全 文 ：第 26 卷 第 6 期 作　物　学　报 V o l. 26, N o. 6
2000 年 11 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA N ov. , 2000
通过直接引入外源D NA 育成高产、优质、高蛋白大豆新品种
黑生 101X
雷勃钧1　钱　华1　李希臣1　卢翠华1　周思君1　韩玉琴1　刘昭军1
刘广阳2　杨兴勇2　董全中2　赵　凯2　赫世涛2
(1黑龙江省农业科学院生物技术研究中心, 黑龙江省哈尔滨 150086; 2 黑龙江省农业科学院克山小麦研究所, 黑龙江省克
山 161606)
提　要　本文报道了利用花粉管通道技术, 将野生大豆DNA 直接导入受体栽培大豆。经分析、鉴定、
选择、育成了集高产、优质、高蛋白于一体的新品种黑生 101, 并经 RA PD (R andom Amp lified
Po lymo rph ic DNA ) 分子验证, 证明供体DNA 片段确已进入受体。经连续 7 年分析, 黑生 101 蛋白质
含量超过 45% , 平均比受体高 1. 76 个百分点; 球蛋白总量比受体高近 10 个百分点, 11S 球蛋白超过
了 70% ; 产量比标准品种提高 9. 8% , 已于 1997 年正式推广。
关键词　大豆; 外源DNA ; RA PD; 高蛋白
Breed ing of a H igh-y ield ing, H igh-qua l ity and H igh-prote in Con ten t
Soybean Cultivar-He isheng 101 through D irect In troduction of A l ien
D NA
L E IBo2Jun1　Q IAN H ua1　L I X i2Chen1　LU Cui2H ua1　ZHOU Si2Jun1　HAN Yu2Q in1　L IU Zhao2Jun1　
L IU Guang2Yang2　YAN G X ing2Yong2　DON G Q uan2Zhong2　ZHAO Kai2
HAO Sh i2T ao 2
(1 B iotechnology R esearch Cen tre, H eilongJ iang A cad emy of A g ricu ltu ra l S eiences, H arbin 150086; 2 K eshan w hea t
Institu te, H ellongj iang A cad emy of A g ricu ltu ra l S ciences K eshan, 161606)
Abstract　　T h is paper describes tha t an a lien DNA of w ild soybean w as direct ly in troduced
in to a cu lt ived soybean by “Po llen T ube Path”. A cco rd ing to the resu lt of ana lysing,
app ra ising and select ing, a new cu lt ivar w ith h igh2yield ing, h igh2quality and h igh2p ro tein
con ten t H eisheng 101 w as developed. M o reover, it w as confirm ed tha t the a lien DNA
sequence from the w ild soybean had becn in troduced in to the accep to r. Based on the ana lysis
fo r the past seven years, the p ro tein con ten t of H eisheng 101 w as over 45% and average w as
1. 76% h igh than tha t of its accep to r. T he to ta l con ten t of g lobe p ro tein s w as 10% h igher
than tha t of its accep to r. T he 11 S2globe p ro tein w as m o re than 70%. T he yield ing of
H eisheng 101 ra ised 9. 8% com pared w ith standard cu lt ivars. T h is new cu lt ivar w as nam ed
as and expended fo rm ally in 1997.
Key words　　Soybean; A lien DNA ; RA PD; H igh p ro tein con ten t
X “九五”国家重点科技攻关项目
参加本项研究工作的还有王树林、吕云波, 英文摘要由吕晓波提供, 一并致谢。
收稿日期: 1999205225, 接受日期: 1999212210

植物蛋白的研究与开发, 近 20 年来已受到普遍的关注, 越来越多的研究表明, 植物蛋白
具有很高的营养价值和保健作用, 其中尤以大豆蛋白为最佳。据有关资料: 美国、日本均曾
育成蛋白质超过 47% 的品种, 如美国的 Siow x、日本的白荚 1 号等。我国大豆蛋白质含量平
均在 40% 左右, 分布呈现南高北低趋势。南方地区大豆品种蛋白质含量平均达 44. 6% , 有的
高达 47% 以上。但在北方主产区黑龙江省平均含量还不到 40%。一般国内专家认为, 在高纬
度地区育成高蛋白品种较困难。高蛋白常规育种最大难度是蛋白含量与产量呈负相关, 虽然
近年也不断育成一些蛋白含量较高的品种, 但在品质、产量等指标上仍不够理想。
外源DNA 直接导入技术的应用实现了农作物分子育种, 成为目前生物技术中最具生命
力的生长点。近年来, 我们利用该技术对栽培大豆品种进行了品质改良的研究[ 1 ] , 并对转化
后代进行了RA PD 分子验证[ 2 ] , 进而育成了第一个大豆新品种 高产、优质、高蛋白大豆
黑生 101。现将结果报道如下。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
受体: 栽培大豆 629623
供体: 野生大豆龙 792343321 (黑龙江省收集的蛋白含量 50% 以上特高蛋白材料)
1. 2　试验方法
外源DNA 的制备: 采用氯仿—异戊醇—核糖核酸酶法, 对供体进行总DNA 的提取, 并
经岛津UV 2265 紫外检测和琼脂糖凝胶电泳进行纯度浓度和片段大小的鉴定, 导入大豆的
DNA 浓度达到 500 Lg ö mL 左右。
导入及选择: 在大豆自花受粉后 6～ 32 h 内, 采用切柱头涂抹法, 将供体DNA 直接导入
受体。所获导入后代基本按常规育种程序进行田间种植、选择和考种鉴定。
后代鉴定: 对受体、供体和转化后代同时进行化学分析和RA PD 鉴定。
2　结果与分析
2. 1　导入后代蛋白质、脂肪含量分析
通过直接导入在 1989 年的D 2 代就获得许多高蛋白株系, 它们的脂肪含量 (Fc) 虽然较受
体稍低, 但蛋白含量 (Pc)却明显高于受体, 其中有 4 个株系 Pc 超过 46% (见表 1)。
表 1　　4 个D 2 代株系的蛋白、脂肪含量
Table 1　　The prote in and fat con ten t of 4D 2 stra in s
材料
M aterial
蛋白含量 P ro tein conten t (% )
1989 1990 1991 平均
A verage
脂肪含量 Fat conten t (% )
1989 1990 1991 平均
A verage
受体 629623 44. 34 42. 78 44. 34 43. 82 16. 78 19. 09 18. 14 18. 00
供体 792343321 51. 013 51. 01 10. 553 10. 55
后代 D 892977 48. 18 43. 69 45. 76 45. 88 15. 32 19. 30 18. 12 17. 58
后代 D 892978 46. 90 43. 64 46. 25 45. 60 15. 48 20. 00 18. 80 18. 09
后代 D 892979 47. 78 43. 89 45. 72 45. 80 15. 55 20. 03 17. 75 17. 78
后代 D 8929822 47. 58 44. 17 46. 14 45. 96 16. 27 19. 18 18. 13 17. 86
　　3 数据来自中国野生大豆资源目录, 其余数据来源见表 2 注。
　　根据 3 年化学分
析, 其 中 D 8929822
年平均值为最高。
PC 为 45. 96, FC 为
17. 86, 平 均 PC
(45. 96) 和 PC + FC
(63. 82) 已超过受体
2 个百分点且性状稳
定, 选其作为优系继
续进行 PC 和 FC 跟
踪分析 (见表 2)。
627　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26 卷

表 2　　D 89-9822 连续 7 年的蛋白及脂肪含量
Table 2　　The prote in con ten t and fat con ten t of D 89-9822 in 7 con secutive years
年份
Year
蛋白含量 P ro tein conten t (% )
629623 D 8929822
比供体增加
Increase over
recip ien t
脂肪含量 Fat conten t (% )
629623 D 8929822
比供体增加
Increase over
recip ien t
1989 44. 34 47. 58 16. 78 16. 27
19903 42. 78 44. 17 19. 09 19. 18
19913 44. 34 46. 14 18. 14 18. 13
1992 40. 67 43. 00 19. 38 19. 00
19933 44. 55 45. 20 18. 42 17. 96
19943 44. 81 45. 72 — —
19953 44. 31 46. 29 17. 83 16. 69
平均 43. 68625 45. 4425 1. 76 18. 27 17. 87 - 0. 40
SD 1. 3717 1. 3884
C. V % 3. 14 3. 055
　　注: 3 数据来自黑龙江省农业科学院谷物分析中心, 其他数据来自黑龙江省农业科
　学院大豆所品质分析室。
3 D ata obtained from Grain A nalysis Center of HAA S, o ther data obtained from
　Q uality A nalysis D epartm ent of Soybean Research Institu te of HAA S.
　　7 年跟踪分析导
入后代品系D 8929822
的 PC 最 高 年 份 达
47. 58% , 平 均 为
45. 44% , 比受体平均
高1. 76个百分点。PC
+ FC 为 63. 31% , 比
受体 61. 95% 高 1. 36
个百分点。证明该品
系高蛋白特性是稳定
的。
　　众所周知, 大豆
品质不仅决定于其蛋
白质含量的高低, 更
主要的是与其可溶性
蛋白含量即球蛋白总
量及其含硫氨基酸有
关的 11S 球蛋白含量的高低有关。为此, 于 1994 年对该品系及受体进行了有关分析。 (由于
分析价格上涨和经费所限, 当年对上百份与高蛋白选择有关的材料只做了一项蛋白分析)。
1994 年利用等电点法 (重量法) 和盐析法, 对受体和D 8929822 品系的球蛋白总量及其组
分 11S 球蛋白进行分析[ 3 ]结果D 8929822 球蛋白总量比受体 629623 高近 10 个百分点, 11S 球
蛋白总量比例高达 72. 9%。 (11S 球蛋白比例极少有超过 70% 的)。
通过 T 检验说明后代与受体之间蛋白质含量差异明显[ 4 ] t= 5. 97973 3 ( t0. 05= 2. 36, t0. 01=
3. 5)。
2. 2　决选高蛋白品系产量分析鉴定
作为优系的D 8929822 在进行 PC 跟踪分析的同时, 于 1992 年决选品系进入品比, 异地
鉴定, 区试和生产试验。试验结果见表 3。
表 3　　D 89-9822 在不同产量评比试验中的表现
Table 3　　Performance of D 89-9822 in differen t y ield tr ia ls
试验名称
N am e of
yield trials
年度
Year
　
产量
Yield
(kg ö hm 2)
为对照之%
% of CK
　
对照名称
N am e
of CK
为受体之%
% of
recip ien t
品种比较 1992～ 1994 2254. 5 98. 0 黑农 33 143. 1
Yield trial H einong 33
异地鉴定 1993～ 1994 2595. 0 111. 3 丰收 22 146. 8
T est at alien sites Fengshou 22
区域试验 1995～ 1996 2230. 7 109. 2 丰收 22 —
Regional test Fengshou 22
生产试验 1996 2198. 9 109. 8 丰收 22 —
O n2farm test Fengshou 22
　　5 年 4 种产量比较试
验结果, 除品种比较试验
(在育成区试验)产量稍低
于对照外, 其余 3 个试验
(在适宜区试验)比对照增
产 9. 2%～ 11. 3%。比受
体增产幅度 分 别 高 达
43. 1% 和 46. 8%。此外
该品种还具有杆强、株型
收敛、适宜密植, 抗逆性
强、适应性广等特点。为
此, 决定作为新品种在适
7276 期　　　　雷勃钧等: 通过直接引入外源DNA 育成高产、优质、高蛋白大豆新品种黑生 101　　　　　　

宜区正式推广, 1997 年初审定命名为黑生 101 (见图 2)。
2. 3　对黑生 101 进行 RAPD 鉴定
为了核实外源DNA 是否确实导入受体, 利用RA PD 技术进行核查。结果发现所用随机
单引物 132 个, 扩增出多态性的引物有 3 个 (O PB 07、O PB 18、O PC 08)占所用引物的 2. 27%。其
中引物O PB 07扩增产物在 700 bp 处 (见图 121) , O PC08扩增产物在 1300 bp 和 1200 bp 处 (见
图 122) , 黑生 101 均表现出与供体相同的特异带, 而该带在受体扩增产物中不存在。所用 4
对双引物中有 1 对双引物O PA 11+ O PC12在 500 bp 处 (见图 123) , 黑生 101 扩增出一条与供
体相同, 而受体没有的特异带。上述结果说明黑生 101 确实是引入外源DNA 的产物[ 5 ]。
图 1　　引物O PB 07、O PC08和O PA 11+ O PC12的扩增结果 (箭头显示为差异片段)
F ig. 1　　Amp lified p roducts by p rim er O PB 07、O PC08 and O PA 11+ O PC12
M : DNA 分子量标记 DNA mo lecu lar w eigh t m arker
121、122: pBR 322. H inf É + pBR 322. B stN É 　　片段长度: 1857, 1633, 1058, 929, 517, 506, 396, 344, 298 bp⋯
123: pBR 328. B g l É + pBR 328. H inf É 　　片段长度: 2176, 1766, 1230, 1033, 653, 517, 453 bp
A : 供体龙 792343321　Dono r long 792343321; B: 后代黑生 101 P rogeny H eisheng 101; C: 受体 629623　Recip ien t 629623
121 引物O PB 07扩增结果, 引物序列 5′2GGT GA CGCA G23′
121 Amp lified p roducts by p rim er O PB 07, T he sequence of th is p rim er is 5′2GGT GA CGCA G23′
122 引物O PC08扩增结果, 引物序列 5′2T GGA CCGGT G23′
122 Amp lified p roducts by p rim er O PC08, T he sequence of th is p rim er is 5′2T GGA CCGGT G23′
123 引物O PA 11+ O PC12扩增结果, 引物序列: O PA 115′2CAA TCGCCGT 23′O PC12 5′2T GTCA TCCCC23′
123 Amp lified p roducts by p rim er O PA 11+ O PC12, T he sequence of th is p rim er: O PA 11
5′2CAA TCGCCGT 23′O PC12 5′2T GTCA TCCCC23′
3　讨论与结语
3. 1　野生资源的利用
野生大豆的高 PC 特性是育种家所非常期盼的有利性状, 加之抗逆性强等优点而长期被
作为一种宝贵的资源加以保存和利用。但它们也有许多不良农艺性状 (如株型呈爬蔓状, 多
分枝, 茎细软, 籽粒小皮色黑或褐等等)。80 年代初, 我们曾利用常规有性杂交的方法使高
827　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26 卷

PC (超过 48% )野生大豆与栽培大豆杂交, 获得的许多杂交后代中不少材料 PC 超过 45% , 但
它们往往伴随着许多不良农艺性状而难以利用。因此, 不得不另辟新路采用直接导入野生大
豆DNA 的技术进行高 PC 特性转移, 事实证明转移极易获得成功。10 几年来我们做了大量
组合, 所选野生大豆 PC 均在 48% 以上最高达 51%。导入所获后代的 PC 含量均获得不同程
度的提高[ 6 ] , 且后代保持了栽培大豆性状, 从中我们曾选获许多品系, 黑生 101 的育成只是
其中之一。这可能为其它作物野生资源快速利用带来新的启示。
图 2　　高产、优质、高蛋白大豆新品种黑生 101
F ig. 2　　A new soybean cult ivo r2H eishen 101
w ith h igh2yielding, h igh2quality and
h igh2p ro tein conten t
3. 2　打破某些相关性
黑生 101 的育成结果说明通过外源DNA
直接导入技术可以突破高蛋白育种的产量指
标 (蛋白超过 45% 产量要提高 3% , 而黑生
101 提高了 9. 8% 已接近高产育种指标) , 并
能得到 PC 提高但农艺性状又未恶化的个体。
看来直接引入外源DNA 起到了染色体小片
段易位的效果, 故能打破高 PC 与劣农艺性
状间的连锁。这一现象从分子生物学角度考
虑, 我们也可以这样解释: 由于导入受体的
只是少量的DNA 片段, 因而容易打破某些
基因片段的连锁[ 7 ] , 有可能在个别受体的后
代中选到具有目标性状而野生性状较少的个
体, 从而克服了大豆蛋白质含量和产量的负
相关性, 进而实现了高纬度地区育成高产、
高蛋白的大豆品种。
该理论和技术同样适用于其它作物。
3. 3　分子验证
外源DNA 直接导入技术以其简便、易
行、高效为特点, 已被许多作物的育种者所
采用, 育成的棉花、水稻、大豆等各作物已进
入应用[ 8 ] , 但同时也在不断寻找对这些育成
品种或品系的分子验证技术。90 年代初产生
的RA PD 技术, 其作用之一就是可以追踪外
源DNA 片段。本研究曾利用 RA PD 技术对导入后代进行外源DNA 追踪方面作了大量工
作[ 9、2 ]。在对黑生 101 的 RA PD 分析中也发现, 在外部性状相同的情况下, 却在分子水平上
找到与受体不同的DNA 片段, 而该片段只有供体中存在。说明黑生 101 与受体在分子水平
上存在明显差异而不是同一个体。下步对该片段可做深入分析。
3. 4　品质改良
随着对大豆营养价值的关注, 对大豆蛋白组分的研究也越来越深入。80 年代就已知大豆
贮存蛋白是大豆种子蛋白的主要部分, 而 11S 球蛋白不但是贮存蛋白的主要成分, 并与含硫
氨基酸以及豆腐的产出率有密切关系。研究者也发现, 在大豆属中球蛋白总量一般在 65% 左
右, 其中 11S 球蛋白占球蛋白比例为 50%～ 60% , 极少有超过 70% 的。本文作者曾对大豆属
9276 期　　　　雷勃钧等: 通过直接引入外源DNA 育成高产、优质、高蛋白大豆新品种黑生 101　　　　　　

(野生大豆、半野生大豆和栽培大豆) 做过分析, 只发现一份半野生大豆龙 7920620 11S 球蛋
白达到 80% 以上[ 10 ] , 而后曾以其作为父本和栽培大豆杂交, 但未能实现这一特性的转移。通
过外源DNA 直接导入的方法, 却获得了球蛋白总量和 11S 球蛋白所占其比例均超过 70% 的
一个高蛋白、高产的宝贵材料, 并在短时期内育成第一个大豆新品种黑生 101。该品种育成
实际时间只用了 5 年。说明通过直接引入外源DNA 是实现大豆高产、优质、高蛋白育种和迅
速实现生物技术产业化的一项可行技术。
参　考　文　献
1　雷勃钧, 尹光初, 卢翠华等. 大豆科学, 1991, 10 (1) : 58～ 62
2　雷勃钧, 李希臣, 卢翠华等. 中国科学 (B) , 1994, 24 (6) : 596～ 641
3　钱　华, 雷勃钧, 卢翠华等. 哈尔滨师范大学学报, 1994, 10 (6) : 48～ 52
4　钱　华, 雷勃钧, 卢翠华等. 大豆科学, 1998, 17 (2) : 182～ 185
5　李希臣, 雷勃钧, 卢翠华等. 大豆科学, 1999, 18 (3) : 231～ 237
6　雷勃钧, 卢翠华, 钱　华等. 大豆科学, 1995, 14 (3) : 203～ 208
7　周光宇, 翁　坚, 龚蓁蓁等. 中国农业科学, 1988, 21 (3) : 1～ 6
8　黄骏麒, 钱思颖, 刘桂玲等. 中国农业科学, 1986, 19 (3) : 32～ 36
9　李希臣, 雷勃钧, 卢翠华等. 大豆科学, 1994, 13 (2) : 152～ 156
10　刘红军, 林忠平, 雷勃钧等. 科学通报, 1984, 29 (8) : 512
037　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26 卷