻悬浮细胞系对小麦 2～ 8 胞原胚
进行了微室饲养培养。结果表明, 在具有异种植物
悬浮细胞的微室培养中, 小麦早期原胚亦能分裂生
长。培养 1～ 2 d 后, 2～ 8 胞原胚仍保持原形, 细胞
质和细胞核更清晰可见 (图版Ê : 20) ; 2～ 4 d 后,
原胚分裂为多细胞团 (图版Ê : 21)。
3　讨论
饲养培养法早在 50 年代创立, 之后, 这一方法
逐渐受到研究者们的重视, 并广泛地用于植物原生
质体培养。采用饲养培养法一方面解决了原生质体
培养中密度低问题, 提高了原生质体植板率和植株
再生频率[ 2, 11 ]。另一方面, 与饲养细胞共培养, 使
难以培养的原生质体再生植株[ 12, 13 ]。90 年代初,
K ranz 等人把饲养培养与微室培养相结合, 首次成
功地将玉米人工合子培养成植株[ 8 ]。相继, Ho lm 等
人采用此法培养大麦和小麦的自然合子又获成
功[ 7 ]。最近, Kum lehn 等人以大麦小孢子为饲养细
胞, 首次成功地诱导小麦合子按体内正常胚胎发育
途径形成胚[ 9 ]。因此, 微室饲养培养是一种良好的
培养方法。
饲养细胞系的建立可来源于植物的多种外植
体, 如: 单核小孢子[ 7 ]、幼花药[ 14 ]、幼穗[ 14 ]、未成
熟胚[ 2, 11, 14 ]、成熟胚[ 8, 14 ]、胚轴[ 12 ]等。采用同种植
物的饲养细胞与被饲养物共培养, 均能得到良好的
效果。我们以水稻悬浮细胞作为饲养细胞, 诱导了
水稻 1～ 2 d 原胚的发育, 特别是 2 d 原胚生长频率
高达 82. 9% , 其中 70%～ 80% 能再生植株。同时,
我们采用此法进行水稻合子培养, 已初步观察到有
促进合子分裂和发育的迹象 (未发表资料)。在少数
研究中, 来源于异种植物的饲养细胞同样能促进目
的培养物的发育。W alter 和 Earle[ 13 ]用油菜悬浮细
胞饲养甘蓝和花茎甘蓝体细胞原生质体, 获得了再
生植株。小麦自然合子与大麦小孢子共培养是另一
典型的例证[ 7, 9 ]。我们用水稻悬浮细胞与小麦早期
原胚共培养, 也诱导了小麦原胚的分裂。
在饲养培养中, 除饲养细胞的来源外, 饲养细
胞的质量是培养成功与否的另一关键因素。其中,
饲养细胞分裂和分化状态直接影响被饲养物的生长
和发育。Holm 等人的实验表明[ 7 ] , 同步胚胎发育的
大麦小孢子是大麦和小麦合子发育和植株再生的理
想饲养细胞。然而, 在玉米人工合子培养中则采用
非形态发生的玉米悬浮细胞作为饲养细胞, 仍能促
进合子发育[ 15 ]。一般认为, 饲养细胞之所以能促进
被饲养物的生长, 除细胞密度[ 2, 11, 13 ]等因素外, 主
要是在细胞旺盛分裂或分化过程中产生活性物质2
生长促进因子 (Grow th2p romoting facto rs, GPF s) ,
它们是维持细胞持续分裂、生长和发育所必需
的[ 16 ]。我们的实验表明, 以 4～ 5 d 原胚为来源, 筛
选出处于旺盛分裂的胚性悬浮细胞有利于水稻早期
原胚的生长和发育。因此, 建立一个良好的饲养细
胞系是至关重要的。
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图版说明
EG: 卵细胞, GE: 球形胚, N T: 珠心组织, Z: 合子
图版É 1～ 3: 由春江 05 幼胚诱导的愈伤组织及悬浮细胞系。1. 胚性愈伤组织; 2. 胚性悬浮细胞系; 3. 胚性悬浮细胞, ×85。4. 由孝感 01
幼穗诱导的非胚性悬浮细胞, ×125. 5～ 6: 水稻合子及培养中的分裂。5. 刚分离的水稻成熟卵细胞和开花后 6h 的合子, ×600; 6. 水稻合
子培养 6 d 后分裂成多细胞球形原胚, ×450。7～ 9: 小麦合子及培养中的分裂。7. 刚分离的小麦合子, ×550; 8. 小麦合子培养 2 d 后, 分裂
为一大一小两个半圆形的 2- 胞原胚, 箭头示分裂面。×580; 9. 小麦合子培养 2 d 后, 分裂为一个小的球形和一个大的月牙形的 22胞原胚,
箭头示分裂面, ×600。10～ 12. 水稻 2 d 原胚在微室饲养培养中的生长。10. 刚分离的 2 d 原胚, ×350; 11. 培养 4 d 后, 2 d 原胚生长成球形
胚, ×200; 12. 培养 4 d 后, 2 d 原胚生长成梨形胚, ×200。
图版Ê 13～ 19: 水稻 1～ 2 d 原胚在微室饲养培养中的生长及植株再生。13. 培养 6 d 后, 2 d 原胚生长的状况, ×30; 14. 培养 1～ 2 个月后,
愈伤组织分化成植株; 15. 刚分离的 42胞原胚 (授粉后 1 d) , ×530; 16. 刚分离的多胞原胚 (授粉后 1 d) , ×450; 17. 培养 3 d 后, 42胞原胚生
长成多细胞团, ×300; 18～ 19. 培养 2 d 和 5 d 后, 1 d 的多细胞原胚生长成球形胚, 并突破珠孔端珠心组织向外生长, 18×120, 19×180。20
～ 21: 小麦二胞原胚在微室饲养培养中的生长。20. 培养 1 d 后, 22胞原胚的生长状况, 箭头示分裂面, ×550; 21. 原胚 4 d 后, 22胞原胚发育
成 42胞原胚, 箭头示分裂面, ×550。
Explana tion of pla tes
EG: Egg Cell, GE: Globular em bryo, N T: N ucellar tissue, Z: Zygote
Plate É 1～ 3: Callus and suspended cell line derived from young em bryos of rice cultivar, Chun2jiang 05. 1. Em bryonic callus; 2. Em bryonic
suspended cell line; 3. Em bryonic suspended cells, ×85; 4. Non2em bryonic suspended cells line derived from young panicle of rice cultivar’ s Xiao2
gan 01, ×125. 5～ 6: Zygotes of rice and their developm ent in culture. 5. M ature egg cell (EC) and zygote (Z) 6 h after anthesis of rice, ×600;
6. A fter 6 d of culture, zygote of rice divided into spherical m ulticellular p roem bryo, ×450. 7～ 9: Zygotes of w heat and their division in culture.
7. Zygote just iso lated from w heat, ×550. 8. A fter 2 d of culture, zygote of w heat divided into two2celled p roem bryo containing one larger half2
spherical cell and one sm aller half2spherical cell. A rrow heads indicate division p late. ×580. 9. A fter 2 d of culture, zygote of w heat divided into
two2celled p roem bryo containing one larger half2moon2shaped cell and one sm aller spherical cell. A rrow heads indicate division p late. ×600. 10～ 12.
The grow th of 22d old p roem bryos of rice in feeder culture. 10. A 22d old p roem bryo new ly iso lated from ovule, × 350; 11. 22d old p roem bryo
grew into a globular em bryo after 4 d of culture, ×200; 12. 22d old p roem bryo grew into a pear2shaped em bryo after 4 d of culture, ×200.
Plate Ê 13～ 19: The grow th and p lant regeneration of 1～ 2 d old rice p roem bryos in feeder culture. 13. The grow th of 22d old p roem bryos after
6 d of culture, ×30; 14. P lantlets regenerated after 1～ 2 months of culture; 15. Four2celled p roem bryo new ly iso lated from ovule (1 d after
po llination) , ×530; 16. M ulticellular p roem bryo new ly iso lated from ovule, ×450; 17. Four2celled p roem bryo grew into m ulticellular structure
after 3 d of culture, ×300; 18～ 19. M ulticellular p roem bryo 1 d after po llination grew into a globular em bryo after 2 and 5 d of culture, 18×120,
19×180. 20～ 21: Grow th of 22celled p roem bryo of w heat in feeder culture. 20. The grow th of 22celled p roem bryo after 1 d of culture.
A rrow heads indicate division p late. ×550; 21. Four2celled p roem bryo developed from 22celled p roem bryo after 4 d of culture. A rrow heads indicate
division p late. ×550.
3923 期　　　　　　　　　赵　洁等: 应用微室饲养培养系统诱导水稻和小麦合子及早期原胚的生长