全 文 ：第 26 卷 第 6 期 作　物　学　报 V o l. 26, N o. 6
2000 年 11 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA N ov. , 2000
玉米 S 组 CM S 胞质与正常胞质育性相关基因基于 SSP-PCR
的遗传多型性研究X
李　镭　郑用琏　张方东
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室　湖北 武汉 430070)
提　要　利用 SSP2PCR 技术对 S 组 CM S 与正常胞质线粒体胞质育性相关基因 cox É , cox ˚ 的 5′上
游、3′下游以及基因编码区与正常N 胞质进行了遗传多型性的比较研究。结果表明在所选用的 (特异
引物+ 随机引物)的引物组合中, 未能在 cox ˚ 基因的 5′上游和 3′下游区发现变异, 但其基因内含子中
存在基于 SSP2PCR 的遗传多型性。在 S 组不育系的 cox É 基因 5′上游调控区内, 由于复杂的重组事件
而导致翻译起始密码A T G 和富含A T 的核糖体结合区域的缺失。讨论了 SSP2PCR 技术作为揭示和分
析某一目的基因的遗传变异的有效性与准确性, 以及 cox É 基因在表达水平上的变异可能与玉米 S 组
CM S 育性机理相关。
关键词　玉米; CM S; cox É ; cox ˚ ; SSP2PCR; 遗传多型性
Heterogene ity Ba sed on SSP-PCR am ong Cytopla sm ic M a le Ster ile
Genes-rela ted of S Group CM S and Norma l Fertile L ine in M a ize
L IL ei　ZH EN G Yong2L ian　ZHAN G Fang2Dong
(N ationa l K ey L ab. of C rop Genetic Imp rovem en t, H uaz hong A g ricu ltu ra l U niversity , W uhan, 430070)
Abstract　　T he PCR techn ique w ith sing le specia l p rim er com b ine w ith random p rim er
(SSP2PCR ) w ere u sed to research the genet ic heterogeneity of cox É , cox ˚ am ong S2CM S
line and no rm al fert ile line in m aize. T he resu lts a re as fo llow s; N o diversity w ere found on
the 5′up stream and 3′dow n sream of the cox ˚ gene, bu t a d ifferen t m ap pat tem of SSP2
PCR have been detected on the in tron of cox ˚ ; A delet ion of A T G site of in it ia t ion codon
and a ribo som e b ind ing reg ion w h ich rich A T w ere found at the 5′up stream of cox É in S2
CM S, w h ich suggest tha t the dropp ing dow n at the tran scrip t iona l level of m RNA m aybe
co rrela ted w ith the cytop lasm ic m ale sterility. T he SSP2PCR is su itab le fo r research the
genet ic heterogeneity and in sert ion sites of t ran spo son.
Key words　　M aize; CM S; cox É ; cox ˚ ; SSP2PCR; Genet ic heterogeneity
自 1976 年L evings C S 证明玉米细胞质雄性不育 T 胞质与正常 (N ) 胞质的线粒体DNA
(m tDNA ) 之间存在明显可辩的限制性内切酶带型的差异后 (L evings C S, 1976) , 关于植物
CM S 胞质育性基因的研究便聚焦在m tDNA 的多态性上。Sisco (1985) , P ring (1987) 利用
R FL P 技术分别将 25 个 S 组CM S 胞质分类为 5 个亚组, 5 个C 组CM S 的胞质划分为 3 个亚
组。韦桂旺 (1997) 利用线粒体若干功能基因的 cDNA 探针, 建立了玉米CM S 胞质分类的技
X 国家自然科学基金课题、国家博士点基金课题资助
收稿日期: 1999208206, 接收日期: 1999212230

术体系。
玉米线粒体环状DNA 大小一般为 540 bp～ 700 bp , 并有较多能引起DNA 倒位的反向
重复序列, 和能导致大环DNA 发生缺失形成线状与亚环的正向重复序列 (N ew ton 1988)。
m tDNA 分子内和分子间的高频率重组交换事件是形成 R FL P 的主要原因。研究m tDNA 基
于 R FL P 的遗传多型性, 是胞质育性基因的证实与克隆重要的基础工作。Zabala (1997) 的研
究证明在 S 组CM S 的m tDNA 中, cox É 基因和R 区内的 orf 77 (a tp 9 基因的三个区段经重组
而形成的嵌合基因)与胞质育性基因相关。韦桂旺 (1997) 利用 cox É 、cox ˚ 基因的 cDNA 探
针对 T、C、S、N 四种胞质的R FL P 研究也证实了, S 组胞质m tDNA 中存在区别于其他胞质
的特异谱带。然而, 这些R FL P 的差异发生在什么位点? 其遗传效应是什么? 是否与胞质育
性基因相关? 目前仍未见报道。本研究根据前人对 cox É 、cox ˚ 基因的序列分析的结果, 设
计了分别可检测目标基因 5′上游、3′下游及基因编码区的特异引物, 采用单侧特异引物 PCR
(SSP2PCR ) 技术, 研究了 7 种不同胞质的 cox É 、cox ˚ 基因的结构, 旨在通过R FL P 成因的
探讨, 研究玉米 S 组CM S 胞质育性基因的分子生物学。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　试验材料　　N 胞质材料: H Z85、M o17;
S 组CM S 胞质材料: 77CM S—江、M o17CM S—唐徐、M o17CM S—W B;
C 组CM S 胞质材料: M o17CM S—EL ;
T 组CM S 胞质材料: M o17CM S—T。
1. 1. 2　特异引物设计　　特异引物序列靶位点的确定, 原则上尽可能选取靠外侧的保守序
列, 并且 3′端的第一个碱基多选择位于密码子的第一或第二个碱基, 以增强保守性。引物序
列采用 PR IM ER D ES IGN ER 软件 (V ersion 1. 01, Scien t if ic & Educat iona l Co. 版权所有) 确
定。引物由上海生工公司合成。
cox É 基因序列查自 Peter G. Isaac (1985)
P1 (扩增 5′上游) 5′CCT GCAA T GGCA CCGAA GA T 3′位于 cox É 63 bp
P2 (扩增 3′下游) 5′T TA TCCA GA T GCT TA CGCCG 3′位于 cox É 1352 bp
cox ˚ 基因序列查自 T hom as D Fox (1981)
P3 (扩增 5′上游) 5′CA TCA TA GGT GT T GCT GCGT 3′位于 cox ˚ 122 bp
P4 (扩增 3′上游) 5′TA CTA CCGT GGT T GT T GCCA 3′位于 cox ˚ 809 bp
P5 (扩增 3′下游) 5′T GT GA T GCT GTA CCT GGTCG 3′位于 cox ˚ 1451 bp 距终止密码
150 bp
1. 1. 3　随机引物　　10 m er 随机引物购自美国Operon 公司。
1. 2　方法
1. 2. 1　m tDNA 的提取、纯化　　参考L evings¸ (1976)法, 略有修改。
1. 2. 2　m tDNA 的 SSP2PCR 分析　　25 LL 总反应体积中, 含 10 倍 PCR 缓冲液 2. 5 LL 0. 2
LL dN T P s 混合液 (每 dN T P 25 Lm o lö L ) , 特异引物 (10 Lm o lö L ) 1. 25 Lm o lö L , 随机引物 (10
Lm o lö L ) 1. 25 Lm o lö L , M gC l2 (25 Lm o lö L , 20Lm o lö L , 模板DNA 25～ 50 ng T aq DNA 聚合
酶 (5U ö LL ) 0. 3 LL. SSP2PCR 反应程序为: 94℃, 2 m in; 94℃, 30s; 50℃, 30s; 72℃ 30s,
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反应 5 周期; 94℃, 30s; 50℃, 30s; 72℃, 30s; 94℃, 30s; 50℃, 30s; 72℃, 45s; 94℃,
30s; 43℃, 30s; 72℃, 45s, 反应 15 周期; 72℃, 5 m in, 反应 1 周期, 4℃保存。
1. 2. 3　PCR 片断回收　　采用北京原平皓生物技术公司 DNA 快速纯化回收试剂盒
(PU R IGEN E)
1. 2. 4　PCR 片断克隆　　采用 P rom ega pGEM 2T V ecto r System s 试剂盒。参照 J.
Sam b rook 方法 (M o lecu lar C lon ing 2nded1989)
1. 2. 5　DNA 片断序列分析　　在 Perk in E lm er 公司AB I P rism 377 序列分析仪上进行。
2　结果与分析
2. 1　cox ˚ 基因基于 SSP-PCR 的遗传多型性
选用锚定 cox ˚ 基因 5′端距翻译起始密码 122 bp 处, 向上游扩增 cox ˚ 基因表达调控区
的 P3 特异引物, 3′端 1451 bp 处 (距翻译终止密码—150 bp ) , 向下游扩增 cox ˚ 基因拖尾序
列区的 P5 特异引物, 分别与随机引物搭配成引物组合, 对 7 种不同胞质来源的CM S 材料进
行基于 SSP2PCR 遗传多型性研究。
图 1 (A ) 结果显示了在 P3+ O 06 的 SSP2PCR 反应中, 各类供试材料均能扩增出一条约
300 bp 的DNA 片断, O 06 单引物的结果证明它不是由随机引物扩增的RA PD 产物。表明在
cox ˚ 基因的 5′端, 包括基因表达的调控区 (或引导区)在内没有发生大片断的分子重组事件。
图 1　　cox ˚ 基因 5′上游, 3′下游区域基于 SSP2PCR 的图谱
A. P3+ O 06 的 SSP2PCR 图谱。1、3、5、7、9、11、13 分别为M o17CM S2T、M o17CM S2EL、M o17CM S2WB、
M o17CM S—唐徐、77CM S—江、M o17、H Z85 的m tDNA 被O 06 单随机引物扩增的结果。2、4、6、8、
10、12、14 分别为以上试材的m tDNA 被 P3+ O 06 引物组合扩增的结果。B. P5+ U 04 的 SSP2PCR
图谱。各试材序号同 (A )。1、3、5、7、9、11、13 为被U 04 单随机引物的扩增结果,
2、4、6、8、10、12、14 为 P5+ U 04 引物组合的扩增结果。
F ig. 1　　P rofile of amp lified p roducts w ith SSP2PCR on the 5′up stream , 3′dow nstream of cox ˚
A. patterns of the SSP2PCR w ith P3+ O 06. 1、3、5、7、9、11、13 rep resen tation the M o17CM S2T、M o17CM S2EL、
M o17CM S2WB、M o17CM S2T angxu、77CM S2J iang、M o17、H Z85 m tDNA amp lified only by O 06 random p rim er,
respectively. and the 2、4、6、8、10、12、14 rep resen tation m tDNA , w h ich o rder as above2m entioned, amp lified
w ith P3+ O 06. B. patterns of the SSP2PC w ith P5+ U 04. 1、3、5、7、9、11、13 rep resen tation the patterns of
the m tDNA amp lified by the U 04 only, and 2、4、6、8、10、12、14 rep resen tation the patterns of
the m tDNA amp lified by the P5+ U 04, the m aterials o rder as sam e as (A )
3866 期　　　　　　　　李　镭等: 玉米 S 组CM S 胞质与正常胞质育性相关基因　　　　　　　　　　　　

图 1 (B ) 结果同样表明, P4+ U 04 的 SSP2PCR 反应在各供试材料的 cox ˚ 基因的 3′端下游,
均能扩增产生 300 bp、400 bp 的两条相同DNA 片断。拖尾序列中也没有重组事件发生。
图 2　　cox ˚ 基因编码区
基于 (P4+ U 08)引物组合的
SSP2PCR 图谱
1. 77CM S—江; 2. H Z85
F ig. 2　SSP2PCR pattern amp li2
fied by the (P4+ U 08) p rim er
on coding region of cox ˚
1, 77CM S2J iang; 2. H Z85
　　选用锚定 cox ˚ 基因 809 bp 处, 向下游扩增的特定引物 P4,
对N 与 S 组的 4 种胞质进行 SSP2PCR 反应。图 2 结果表明, P4+
U 08 的 SSP2PCR 反应揭示了N 与 S 胞质间, 在 1200 bp 左右的位
点上存在突变, cox ˚ 基因是单子叶植物线粒体中目前所知唯一仅
具一个内含子的基因。查询比较 cox ˚ 基因序列 (T hom as D F
1981) , 发现该突变区域正处在内含子中。
2. 2　cox É 基因基于 SSP-PCR 的遗传多型性
选用锚定 cox É 基因 3′端下游 1352 bp 处的特异引物 P2 与
X08、Y03 随机引物的 SSP2PCR 反应, 在N 与 S 胞质间未能检测
到多态性差异 (图 3)。
选用 P1 特异引物可检测 cox É 基因自 63 bp , 向 5′上游的表
达调控区的遗传变异。图 4 显示了 P1 与 F11、N 13 等 2 种随机引
物的 SSP2PCR 图谱, 结果表明N 胞质m tDNA 仅扩增一条 300
bp 带纹, 而 S 胞质扩增出阶梯式的 4 条带纹。
当回收分子量最大的DNA 片断以相同条件进行 SSP2PCR 反应, 仍可得到 4 条相同的扩
增带纹, 推测该区域存在重复序列, 其结构特点有待进一步的序列分析证实。单一随机引物
在与 SSP2PCR 反应相同条件下未能扩增出任何产物, 表明这些扩增带纹不是RA PD 产物。
图 3　　cox É 基因 3′端下游 SSP2PCR 图谱
1. 77CM S—江 (X08) ; 2. 77CM S—江 (P2+
X08) ; 3. H Z85 (X08) ; 4. H Z85 (P2+ X08) ;
5. 77CM S—江 (Y03) ; 6. 77CM S—江 (P2+
Y03) ; 7. H Z85 (Y03) ; 8. H Z85 (P2+ Y03)
F ig. 3　　SSP2PCR pattern of the 3′
dow nstream of cox É
1. 77CM S—J iang (X08) ; 2. 77CM S—J iang
(P2+ X08) ; 3. H Z85 (X08) ; 4. H Z85
(P2+ X08) ; 5. 77CM S—J iang (Y03) ;
6. 77CM S—J iang (P2+ Y03) ; 7. H Z85
(Y03) ; 8. H Z85 (P2+ Y03)
　　将N 与 S 胞质中分子量相同的最小扩增产物回收,
克隆, 并于AB I PR ISM 377 序列分析仪上进行测序。
部分结果列于图 5。H Z85 正常胞质克隆片断的测序结
果与 Peter G P 1985 年报道的 cox É 序列相同, 该克隆
片断的 3′末端为A T G 起始密码下游第 63 bp 后的 P1
特异引物靶位点。当与江CM S277 的克隆片断比较时发
现, (1) 存在四处同源序列, 这表明该克隆片断与来自
H Z85 的克隆片断同为 cox É 上游 SSP2PCR 扩增的等位
片断; (2) 而两克隆片断序列间较大的差异表明, 江
CM S277 cox É 基因上游调控区的变异, 是正常N 胞质
中发生了较为复杂的重组事件, 从而导致翻译起始
A T G, 与核糖体结合的富含A T 的区域的缺失, 及 P1
引物靶序列的部分改变。
3　讨论
3. 1　S 组CM S 的育性相关基因
植物线粒体环状DNA 分子中存在较多的正向、反
向的重复序列, 它们之间往往会因同源重组事件, 而使
线粒体 DNA 分别发生缺失而形成亚环状分子, 或倒位而使结构基因的排列次序改变
(N ew ton 1988)。较多的研究表明, 在玉米线粒体DNA 分子中, 至少含有 7 套不同方向的重
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图 4　　cox É 基因 5′上游基于 SSP2PCR 图谱
1. 77CM S—江 (N 13) ; 2. 77CM S—江 (P1+ N 13) ;
3. H Z85 (N 13) ; 4. H Z85 (P1+ N 13) ;
5. 77CM S—江 (F11) ; 6. 77CM S—江 (P1+ F11) ;
7. H Z85 (F11) ; 8. H Z85 (P1+ F11)
F ig. 4　　SSP2PCR pattern on 5′up stream of cox É
1. 77CM S—J iang (N 13) ; 2. 77CM S—J iang (P1+ N 1) ;
3. H Z85 (N 13) ; 4. H Z85 (P1+ N 13) ;
5. 77CM S—J iang (F11) ; 6. 77CM S—J iang (P1+ F11) ;
7. H Z85 (F11) ; 8. H Z85 (P1+ F11)
复序列 (F rago so 1989) , 特别是 S 组 CM S 材料
的线粒体DNA 中存在 S1、S2 线状类质粒分子,
其两端的 IR 序列与线粒体主DNA 分子的 D2D′,
7 27 ′区域具有较高的同源性, 重组交换将导致
线状DNA 的产生 (L evings 1983)。cox É , cox
˚ , cob, a tp 6, a tp 9 等功能基因的重组而形成新
的 orf 或 u rf 的嵌合基因, 在玉米、水稻、油菜、
高粱、向日葵等CM S 材料中都有大量的证实与
报道 (L aughnan 1983)。其中除玉米 T 型 CM S
的 orf 13 与胞质育性基因的关系已有部分的间接
证据和推测外 (D ew ey 1991) , 其他线粒体嵌合
基因与CM S 形成机理还有待进一步的研究与证
实。
S 组胞质是玉米CM S 中最大的一个类别,
图 5　　N 胞质与 S 组CM S 线粒体 cox É 基因 5′上游表达调控区核苷酸序列比较
(1) 可育胞质 cox É (Peter G I 1985) ; (2) H Z85; (3) S 胞质 77CM S—江
阴影字母为同源序列; 框格内字母为翻译起始密码; 箭头为转录起始位点; 虚线指示特异引物靶位点
F ig. 5　　N ucleo tide sequence comparison of 5′up stream of cox É from + 63 bp in H Z85 w ith the J iang CM S277
(1) cox É from Peter G. I. 1985; (2) fert ile cytop lasm of H Z85; (3) S cytop lasm of 77 CM S2J iang
the shadow is homo logy sequence; the boxed sequence is translat ion in it iat ion codon; the transcrip tion
start ing site by arrow; underlined sequence show the target site fo r single special p rim er b inding
Sisco (1985)根据R FL P 图谱将 S 组胞质划分为 5 个亚组。但关于亚组划分的遗传实质和遗传
效应至今未见报道。Zabala (1997) 的研究表明, 由于 S1, S2 与 D2D′, 7 27 ′区域间的重组, 使
a tp 9 的三个区段嵌合而形成 orf 77 并与 cox É 毗邻。推测该重组区域与胞质育性基因相关。
5866 期　　　　　　　　李　镭等: 玉米 S 组CM S 胞质与正常胞质育性相关基因　　　　　　　　　　　　

本研究采用 SSP2PCR 扩增与差异片断克隆和序列分析, 证明在江CM S277 的线粒体DNA 中
cox É 基因的表达调控区, 因复杂的重组事件而导致翻译起始密码A T G 及与核糖体结合位点
的缺失。但重组片断来自何处, 经上网查询, 未能从 GenBank 中得到确切证实, 推测可能来
自未被收录的非结构基因序列。由于 SSP2PCR 所能扩增检测的长度限制, P2+ X08, P2+
Y03 的 SSP2PCR 检测未能涉及到 3′端与 orf 77 的连锁区域。作者近期的研究 (结果待发表)
发现在 S 组CM S 成员 J 胞质中 orf 77 的结构与 Zabala 的发现完全相同, 但 orf 77 与 cox ˚ 基
因处于同一个 con t ig 内 (重叠群) , 表明 S 组CM S 的不同胞质亚组材料中, 虽具有共同的与
Rf 3 核育性基因对应的胞质育性基因 (可能为包含 orf 77 在内的嵌合基因) , 但基因形成的重
组方式, 基因的结构组成差异可能是胞质亚组基因的遗传本质。
3. 2　单侧特异引物 PCR (SSP-PCR)技术的应用
以R FL P 和以 PCR 为基础的分子标记技术在揭示等位区域的遗传多型性方面已取得了
巨大的成就。但对R FL P 的成因, 变异发生的位点及遗传效应的研究, 需进一步按基因组学
的研究策略通过构建文库、分离克隆、序列分析等展开。植物线粒体基因组不具有核基因孟
德尔式的遗传分离方式, 其DNA 分子大小从 200 kb 到 2500 kb, 尽管与核基因组比较相对
要小, 但通过全序列的分析来研究某一功能基因的结构与变异, 无论在经费与技术上, 目前
仍是较为困难的。本研究在前人关于玉米CM S 相关基因的 R FL P 多型性的研究基础上, 利
用生物信息学的最新成就, 通过对 cox É , cox ˚ 目标基因的上网查询, 设计特异锚定引物,
与随机引物组合的单侧特异引物 PCR (SSP2PCR ) , 仅对 S 组CM S 材料与正常胞质材料进行
目标基因编码区及 5′端上游、3′端下游调控区的遗传多型性的比较研究, 并对差异扩增的片
断进行克隆与序列分析, 旨在探讨利用 SSP2PCR 方法研究玉米 S 组CM S cox É , cox ˚ 基因
的R FL P 的成因与遗传变异。SSP2PCR 是建立在生物信息学的基础上, 利用锚定引物定位扩
增目标区域, 通过随机引物寻找突变位点, 差异片断的克隆和序列分析的研究技术。它可用
于特定基因的遗传多型性的研究、用于转座子插入位点多型性的研究、用于基于突变基因的
功能研究等, 特别是对非孟德尔式遗传的基因组分析更具有高效、经济的优点。
参　考　文　献
1　韦桂旺, 郑用琏, 张德华等. 遗传学报, 1997, 24 (1) : 66～ 77
2　D ew ey R C, D H T imo thy, C S L evings, Cu rr. Genet. , 1991, 20: 475～ 482
3　Fo rago so L L , S E N icho ls, C S L evings, Genom e, 1989, 31: 160～ 168
4　L aughnan J R , S Gabay2L aughnan, A nn. R ev. Genet. , 1983, 17: 27～ 48
5　L evings C S, D R P ring, S cience, 1976, 193: 158～ 169
6　L evings C S, R R Sedo roff, P roc. N atl. A cad. S ci. , 1983, 80: 4055～ 4059
7　N ew ton J D , A nn. R ev. P lan t P hy siol. P lan t M ol. B iol. , 1988, 39: 503～ 532
8　Peter G Isaac, P Jones V alerie, J L ever Ch ristopher, EM B O jou rna l, 1985, 4 (7) : 1617～ 1623
9　Sisco P H , V E Gracen, H L Everett et al. T heor A pp l Genet, 1985, 71: 5～ 19
10　T hom as D Fox, J L eaver Ch ristopher, Cell, 1981, N ov. 26: 315～ 323
11　Zabala G, S Gabay2L aughnan, J R L aughnan, Genetics, 1997, 147: 847～ 860
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