全 文 ：第 28 卷 第 1 期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 1
2002 年 1 月　 32～ 35 页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 32～ 35　 Jan. , 2002
根瘤菌对水稻的感染α
王逸群1, 2
(1中国科学院植物研究所, 北京 100093; 2 福建师范大学生物工程学院, 福建福州, 350007)
摘　要　将标记基因 nif A 2lacZ、nif H D K 2lacZ、nif H 2lacZ、hemA 2lacZ 通过三亲交配法导入根瘤菌, 然后接种水稻。Β2
半乳糖苷酶组织化学染色和切片观察表明, 野生型根瘤菌可以感染水稻, 在水稻根的细胞间隙和细胞中有细菌存在。
回接试验证明侵染水稻根的细菌是根瘤菌。
关键词　根瘤菌; 感染; 水稻
中图分类号: Q 945. 13　　　文献标识码: A
Infection of Rhizobia to R ice
WAN G Yi2Q un1, 2
(1 Institu te of B otany , T he Chinese A cad em y of S ciences, B eij ing 100093, China; 2 College of B iolog ical E ng ineerring , Fuj ian N orm al U niversity ,
Fuj ian Fuzhou 350007, China)
Abstract　T he p lasm ids haboring the repo rter gene lacZ fused to the p romoters of hemA , nif A , nif H D K , and
nif H respectively, w ere transfo rm ed in to rh izobia by triparen talm ating and the con jugated rh izobia w ere inocu2
lated in to rice roo ts. T he results indicated that the h istochem ical stain ing of Β2galacto sidase and the observation
under m icroscope show ed that the rh izobia w ere p resen t in co rtex cells and in tercellu lar spaces of rice roo ts. T he
bacteria iso lated and purified from the co lon ized roo ts, w h ich w ere stained again fo r Β2galacto sidase activity,
w ere reinoculated in to legum e pea fo r nodulation. It w as illustrated that the bacteria in the fo rm ed nodulesw ith
blue co lo r after Β2galacto sidase stain ing w ere the pea rh izobia w ith lacZ repo rt gene. T herefo re, the rh izobia
could infect o r en ter in to the non2legum e rice.
Key words　rh izobia; Infection; R ice
　　自 1973 年发现非豆科植物 P arasp onia 根上有
固氮根瘤, 而且证明根瘤内的细菌又确实是根瘤菌
后, 促进了根瘤菌对非豆科植物感染和结瘤固氮的
研究, 人们从各个途径进行试验。(1)酶解法: 将油
菜、小麦、水稻等幼苗的根毛用低浓度的果胶酶和
纤维素酶处理后接种根瘤菌, 结果在根上长出了瘤
状结构[ 1～ 3 ]。 (2)非豆科植物, 如水稻根浸出液培养
根瘤菌, 然后接种水稻, 也可产生瘤状结构[ 4～ 6 ]。
(3) 2, 42D 结瘤法: 在 1～ 3 ΛmolöL 浓度范围的 2,
42D 处理小麦根, 接种根瘤菌, 可以产生瘤状物。
显然, 以上方法产生的瘤状物, 并不是根瘤菌与植
物相互作用产生的结瘤, 而是使根产生了膨大的侧
根, 不可能遗传[ 7 ]。(4)建立非豆科植物内生根瘤菌
法: 用豆科田菁 (S esbania rostrata) 根瘤菌A zorh izo2
bium cau linod ans OR S571 接种小麦、水稻幼苗, 数
天后在显微镜下观察根部, 在部分细胞间隙和细胞
中可以观察到细菌存在。A zorh izobia 成为水稻、小
麦内生菌后的固氮活性问题并未最后定论[ 8～ 12 ]。本
试验的目的在于用含有固氮酶调节基因 nif A 启动
子2lacZ , nif H D K 启动子2lacZ , nif H 启动子2lacZ ,
血红素基因 hemA 启动子2lacZ 的融合标记基因的
野生型根瘤菌接种水稻, 观察根瘤菌是否对其感
染。这无论在理论上还是在实践上都有重要的意
义。α 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (39570194) ; 福建师范大学校科研基金资助项目
作者简介: 王逸群 (19642)、男、吉林省人、讲师、博士。
Received on (收稿日期) : 2000212204, A ccep ted on (接受日期) : 2001204203

1　材料和方法
1. 1　材料
1. 1. 1　植物材料　　水稻中花 8 号, 中花 10 号,
由本实验室保存。
1. 1. 2　菌株和质粒　　野生型豌豆根瘤菌 R. l.
bv. V iciae U SDA 2370T、野生型三叶草根瘤菌 R. l.
bv. trif olii 162K 68R、野生型苜蓿根瘤菌 R. l. bv.
p haseoli 127K 17R 由中国农业大学陈文新教授赠送。
豌豆根瘤菌R. l. bv. V iciae A CCC 16101、R. l. bv. V i2
ciae A CCC 16102、R. l. bv. V iciae A CCC 16103、R. l.
bv. V iciae A CCC 16106 由中国农业科学院刘慧琴副
研究员赠送。pAB 358、pR K2013 HB 101 由中国农
业大学李季伦教授惠赠。其中, pAB358 含有 nif H
启动子调控的 lacZ 基因, pR K2013 为协助质粒。
Gm i10504 由 G. T ruchet 博士提供, Gm i10504 含有
hemA 启动子调控的 lacZ 基因。pM B210 由北京大
学的王忆平教授赠送。pM B 210 含有 nif H D K 启动
子调控的 lacZ 基因。pAM 600 由中国科学院上海植
物生理研究所朱家壁研究员赠送。pAM 600 含有 ni2
f A 启动子调控的 lacZ 基因。
1. 2　方法
1. 2. 1　三亲交配法　　按文献[ 13, 14 ]介绍的方法进
行。将启动子 hemA 、nif H 、nif H D K、nif A 启动子
调控的 lacZ 基因通过三亲交配法导入根瘤菌。
1. 2. 2　Β2半乳糖苷酶活性测定　　按文献[ 15 ]介绍
的方法进行。测定导入 lacZ 标记基因的根瘤菌和对
照的 Β2半乳糖苷酶活性。
1. 2. 3　Β2半乳糖苷酶组织化学染色　　按文献[ 8 ]
介绍的方法进行。取用含有标记基因的根瘤菌感染
水稻根, 进行 Β2半乳糖苷酶组织化学染色。
1. 2. 4　Β2半乳糖苷酶组织化学染色后的徒手切片
观察　　按文献[ 4, 8 ]介绍的方法进行。
1. 2. 5　水稻接种根瘤菌后对细菌进行显微镜观察
　　按文献[ 16 ]介绍的方法进行。
1. 2. 6　根瘤菌回接试验　　按文献[ 17 ]介绍的方法
进行。
2　实验结果
2. 1　根瘤菌的 Β-半乳糖苷酶活力测定
为了标记根瘤菌, 将固氮酶调节基因 nif A 启
动子, 固氮酶结构基因 nif H D K 启动子, 固氮酶结
构基因之一 nif H 启动子, 根瘤菌合成血红素的基
因 hemA 启动子接上 Β2半乳糖苷酶 lacZ 基因, 以便
对标记的根瘤菌进行挑选, 活性测定和染色鉴定。
将根瘤菌在含有 IT PG 和 X2gal 的培养基上培养,
挑取蓝色菌落, 再进行微氧液体培养, 测定其 Β2半
乳糖苷酶的活力。测定结果见表 1。
　　从表中可以看出, 对照根瘤菌有一定的本底 Β2
半乳糖苷酶活性, 而导入质粒后 Β2半乳糖苷酶活性
显著提高。与对照菌相比, hemA 2lacZ 的活性最高,
提高了 4. 33～ 13. 38 倍; nif KD H 2lacZ 提高了
1. 30～ 8. 71 倍, nif H 2lacZ 的活性提高了 1. 65～
8. 99倍。Boivin C. 等[ 8 ]、W u Tong 等[ 18 ]在测定 Β2半
乳糖苷酶活性时, 也测出了根瘤菌的本底。在 pG2
m i10504 质粒中根瘤菌 hemA 启动子表达不受氧含
量的影响, 活性最高, 而 pAB 358, pM B210 质粒中
nif H 2, nif H D K 2启动子的表达在有氧情况下是组
成型低水平表达, 活性降低。在同样情况下, 又以
根瘤菌 R. l . bv. v iciae A CCC 16101 最好, 这对于选
什么根瘤菌做实验提供了数据。
2. 2　lacZ 基因标记的野生型根瘤菌接种水稻根后Β-半乳糖苷酶组织化学染色
取接种豌豆根瘤后的 7 天、10 天、14 天的水稻
根, 用无菌水进行数次洗涤, 去除根表的根瘤菌,
然后进行 Β2半乳糖苷酶组织化学染色。经过次氯酸
钠透明后, 在解剖镜下观察染色结果, 见图版É 2
A。
2. 3　对经过 Β-半乳糖苷酶组织化学染色的水稻根
进行徒手切片观察
对水稻根进行 Β2半乳糖苷酶组织化学染色, 取
染成蓝色的材料, 进行徒手切片观察, 发现根的横
切片中有L acZ 染色的斑点。见图版É 2B。
2. 4　对感染水稻的根瘤菌进行显微观察
取经过 Β2半乳糖苷酶组织化学染色后染成蓝色
的水稻根连同对照, 用 2. 5% 戊二醛固定后, 酒精
系列脱水, GM A 渗透、包埋, 在超薄切片机上切
片。甲苯胺蓝2O 染色, 显微镜下观察。结果见图版É 2C、D、E。
2. 5　根瘤菌回接试验
将接种豌豆根瘤菌的水稻根洗涤, 表面消毒,
磨碎, 低速离心, 取液涂皿。在 YM A 的平板上涂
有 X2gal, IPT G, 出现蓝色菌落。再取菌落划线培
养 2～ 3 天, 有蓝色菌落出现 (图版É 2F) , 从而证明
是被接种的有标记基因的根瘤菌。将此根瘤菌回接
到萌发3～ 7天的豌豆根上 , 2～ 3周后 , 豌豆根上
331 期　　　　　　　　　　　　　　　　　　王逸群: 根瘤菌对的水稻感染　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

表 1　根瘤菌 Β-半乳糖苷酶活力的测定
Table 1　Determ ination of Β-galactosidase activ ity in Rhizobia
根瘤菌菌株
Strains of R hizobia
质粒
P lasm id
启动子
P romoter
Β2半乳糖苷酶活力Β2galactosidase activity 与对照比酶活力提高的百分率Raising the percentage of Β2galactosidase
activity
R. l. bv. v iciae CK 296 0%
U SDA 2370T pGm i10504 hemA 2251 660%
pAB358 nif H 1050 254%
pMB210 nif H D K 1055 256%
R. l. bv. trif oii CK 250 0%
162K 68R pGm i10504 hemA 1332 433%
pAB358 nif H 662 165%
pMB210 nif H D K 576 130%
R. l. bv. phaseoli CK 210 0%
127K 17R pGm i10504 hemA 1160 452%
pAB358 nif H 951 353%
pMB210 nif H D K 624 197%
R. l. bv. v iciae CK 85 0%
A CCC16101 pGm i10504 hemA 1223 1338%
pAB358 nif H 849 899%
pMB210 nif H D K 826 871%
R. l. bv. v iciae CK 150 0%
A CCC16102 pGm i10504 hemA 1071 614%
pAB358 nif H 700 366%
pMB210 nif H D K 803 435%
R. l. bv. v iciae CK 170 0%
A CCC16103 pGm i10504 hemA 1011 495%
pAB358 nif H 773 355%
pMB210 nif H D K 771 353%
R. l. bv. v iciae CK 169 0%
A CCC16106 pGm i10504 hemA 1168 591%
pAB358 nif H 936 454%
pMB210 nif H D K 789 366%
结有根瘤 (图版É 2G)。经过 Β2半乳糖苷酶组织化学
染色, 观察到根瘤也染成蓝色。
3　讨论
3. 1　根瘤菌对水稻的感染
除了接种含有标记基因的豌豆根瘤菌外, 还接
种了含有同样标记基因的菜豆根瘤菌、三叶草根瘤
菌, 从 Β2半乳糖苷酶组织化学染色的结果来看, 水
稻根都能染成蓝色, 说明这三种根瘤菌对水稻的侵
染并没有专一性。
3. 2　lacZ 基因的表达
本试验中, 由于含有 nif A 、nif H D K、nif H 启
动子2lacZ 融合标记基因的根瘤菌接种水稻, 经过Β2半乳糖苷酶组织化学染色后都能染成蓝色, 说明
lacZ 得到了表达, 由此推断应有固氮酶的表达。但
还需进一步试验来证实。
致谢: 非常感谢中国科学院植物研究所荆玉祥研究
员、北京大学王忆平教授在试验方面给予的无私帮
助。
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图版说明
图A. L acZ 标记的根瘤菌接种水稻后进行 Β2半乳糖苷酶组织化学染色。A 1. n ifA 2lacZ 标记的豌豆根瘤菌接种水稻。A 2. n ifHDK2lacZ 标记的
豌豆根瘤菌接种水稻。A 3. 对照。图B. hemA 2lacZ 标记的豌豆根瘤菌接种水稻, 经过 Β2半乳糖苷酶组织化学染色后进行徒手切片。图C、D、
E. 水稻根的半薄切片。C. 示水稻根皮层细胞内的根瘤菌。D. C 的局部放大。E. 对照。图 F. 从接种豌豆根瘤菌的水稻根中分离的根瘤菌。
图 G. 从接种豌豆根瘤菌的水稻根中分离的根瘤菌回接豌豆所形成的根瘤。
Fxplana tion of pla te
F ig. A R ice inoculated w ith R hizobia containing the lacZ reporter gene and histochem ical staining of Β2galactosidase in rice roo ts. F ig. A 1 R hizobium
legum inosarum bv. v iciae w ith nifA 2lacZ reporter gene w ere inoculated into rice. F ig. A 2 R hizobium legum inosarum bv. v iciae w ith nifHDK2lacZ re2
porter gene w ere inoculated into rice F ig. A 3 The contro l. F ig. B M icrograph of a free2hand cross2section of a rice roo t inoculated w ith Rhizobia con2
taining the reporter gene hemA 2lacZ. F ig. C, D , E Sem i2th in section of the rice roo ts. F ig. C show ing rh izobia in cortex cells of the rice roo t. F ig.
D show ing the enlargem ent of parts of F ig. C. F ig. E The contro l. F ig. F R hizobia re2iso lated from colonized rice roo ts. F ig. G The bacteria iso lated
and purified from the colonized roo ts, w hich w ere reinoculated into legum e pea for nodulation.
531 期　　　　　　　　　　　　　　　　　　王逸群: 根瘤菌对的水稻感染