全 文 ：Vol131 , No12
pp1 170 - 176 　Feb1 , 2005作 　物 　学 　报ACTA AGRONOMICA SINICA第 31 卷 第 2 期2005 年 2 月 　170～176 页
农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究
李桂兰1 ,2 　乔亚科1 　杨少辉2 　靳朝霞2 　李明刚2
(1 河北科技师范学院 ,河北昌黎 066600 ;2 南开大学分子生物学研究所 ,天津 300071)
摘 　要 : 直接以农杆菌转化系统为平台 ,以栽培大豆 ( Glycine max L1) 吉林 35、中黄 28、南农、铁丰 29、铁丰 30 和开育 12
的子叶节为外植体 ,用 LBA4404 农杆菌 (含 pPC2KSA 质粒)研究了影响大豆子叶节转化的因素。结果表明 ,大豆品种之间
转化存在着差异 ,吉林 35 转化率最高 ,平均转化率为 2116 % ,单次最高转化率达 6112 % ;中黄 28 次之 ,平均转化率为
119 % ,单次最高转化率达 3133 % ;南农转化率为 1105 % ;铁丰 29 居第 4 位 ,转化率为 0195 % ;铁丰 30 和开育 12 无转化植
株。用 4 d 苗龄的子叶节 ,农杆菌浸染 30 min ,共培养 3 d 比较合适。萌发培养基和不定芽诱导培养基对转化率的影响存
在交互作用 ,对于吉林 35 来说 ,大豆萌发培养基 ( G)和不定芽诱导培养基 ( Y)的最佳组配方式为 G2 + Y1(转化率 6112 %)
和 G1 + Y2 组合 (转化率 5126 %) 。农杆菌介导的转化系统中 ,转化植株的筛选方式对转化率影响很大 ,筛选培养初期 ,
采用比较低的筛选浓度 ,在继代培养过程中逐次提高筛选压力 ,可以获得较好的转化效果。
关键词 : 大豆 ; 根癌农杆菌 ; 子叶节 ; 转化
中图分类号 : S565 ,Q78
Study of the Agrobacterium2mediated Transformation Systems of Soybean Cotyle2
donary Node
LI Gui2Lan1 ,2 , QIAO Ya2Ke1 , YANG Shao2Hui2 , J IN Zhao2Xia2 , LI Ming2Gang2
(1 Hebei Normal University of Science & Technology , Changli 066600 , Hebei ; 2 Institute of Molecular Biology , Nankai University , Tianjin 300071 , China)
Abstract : Suitable soybean genetic transformation system has not been established by now1 The factors influencing
Agrobacterium2mediated soybean cotyledonary node transformation were studied in this research so as to improve the trans2
formation frequency of soybean1 The results showed that the transformation frequency was different among cultivars of soy2
bean1 Jilin 35 was the highest in transformation rate , Zhonghuang 28 was the second and followed by Nannong and Tiefeng
29 , and there was no transformed plant in Tiefeng 30 and Kaiyu 121 The average and the highest transformation rate were
2116 % and 6112 % for Jilin 35 , and 119 % and 3133 % for Zhonghuang 28 , respectively (Table 1) 1 The suitable seedling
age was about 4 days2old (Fig15) and the appropriate duration of infection and co2culture with Agrobacterium were about 30
minutes and 3 days respectively (Fig1 4) 1 There was an interaction between the germination medium and shoots regenera2
tion medium for transformation frequency1 The better combination pattern of germination medium and shoots regeneration
medium were G2 + Y1 (transformation rate was 6112 %) and G1 + Y2 (transformation rate was 5126 %) in this research
( Fig16) 1 The screening method had a significant effect on increasing the transformation frequency of the Agrobacterium2me2
diated transformation system (Table 2) 1 Kanamycin was used as a screening agent in this study1 Higher transformation rate
was obtained by using the screening model S1 which the kanamycin concentration increased gradually from 60 mgΠL to 100
mgΠL when subculture in the shoots regeneration stage1 It was suggested that the lower concentration of screening agent
should be used in the earlier screening stage , then the higher concentrations increased gradually in the later stages1
Key words : Soybean ; Agrobacterium tumefaciens ; Cotyledonary node ; Transformation
　　早在 1984 年 ,Deblock 和 Horsch 就进行了大豆
转基因研究[1 ] ,1988 年 Hinchee 首先以农杆菌介导
法获得大豆转基因植株[2 ] ,现在抗除草剂转基因大
豆虽然已经商品化 ,但大豆转化的频率仍很低 ,重复
繱基金项目 : 河北省自然科学基金 (301295) ;国家 863 资助 (2002AA213061) ;河北省科技攻关项目 ;河北科技师范学院博士基金。
作者简介 : 李桂兰 ,女 ,博士 ,教授。
Received(收稿日期) :2004203220 ,Accepted(接受日期) : 20042082221

性很差 ,到目前为止还没有建立起良好的大豆转基
因系统。
建立一个良好的组培再生系统 ,是大豆遗传转
化成功的前提。多数研究者把组培再生系统和遗传
转化系统孤立起来研究 ,一般首先对大豆子叶节组
培系统作比较详细的研究 ,然后从中选择最佳的组
培条件直接应用于农杆菌转化。但是 ,组培再生系
统和遗传转化系统在对外植体的处理上存在着很大
的差别 ,遗传转化系统中农杆菌的浸染、不定芽诱导
过程中筛选剂的抑制影响以及外植体对农杆菌的感
受时期等因素造成两种系统并不能完全统一 ,一个
良好的组培系统不一定是一个优秀的遗传转化系
统[3 ] 。因此本试验直接以转化系统为平台 ,研究影
响转化效率的多种因素 ,旨在建立一个良好的农杆
菌介导的遗传转化系统。
1 　材料和方法
111 　材料
　　选用吉林 35、中黄 28、南农、铁丰 29、铁丰 30 和
开育 12 共 6 个栽培大豆品种。工程菌为含 pPC2
KSA 质粒的 LBA4404 (本实验室构建) 。
112 　培养基
11211 　大豆种子萌发培养基 　　G1 :MS + 3 %蔗糖
+ 016 %琼脂 ; G2 :1Π2 MS + BA 110 mgΠL + 3 %蔗糖
+ 016 %琼脂。
11212 　不定芽诱导培养基　　Y1 :B5 + BA 015 mg Π
L + IBA 015 mgΠL + 3 %蔗糖 + 018 %琼脂 ; Y2 :B5 +
BA 110 mg ΠL + 3 %蔗糖 + 018 %琼脂 ; Y3 :B5 + BA
210 mg ΠL + 3 %蔗糖 + 018 %琼脂 ; Y4 :B5 + BA 410
mg ΠL + 3 %蔗糖 + 018 %琼脂。
11213 　筛选方式 　　在不同培养阶段应用不同浓
度的卡那霉素 (mgΠL) ,“[数字 ]”表示相应阶段应用
的卡那霉素浓度 (mgΠL) ,“→”表示外植体转移到相
应的培养基上。
S1 :芽诱导培养基[60 ] →[80 ] →[100 ] →芽伸长
培养基[80 ] →生根培养基[50 ] →[0 ] ;
S2 :芽诱导培养基[60 ] →[90 ] →[120 ] →芽伸长
培养基[0 ] →生根培养基[0 ] ;
S3 :芽诱导培养基 [120 ] →[150 ] →[150 ] →芽伸
长培养基[0 ] →生根培养基[0 ] ;
S4 :芽诱导培养基 [200 ] →[200 ] →[200 ] →芽伸
长培养基[0 ] →生根培养基[0 ]。
113 　方法
11311 　外植体制备 　　大豆种子消毒后接种于萌
发培养基上 ,发芽 4～10 d 后 ,选择无污染的幼苗 ,
保留 2 mm 下胚轴区域 ,沿 2 片子叶中间纵切子叶
节 ,将 2 片子叶分开 ,切去顶芽及侧芽 ,保留完整的
子叶 ,在子叶的叶腋处划 6～8 刀制造伤口 ,切好的
外植体放入培养皿中 ,备用。
11312 　菌液的准备　　挑取单菌落接种到 LB 液体
培养基中 ,27 ℃培养至 OD600为 016～018 ,转入新鲜
的 LB 培养基中 (含 20μmolΠL 的乙酰丁香酮) ,培养
至 OD600 达到 013～015 时 ,5 000 rΠmin ,4 ℃离心 10
min ,菌体重悬于和大豆不定芽诱导培养基相同的液
体培养基中 (pH 517) ,调到 OD600 为 013～014 ,加入
乙酰丁香酮至终浓度 100μmolΠL。
11313 　浸染与共培养 　　调好的菌液加入大豆子
叶节中 ,浸泡 15～60 min ,去掉菌液 ,接种于相应的不
定芽诱导培养基上 ,黑暗条件下共培养 2～4 d。
11314 　植株再生　　共培养 2～4 d 后接种于含有
不同浓度卡那霉素 (据筛选方式而定) 和 250 mgΠL
头孢霉素的不定芽诱导培养基上 ,于 24～26 ℃、14 h
光照Π10 h 黑暗条件下培养 ,15 d 继代 1 次。当芽生
长到 1 cm 时 ,转入生根培养基 ,待新根、新叶长出后
移栽入蛭石中。适当缩短光照时间至 12 h 光照Π12
h 黑暗 ,促使再生植株开花结荚。
11315 　PCR 检测 　　取卡那霉素抗性再生植株的
叶片 ,按文献[4 ]方法提取大豆基因组 DNA ,扩增无
花果曲霉植酸酶基因 phyA 。上游引物 : 5′2AT2
GTCTAGACTGGCAGTCCCCGCCTCGAGA23′, 下游引物 :
5′2CTAGGTACCCTAAGCAAAACACTCCGCCCAATC23′。
PCR 反应体系 50μL ,含大豆基因组 DNA 100 ng ,
dNTP 200μmolΠL ,上游、下游引物终浓度 1μmolΠL ,
Taq DNA 聚合酶 2 U。94 ℃预变性 5 min ;进入循环 ,
94 ℃变性 1 min ,55 ℃退火 1 min ,72 ℃延伸 115 min ,
30 个循环 ;72 ℃延伸 10 min。扩增产物于 018 %琼脂
糖凝胶电泳 ,凝胶成像系统照相。
11316 　Southern 斑点杂交　　用地高辛标记无花果
曲霉植酸酶基因 phyA 作为探针。待测大豆基因组
DNA 100 ℃水浴变性 10 min ,吸取 1μL 点膜 ,紫外照
射固定 ,杂交 ,洗膜 ,显色。
2 　结果与分析
211 　不同大豆品种农杆菌转化的差异
　　对 6 个大豆品种进行农杆菌转化 ,得到 54 株卡
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那霉素抗性植株 ,成活 39 株 ,提取基因组 DNA ,用无
花果曲霉植酸酶基因 phyA 的 1 对引物进行 PCR 扩
增 ,17 株抗性植株和阳性对照均扩增出约 114 kb 的 特异性条带 ,而阴性对照植株没有扩增出条带 (图1 ,图 2) ,对 PCR 阳性株进行 Southern 斑点杂交 ,结果显示 14 株为阳性 (图 3) 。
图 1 大豆卡那霉素抗性植株 PCR检测(南农、铁丰 29、中黄 28)
Fig11 PCR assay of Kanamycin resistance T0 plants( Nannong , Tiefeng 29 and Zhonghuang 28)
Lane 1 : the negative control untransformed plants of Nannong ; Lane 226 : Kanamycin resistance plants of Nannong ;
Lane 7 - 9 : Kanamycin resistance plants of Tiefeng29 ; Lane 10 - 17 : Kanamycin resistance plants of Zhonghuang28 ;
Lane 18 : the negative control untransformed plants of Zhonghuang 28 ;
Lane 19 : the positive control plasmid of pPC2KSA ; Lane 20 : DNA 500 ladder marker1
图 2 大豆卡那霉素抗性植株 PCR检测(吉林 35)
Fig12 PCR assay of Kanamycin resistance T0 plants( Jilin 35)
Lane 1 : DNA 500 ladder marker ; Lane 2 : the positive control plasmid of pPC2KSA ; Lane 3 : the negative control untransformed plants of Jilin 35 ;
Lane 4 - 25 : Kanamycin resistance plants of Jilin 351
表 1 不同大豆品种的转化差异
Table 1 The difference of transformation among cultivars in soybean
品种
Cultivar
外植体总数
No1 of total
explants
PCR 阳性株数
No1 of PCR
positive plants
Southern 阳性株数
No1 of southern
positive plants
转化率 3
Transformation
frequency( %)
吉林 35 Jilin 35 370 9 8 2116
中黄 28 Zhonghuang 28 211 5 4 1190
南农 Nannong 96 1 1 1105
铁丰 29 Tiefeng 29 105 2 1 0195
铁丰 30 Tiefeng 30 85 0 0 0
开育 12 Kaiyu 12 100 0 0 0
合计 Total 1 027 17 14 1136
　　注 :转化率 ( %) = Southern 杂交阳性株数Π外植体总数×100
Note :Frequency of transformation( %) = Southern positive plantsΠTotal explants ×100
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Z: 中黄 28 ; N : 南农 ; J :吉林 35 : T: 铁丰 29 ; + CK: 质粒。
Z: Zhonghuang 28; N: Nannong; J : Jilin 35: T: Tiefeng 29; + CK: plastid.
图 3 大豆 T0 PCR阳性植株 Southern 斑点杂交
Fig13 Southern blot assay of the PCR positive T0 plants
　　转化结果表明 ,吉林 35 和中黄 28 的转化率最
高 , 分别达到 2116 % 和 1190 % , 南农次之 , 为
1105 % ,铁丰 29 居第 4 位 ,为 0195 % ,铁丰 30 和开
育 12 无转化植株 (表 1) 。说明 LBA4404 农杆菌对
不同大豆品种的感染能力不同。
212 　农杆菌浸染和共培养时间对大豆子叶节转化
率的影响
　　选用大豆品种吉林 35 进行了农杆菌浸染时间
和共培养时间对转化率影响的研究 ,结果表明 ,在本
试验范围内 ,不同浸染时间条件下 ,均表现为共培养
3 d 转化率最高。农杆菌浸染时间则以 30 min 转化
率最高。共培养与浸染时间之间有互作 ,总的趋势
是浸染时间延长则共培养适宜时间缩短 (图 4) 。
图 4 农杆菌不同浸染时间和
共培养时间条件下吉林 35 的转化率
Fig14 The rate of transformation of soybean ( Jilin 35)
cotyledonary node in different duration of
infection and co2cultured with Agrobacterium
213 　幼苗苗龄对转化率的影响
4～10 d 苗龄的子叶节都能获得转化植株 ,以 4
d 苗龄最高 ,达到 3153 % ,7 d 苗龄为 1152 % ,10 d 苗
龄为 1150 %(图 5) 。
214 　萌发培养基和不定芽诱导培养基对转化率的
影响
　　以吉林 35 为材料 ,设计了 2 种大豆种子萌发培
图 5 苗龄对转化率的影响(吉林 35)
Fig15 The effect of seedling age on the
transformed rate of soybean ( Jilin 35)
转化率 = T0 southern 转化数Π外植体总数×100
Frequency of transformation = T0 southern
positive plantsΠTotal explants ×100
养基 ,4 种不定芽诱导培养基。结果表明 ,在不定芽
诱导培养基 Y1、Y2 和 Y3 (BA 浓度为 015 mgΠL、110
mgΠL 和 210 mgΠL) 上都得到了转化植株 ,在 Y4 (BA
浓度 410 mgΠL)培养基上没有得到转化植株。在 G2
萌发培养基 (BA 110 mgΠL) 上获得的子叶节 ,转接到
低浓度BA (015 mgΠL)的芽诱导培养基 ( Y1)上 ,其子
叶节的转化率高于转接到 BA 浓度高的 Y2 和 Y3 诱
导培养基上 ;而在无激素萌发培养基 G1 上获得大
豆的子叶节 ,得到相反的结果 (图 6) ,即在 BA 浓度
相对较高的芽诱导培养基上获得了较高的转化率。
大豆萌发培养基和不定芽诱导培养基的适宜组合为
G2 + Y1 和 G1 + Y2 ,转化率分别达到了 6112 %和
5126 %。
在含 BA 的萌发培养基 ( G2) 上 ,大豆幼苗的胚
轴和子叶节表现宽大 ,在以后的不定芽诱导过程中 ,
在BA 浓度高 ( Y2 , Y3 , Y4) 的培养基上 ,刺激了不
定芽的大量分化 ,单个外植体不定芽产生过多 ,有些
子叶节分化出的丛芽多达 13～17 个 ,这些芽细小 ,
不易生根 ,最终不能成活。在不含 BA 的萌发培养
基 ( G1)上获得的大豆子叶节 ,接种在 BA 含量较高
的芽诱导培养基上 ( Y2 , Y3) ,每个外植体发生不定
芽 1～2 个 ,不定芽比较健壮 ,最终成苗率达到 20 %
左右 (图 6) 。
215 　筛选方式与转化率
吉林 35 在无农杆菌浸染状态下 ,60 mgΠL 的卡
那霉素对子叶节产生明显抑制 ,不定芽的叶片黄化 ,
变小 ,出芽数明显下降 ;当卡那霉素浓度增加到 90
mgΠL 时 ,不定芽矮小、黄化 ,不定芽的诱导率仅 2 %
371　第 2 期 李桂兰等 :农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究 　　　

左右 ;卡那霉素浓度达到 120 mgΠL 时 ,不定芽无叶 ,
芽短黄化 ,芽数很少 ,不到 1 %的子叶出芽 ;卡那霉
素浓度为 150 mgΠL 时 ,几乎无芽发生。
图 6 大豆种子萌发培养基和不定芽诱导培养基对吉林 35 转化的影响
Fig16 Effect of medium of germination and shoots regeneration on the transformed frequency of Jilin 35
表 2 筛选方式对吉林 35 转化的影响
Table 2 Effect of screening modal on transformation of Jilin 35
选择方式
Screening
modal
外植体总数
Total
explants
生芽总数
Total
shoots
生芽率
Rate of
shoot ( %)
实际生根数
Real rooting
shoots
生根率
Rate of
rooting( %)
移栽成活数
Survived
plants
T0 PCR 转化数
PCR positive
plant
Southern 阳性株数
Southern
positive plants
转化率
Transformed
frequency( %)
S1 85 29 34111 12 4114 5 4 3 3153
S2 41 4 9175 3 75 1 1 1 2144
S3 109 10 9117 7 70 4 2 2 1183
S4 60 4 6167 0 0 0 0 0 0
　　注 :生芽率 ( %) = 生芽总数Π外植体总数×100
Note :Rate of shooting ( %) = Total shootsΠTotal explants ×100
　　表 2 列出了吉林 35 不同筛选方式下不定芽的
生长和转化结果 ,从中可以看出 ,吉林 35 在 4 种筛
选方式下 ,转化率差异很大。筛选方式 1 的选择压
力比较低 ,变化比较温和 ,筛选压力随时间的延长逐
渐加大 , 获得比较高的外植体生芽率 , 达到
34111 % ,这样就最大限度地保留了可能获得转化的
芽 ,随后转移到含卡那霉素 50 mgΠL 的生根培养基
上 ,筛选 20 d 后 ,将生长良好的芽继续转移到无卡
那霉素的生根培养基上 ,10 d 左右长出新根 ,本方式
获得较高的转化率 ,达到 3153 %。筛选方式 2 在低
筛选压力下 (卡那霉素 60 mgΠL) 的时间比较短 ,7 d
后外植体就转移到含卡那霉素 90 mgΠL 的芽诱导培
养基上 ,使之较早地接受高压力的筛选 ,生芽率比筛
选方式 1 明显降低 ,转化率为 2144 %。筛选方式 3
起始筛选压力比较高 ,其结果和方式 2 相似 ,转化率
为 1183 %。筛选方式 4 选用完全抑制芽分化的卡那
霉素浓度 ,芽分化受到严重抑制 ,结果没有得到转化
植株。
3 　结论与讨论
311 　结论
　　本试验直接以农杆菌转化系统为操作平台 ,以
大豆吉林 35 为主要材料对影响转化率的因素作了
研究 ,获得了比较高的转化率 ,吉林 35 平均转化率
为 2116 % ,单次最高转化率达 6112 % ,中黄 28 平均
转化率为 119 % ,单次最高转化率达 3133 %。在本
实验范围内转化率比较高的基因型是吉林 35、中黄
28 和南农。初步摸索出以下比较好的农杆菌转化
方法。总结如下 : (1)以 4 d 苗龄大豆的子叶节作外
植体 ,农杆菌液浸染 30 min ,共培养 3 d。(2) 不定芽
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诱导方式 : ①大豆预萌发培养基 MS + BA 110 mgΠL
+ 3 %蔗糖 + 016 %琼脂和不定芽诱导培养基 Y1 配
合 ; ②预萌发培养基 G1 和不定芽诱导培养基 Y2 配
合。(3)卡那霉素在不同培养阶段的浓度 (mgΠL) 选
S1 和 S2 方式。
312 　讨论
本试验中 ,以吉林 35 的转化率最高 ,大豆品种
之间转化效果不同 (表 1) 。许多关于农杆菌转化机
理的研究发现大豆一些品种对农杆菌的敏感性远远
高于其他品种 , 存在寄主基因型的特异性[5～7 ] 。
Donaldson等用农杆菌介导法对几个早熟大豆品种
的子叶节和胚性愈伤组织进行的转化研究 ,证明了
农杆菌介导的遗传转化存在菌株和寄主基因型的特
异性[8 ] 。因此寻找对农杆菌敏感、转化效率高的大
豆模式转化材料具有重要意义。
农杆菌浸染和共培养时间在农杆菌介导的转化
系统中是重要的影响因素 ,本试验中农杆菌浸染 30
min 转化率最高 ,浸染 60 min 次之 ,浸染 15 min 转化
率最低 (图 4) ,这与周思军等[9 ] 的下胚轴浸染试验
结果 (8 min 最好)间存在比较大的差异 ,可能是所用
外植体不同所致。本试验选用带一片完整子叶的子
叶节作为外植体 ,分生组织位于子叶的叶腋处 ,埋藏
较深 ,不像胚轴那样完全而直接地暴露在菌液中 ,因
此农杆菌附着到叶腋的分生组织需要比较长的时
间。胚轴和带一片完整子叶的子叶节相比 ,耐农杆
菌浸泡能力低 ,随浸泡时间的延长 ,受到的伤害加
重。因此 ,外植体不同 ,适宜的浸染时间和共培养时
间也不同。
大豆苗龄同时影响子叶节不定芽的再生能力和
对农杆菌的感受能力。在本研究中 ,大豆子叶节以
苗龄 4 d 的转化效率最高 ,随着苗龄的延长转化率
降低 (图 5) ,与其他植物中的结果相似[3 ,10 ] 。Meyer
等研究农杆菌转化机理时指出 ,转化细胞只发生在
细胞分裂的一个较短的时期内 ,因为核基因组 DNA
只有在复制时才能使外源 DNA 整合 ,所以可能只处
于细胞分裂周期的 S 期 (DNA 合成期) 才具有外源
基因的转化能力。因此 ,不同发育时期的组织细胞
的转化能力有着很大的差别 ,发育晚期的组织细胞
转化能力较差 ,发育早期的组织细胞转化能力较强。
无菌苗的年龄直接决定着组织细胞的发育时期 ,
Torres 等 (1993) 以生菜子叶为外植体转化时发现 ,
1～3 d苗龄的子叶效果最佳 ,4～5 d 苗龄的子叶未
能得到转基因株。贾士荣等 (1995) 在瓜类作物的基
因转化研究中指出 5～6 d 苗龄的子叶转化效果最
佳 ,苗龄长的子叶转化困难[10 ] 。说明不同苗龄的外
植体 ,其器官或胚胎发生的潜力不同 ,苗龄小 ,外植
体的组织分裂能力强 ,处于农杆菌转化的最佳感受
态时期。
多数研究表明 ,不定芽诱导培养基中 ,使用的激
素种类和浓度是重要因素 ,BA 对大豆不定芽的诱导
有着良好的效果[11～14 ] 。在大豆种子萌发时 ,BA 可
以刺激子叶节内源细胞分裂素的产生 ,打破顶端优
势 ,使子叶节膨大 ,促使分生组织分裂 ,形成芽的前
分生组织 ,以后的培养中 BA 浓度影响子叶节不定
芽的分化[8 ,11 ] 。但是 ,组培再生系统和基因转化系
统在对外植体的处理上存在着很大的差别 ,优秀的
组培系统不一定是优秀的转化系统[3 ] 。因此本试验
是在农杆菌转化系统中 ,大豆萌发培养基和不定芽
诱导培养基联系起来综合比较激素浓度对转化率的
影响 ,表明大豆萌发培养基和后续的诱导培养基对
转化相互影响 ,不存在孤立的最佳的大豆萌发培养
基和大豆不定芽诱导培养基 ,必须协调组配使用 ,才
能得到良好的结果。
在植物遗传转化过程中 ,转化株的筛选十分关
键。筛选压力小 ,造成过多的非转化株逃逸 ,增加后
续转化株鉴定的工作量 ;筛选压力过大 ,则导致正常
转化株也受到抑制 ,降低转化效率。因此 ,合适的筛
选剂浓度和选择方式既能有效抑制非转化细胞的生
长 ,使之缓慢死亡 ,又不影响转化细胞的正常生长。
本试验以比较低的卡那霉素筛选浓度为起点 ,随后
的选择压力逐渐加强 ,获得了较高的转化效率。从
农杆菌的转化机理来分析 ,在子叶节外植体经过农
杆菌浸染 —共培养 ,完成农杆菌附着、T2DNA 进入分
生组织细胞及整合到受体基因组的过程中 ,初期细
胞内积累的 npt2Ⅱ基因的表达产物新霉素磷酸转移
酶还比较少 ,对卡那霉素的抗性比较弱 ,此时过高的
选择压力 ,会扼杀已转化的细胞。另外 ,一个独立的
转化细胞很难分化成转化体[10 ] ,其分裂成细胞群也
要经过一段时间。较低的选择压力则既能达到抑制
非转化细胞 ,又能使转化细胞正常生长、分裂、分化。
这样经过一段时间的培养 ,转化细胞内新霉素磷酸
转移酶积累量增加 ,可以维持在一定的水平 ;一个独
立的转化细胞经过分裂形成细胞群 ,抗卡那霉素的
能力增强。此时再提高选择压力最大程度地抑制非
转化细胞的分化 ,转化细胞则正常分化形成不定芽。
由此提示 ,农杆菌转化系统中 ,选择培养阶段 ,
571　第 2 期 李桂兰等 :农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究 　　　

根据大豆本身对所用筛选剂的敏感性 ,以开始抑制
芽的生长为初始的筛选浓度 ,在继代培养过程中逐
次提高筛选压力 ,可以获得较好的转化效果。
References
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