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Effects of Water Stress on the Main Characters of Superior and Inferior Grains Quality and the Properties of RVA Profile during Grain-filling Stage

结实期水分胁迫对水稻强弱势粒主要米质性状及淀粉粘滞谱特征的影响



全 文 :第 30 卷 第 3 期
2004 年 3 月  248~252 页    
作  物  学  报
ACTA AGRONOMICA SINICA
    Vol. 30 , No. 3
pp. 248~252  Mar. , 2004
转 C4 光合基因水稻特征特性及其在两系杂交稻育种中的应用
王德正1  迟 伟2  王守海1 , 3  焦德茂2  吴 爽1  李 霞2  李成荃1  张云华2
罗彦长1 Ξ
(1 安徽省农业科学院水稻研究所 ,农业部水稻遗传育种重点开放实验室 ,安徽合肥 230031 ; 2 江苏省农业科学院遗传生理研究所 ,江苏南京
210014)
摘  要  对 pepc、ppdk 和 pepc + ppdk 三种转基因水稻农艺性状观察表明 ,与原种 Kitaake 相比单株有效穗有不同程度的
增多 ,单株产量相应提高 ,特别是 pepc 和 ppdk 基因聚合后 ,单株有效穗和单株产量分别比受体亲本 Kitaake 提高 29. 1 %和
27. 0 %。三种转基因材料作基因供体分别与受体光敏核不育系培矮 64S、2304S和 2306S杂交后 ,这些基因在新的遗传背
景下不仅稳定遗传和高水平表达 ,而且表现增穗增产 ,特别当 pepc 和 ppdk 基因聚合时 ,与受体相比 , F1 的 PEPC 活性提
高 5. 8~18. 6 倍 ,PPDK活性提高 0. 5~1. 3 倍 ,植株饱和光合速率提高 50 %左右。转育的转基因材料结实率有所降低 ,是
值得进一步研究的问题。
关键词  C4 光合基因 ;两系杂交稻 ;特征特性
中图分类号 :S511
Characteristics of Transgenic Rice Overexpressing Maize Photosynthetic Enzymes
for Breeding Two2line Hybrid Rice
WANG De2Zheng1 , CHI Wei2 , WANG Shou2Hai1 , 3 , J IAO De2Mao2 , WU Shuang1 , LI Xia2 , LI Cheng2Quan1 , ZHANG Yun2
Hua2 , LUO Yan2Chang1
(1 Rice Research Institute , Anhui Academy of Agricultural Sciences , Hefei 230031 , Anhui ; 2 Institute of Crop Genetics and Physiology , Jiangsu Academy of Agricul2
tural Sciences , Nanjing 210014 , Jiangsu , China)
Abstract  Investigation of main agronomic traits for 3 types of transgenic rice with maize C4 photosynthesis gene (i . e.
pepc , ppdk , and pepc + ppdk gene) showed that the transgenic rice plant with the maize pepc and/ or ppdk genes had more
panicles and higher yield than untransgenic one. While pepc and ppdk genes were introduced into the same plant of Kitaake
the panicle per plant increased by 29. 1 % , the grain weight per plant increased by 27. 0 % compared with untransgenic Ki2
taake plants. Using conventional crossing method , we have introduced maize pepc and ppdk genes into photo2sensitive
genic male sterile lines Peiai64S , 2304S and 2306S respectively , and they are stably inherited in a Mendelian manner.
Testing of the enzyme activities in these transgenic plants had showed a high level expression of the genes. With pepc and
ppdk genes gathered together in the same plant , the activities of PEPC and PPDK were increased 5. 8—18. 6 folds and
015 —1. 3 folds respectively in F1 plants , the saturated photosynthetic rates were about 50 % higher than the receptor par2
ents. The problem of lower seed setting should be studied further.
Key words  C4 photosynthesis gene ; Two2line hybrid rice ; Characteristics
  目前高产水稻光能利用率只有 1. 5 %左右 ,与
理想的光能利用率 3 %~4 %相距甚远[1 ] 。通过提
高单叶光合能力以提高群体光合速率和光能利用率
可能是一条有效的途径[2 ] 。早在 20 世纪 60 年代科
学家们就试图将 C4 光合特性整合到水稻中去 ,但收
效甚微。近几年来 ,美国华盛顿州立大学 Ku 等[3 ]Ξ基金项目 :国家高技术研究发展计划 (863 计划)项目 (2001AA211171 ,2002AA207001) ;国家转基因植物研究与产业化专项 (J20002B2005) 。
作者简介 :王德正 (1962 - ) ,男 ,安徽庐江人 ,副研究员 ,主要从事水稻育种研究。3通讯作者 :王守海。Tel :055122160454 (O) ,13075586173
Received(收稿日期) :2002206219 ,Accepted(接受日期) :2003202215.

成功地将玉米 C4 光合途径中的磷酸烯醇式丙酮酸
羧化酶 (下文称 PEPC ,含 pepc 基因水稻简称 PC 水
稻)基因导入水稻 ,并得到相当或高于玉米水平的表
达。
1998 年 ,我们与美方合作 ,引进已导入玉米
pepc 基因的日本北方早粳稻品种 Kitaake 进行研究 ,
以广亲和核不育系培矮 64S 和优质恢复系 5129 等
为受体 ,现已转育成一批转玉米 pepc 基因 F7 代水稻
新种质材料 ,其中 3 个株系表现稳定 ,对这些材料遗
传稳定性和主要生理指标研究表明[4 ,5 ] , pepc 基因
不仅在水稻不同的遗传背景中高水平表达 ,而且能
稳定遗传 ,基因受体亲本与 PC 水稻杂交 ,其 F1 代
PEPC活性介于双亲之间 ,通过定向选择 ,F2~F7 代
PEPC活性表现稳定 ,一般比受体亲本提高 9 倍左
右 ,饱和光合速率比受体提高 50 %以上 ,PEPC 活性
与饱和光合速率成极显著正相关。
将玉米 C4 光合途径中的另一个关键酶 ———丙
酮酸正磷酸二激酶 (下文称 PPDK,含 ppdk 基因水稻
简称 PK水稻)基因导入水稻后 ,高表达的植株光合
速率比对照提高 35 % ,气孔导度和 CO2 浓度提高 ,
而且在转 pepc 基因水稻的基础上 ,又提高了植株产
量 ,增强了抗逆性[6 ] 。鉴于现有转基因技术对在转
化当前生产上应用的品种时成功率比较低 ,本研究
以三类转基因水稻为 pepc 和 ppdk 基因供体 ,与受体
两系杂交水稻母本光敏核不育系杂交 ,进行 pepc +
ppdk (下文称 CK)两个聚合基因转育工作 ,已获得一
些聚合材料 ,并探讨了主要特征特性 ,为选育超高产
两系杂交稻提供理论依据。
1  材料和方法
1. 1  试验材料
  pepc、ppdk、CK基因供体水稻由美国华盛顿州
立大学 Ku 教授赠给 ,这些基因的原始受体亲本为
日本北海道地区的早熟粳稻品种 Kitaake ,在安徽合
肥 4 月底或 6 月初播种 ,播始历期 56 d 左右。受体
材料有两系杂交稻亲本光敏核不育系培矮 64S、
2304S和 2306S。
1. 2  试验方法
1. 2. 1  CK水稻新材料的获得  2000 年春得到的转
基因载体为 Kitaake 的 CK水稻 ,世代低 ,分离大 ,当
年夏季优选单株与基因受体培矮 64S、2304S 和
2306S杂交 ,转育 CK水稻新材料 ,即培矮 64S/ CK、
2304S/ CK和 2306S/ CK;2001 年春在海南用 F1 单株
与受体回交 ,收获种子夏季在合肥种植 BC1 ,再从
BC1 群体中优选单株与受体继续回交 ,依此往复直
至稳定。在转育过程中 ,建立了抗生素催芽初选、分
子标记检测、酶活性和光合速率测定与田间决选程
序相结合的双基因水稻育种技术体系 ,从 F1 代起用
50 mg/ L 的潮霉素溶液催芽 ,淘汰假的转基因植株。
夏季在合肥 ,每代在分蘖盛期优选单株 ,将当选单株
一分为二 ,一半送江苏省农业科学院遗传生理所检
测 PEPC、PPDK活性和饱和光合速率 ( Pn) ,从酶活
性高低识别真假双基因聚合材料 ;一半留在安徽省
农业科学院水稻研究所做 PCR 分析和田间表型观
察 ,PCR 分析检测 pepc 基因是否导入 ,PCR 引物为 :
p1 5′2GTT CCA ACC ACG TCT TCA AAG23′;p2 5′2ATT
TAC CCG CAG GAC ATA TCC23′。实验结果结合田
间表型决选玉米光合基因已导入的植株与受体亲本
回交 ,依此已获得培矮 64S/ CK、2304S/ CK和 2306S/
CK的 BC1 代 CK水稻新材料 ,其过程见图 1。
杂交转育 Transgenic breeding by crossing
受体
Receptor
(Peiai64S ,2304S ,
2306S)
×基因供体
Donor of gene
(CK)
2000 年夏做杂交。
In summer in 2000 , making a cross.
受体
Receptor
×
BC1
F1 2001 年春用 F1 单株与受体回交。
In spring in 2001 , F1 plants were
backcrossed with the receptor par2
ents.
图 1 CK水稻新材料转育过程
Fig. 1 Transgenic breeding procedure of plants with two maize genes
1. 2. 2  PEPC 活性测定  参照 Kung[7 ]和 Gonzalez[8 ]
等方法。取孕穗至抽穗期的倒 2 叶叶片 0. 5 g ,加入
适量提取液 (50 mmol/ L Tris2HCl ,pH 7. 5 ,1 mmol/ L
MgCl2 ,5 mmol/ L DTT ,2 % W/ V 不溶性 PVP) 研磨 ,
滤液于 13 000 ×g 离心 10 min ,取上清液测酶活性。
反应总体积 1 mL ,含 50 mmol/ L HEPES2KOH pH 8. 0
的缓冲液 ,10 mmol/ L NaHCO3 ,5 mmol/ L MgCl2 ,0. 2
mmol/ L NADH ,2 mmol/ L PEP ,1. 5 U 苹果酸脱氢酶 ,
及适量提取液。测试温度为 30 ℃,加入 PEP 开始计
时 ,记录 340 nm 光密度的变化 ,计算 PEPC酶活性。
1. 2. 3  PPDK活性测定  参照 Hatch 和 Slack 的方
法测定[9 ] 。晴天上午 9 :00~10 :00 (光强大约 1 200
μmol·m - 2·s - 1) 取孕穗至抽穗期的倒 2 叶叶片 0. 2
g ,加入 1. 5 mL 提取液 (50 mmol/ L Tris2HCl ,pH 7. 0 ,
942 3 期 王德正等 :转 C4 光合基因水稻特征特性及其在两系杂交稻育种中的应用    

10 mmol/ L MgCl2 ,1 mmol/ L EDTA ,5 mmol/ L DTT ,5 %
W/ V 不溶性 PVP)研磨 ,滤液于 15 000 ×g、4 ℃下离
心 10 min ,取上清液测酶活性。反应总体积 1 mL ,含
250 mmol/ L Tris2HCl , pH 8. 3 , 50 mmol/ L DTT , 0. 1
mmol/ L MgSO4 ,50 mmol/ L NaHCO3 ,15 mmol/ L 丙酮
酸钠 ,25 mmol/ L K2HPO4 , 50 mmol/ L NH4Cl ,5 mmol/
L NADH ,50 mmol/ L ATP ,80 U NAD2苹果酸脱氢酶 ,
30 U PEPC ,及适量提取液。
1. 2. 4  光合速率测定  用便携式光合测定系统 LI2
6200 在自然饱和光强下测定连体叶片的光合速率。
1. 2. 5  农艺性状考察  2000 年在安徽省农业科学
院水稻研究所网室对转基因亲本材料进行观察 ,6
月初种子出芽后按 17 cm ×20 cm 株行距直播大田。
利用受体转育的转基因后代 F1、BC1 材料 ,2001 年 5
月初在合肥湿润育秧后按 13 cm ×(17 cm + 27 cm)
的规格移栽大田。成熟时每个材料取样 10 株调查
单株有效穗、穗粒数、结实率、千粒重和单株谷重等
经济性状。
2  结果与分析
2. 1  基因供体材料的研究
2. 1. 1  基因供体材料主要经济性状比较  当 Ki2
taake 被转入不同基因后 ,水稻植株产量和主要经济
性状发生了不同程度的变化 ,与原始受体亲本 Ki2
taake 相比 ,主要是穗数增加 ,单株产量提高 (表 1) ,
特别是 pepc、ppdk 两基因聚合水稻 CK,增幅最大 ,单
株有效穗数增加 29. 1 % ,单株产量提高 27. 0 %。
表 1 不同转基因水稻株系主要经济性状( 2000 年)
Table 1 Main agronomic traits of transgenic rice with different genes( 2000)
材料
Material
单株有效穗
Panicles/ plant
穗总粒数
Grains/ panicle
结实率
Seed setting ( %)
千粒重
10002seed weight (g) 单株谷重GW/ plant (g) 产量增幅Yield increment ( %)
PC rice 17. 0 ±3. 7 53. 6 ±3. 4 82. 5 ±2. 8 23. 2 ±0. 6 16. 3 ±4. 1 13. 9
PK rice 18. 3 ±4. 0 51. 4 ±5. 9 80. 3 ±4. 9 22. 0 ±1. 3 16. 7 ±3. 3 16. 8
CK rice 19. 1 ±3. 8 50. 3 ±4. 7 82. 3 ±3. 7 23. 9 ±0. 7 18. 2 ±3. 1 27. 0
原始受体 Kitaake 14. 8 ±3. 0 50. 7 ±4. 3 82. 9 ±2. 9 22. 9 ±0. 8 14. 3 ±2. 5
  注 :表中数据为 10 株平均值。Note : The data in table 1 is the average value from 10 plants. GW2grain weight .
2. 1. 2  不同转基因水稻植株酶活性  经测定 , PC
水稻 PEPC 活性为 1201. 9μmol/ (mg·h) , PK 水稻
PPDK活性为 122. 4μmol/ (mg·h) ,两个光合酶活性
分别比原始受体 Kitaake 高 20 倍和 5 倍之多 (表 2) 。
从遗传角度而言 ,转基因水稻同受体亲本应该为个
别基因差异的近等基因系 ,据此推断 ,上述不同材料
的产量和光合酶的活性差异是转基因所引起的。
表 2 三种基因供体亲本酶活性和饱和光合速率( 2001 年)
Table 2 Photosynthetic enzyme activities and saturated
photosynthetic rate in three types of transgenic rice ( 2001)
转基因供体
Donor
of transgene
PEPC活性
PEPC activities
[μmol/ (mg·h) ]
PPDK活性
PPDK activities
[μmol/ (mg·h) ]
Pn
[μmol/ (m2·s) ]
PC rice 1201. 9 ±198. 6 25. 8 ±1. 1
PK rice 122. 4 ±18. 9 24. 2 ±0. 9
CK rice 898. 2 ±54. 3 78. 2 ±7. 8 26. 8 ±1. 7
原始受体 KI 50. 0 ±5. 2 22. 6 ±1. 4 19. 2 ±1. 5
  注 :表中数据为 10 株平均值±标准差。
Note : Values were means ±SD from 102plant .
2. 1. 3  3 种基因供体亲本饱和光合速率  由表 2
可见 ,4 种材料的 Pn 以 CK的 26. 8μmol/ (m2·s) 为
最高 ,KI 的 19. 2μmol/ (m2·s) 为最低 ,相比提高了
3915 % ,PC 和 PK 水稻的 Pn 也分别比 KI 提高了
3414 %和 26. 0 %。
2. 2  转育的 CK水稻 F1 经济性状表现
由表 3 可见 ,3 个受体亲本与不同基因供体杂
交后 ,主要经济性状发生了不同的变化。一是导入
双基因比单基因增产效果明显 ;二是 5 个性状中单
株有效穗数和单株谷重变化最大 ,分别比对照提高
1. 0 %~77. 6 %和 5. 0 %~25. 9 % ;三是导入不同基
因后 ,后代单株有效穗数和单株谷重变化程度不同 ,
当 pepc 和 ppdk 聚合导入同一受体亲本后 ,变化幅度
最大 , 与对照 ( 2306S/ Kitaake、2304S/ Kitaake、培矮
64S/ Kitaake) 相比 , 2306S/ CK、2304S/ CK、PA64S/ CK
单株有效穗依次增加 77. 6 %、19. 3 %和 36. 2 % ,单
株谷重依次提高 21. 4 %、25. 9 %和 9. 4 % ;四是玉米
基因转育到不同受体后 ,对受体性状影响不一 ,这可
能与基因供、受体材料亲缘关系有关 ,如受体 2304S
和 2306S是粳稻 ,其后代结实率就高达 80 %以上 ,而
与偏籼型的广亲和系培矮 64S 杂交 ,其后代结实率不
到 70 %。
052    作   物   学   报 30 卷  

2. 3  转育的 CK水稻 F1 酶活性
从图 2 PEPC 活性比较可见 ,对培矮 64S、2304S
和 2306S 聚合导入 pepc 和 ppdk 基因后 , F1 代 PEPC
活性依次比受体提高 5. 8 倍、10. 1 倍和 18. 6 倍。培
矮 64S/ CK、2304S/ CK和 2306S/ CK的 PPDK活性依
次比受体提高 1. 3 倍、0. 5 倍和 1. 1 倍。
2. 4  转育的 CK水稻 F1 饱和光合速率
与受体相比 , F1 饱和光合速率提高了 55. 1 %、
4516 %和 47. 5 %(图 2) 。
表 3 导入不同基因后主要经济性状变化( 2001 年)
Table 2 Variation of main agronomic traits in different transgenic combinations( 2001)
组合
Combination
单株有效穗
Panicles/ plant
穗总粒数
Grains/ panicle
结实率
Seed setting ( %)
千粒重
1 0002seed weight (g) 单株谷重Grain weight/ plant (g) 产量增幅Yield increment ( %)
2306S/ PC rice 12. 3 117. 2 81. 4 31. 3 35. 5 18. 0
2306S/ PK rice 11. 9 114. 6 82. 3 30. 8 35. 1 16. 6
2306S/ CK rice 19. 0 113. 0 81. 5 31. 2 36. 5 21. 4
2306S/ KI 10. 7 120. 5 84. 5 31. 9 30. 1
Peiai64S/ PC rice 20. 7 192. 3 65. 7 20. 0 33. 0 5. 0
Peiai64S / PK rice 19. 8 192. 5 68. 2 20. 9 36. 3 15. 7
Peiai64S / CK rice 26. 7 174. 5 60. 5 21. 9 3915 25. 9
Peiai64S/ KI 19. 6 174. 9 54. 7 20. 9 31. 4
2304S/ CK rice 13. 6 101. 9 80. 7 23. 5 25. 9 9. 4
2304S/ KI 11. 4 95. 0 83. 6 23. 1 23. 7
  注 :表中数据为 10 株平均值。Note : The data in table 1 is the average value from 10 plants.
图 2 转育的 CK水稻与受体亲本主要生理指标比较
Fig. 2 Comparison of mainly physiological index of transgenic plants and receptor parents
1、2、3 分别为 Peiai64S/ CK、2304S/ CK、2306S/ CK 1 ,2 ,3 indicate Peiai64S/ CK, 2304S/ CK, 2306S/ CK
2. 5  转育的 CK水稻 BC1 表现
转育的 CK水稻 BC1 世代除形态性状发生分离
外 , pepc 和 ppdk 基因也发生分离 (初步结果和鉴定
方法验证后另文报道) ,说明 pepc 和 ppdk 基因转化
过程中分别插入水稻基因组的不同染色体。对培矮
64S/ PC、2304S/ PC 和 2306S/ PC 的 BC1 世代中鉴别
出来的 CK材料的 2 个酶活性测定结果显示 ,表达
水平与 F1 相当 , PEPC 活性为 516. 8~796. 9μmol/
(mg·h) ,PPDK活性为 50. 6~31. 4μmol/ (mg·h) 。
综上所述 ,以转玉米基因水稻的原始材料为基
因供体 ,将玉米光合基因 pepc + ppdk 通过杂交导入
两系亲本光敏核不育系后 ,F1 代 2 个基因均能高水
平表达 ,与对照相比 ,饱和光合速率、单株有效穗和
单株谷重明显提高。BC1 代 CK水稻形态性状虽然
分离 ,但 PEPC和 PPDK 2 个酶活性表达稳定。从这
一初步结果看 ,利用高光效的转玉米基因水稻与我
国两系杂交稻的亲本杂交 ,转育高光效的亲本材料
有可能选配出高优势两系杂交稻 ,进一步深入研究
可为水稻高光效生理育种和高光效超级杂交稻的选
育开辟新的途径。
3  讨论
光合作用是作物物质生产的主要来源 ,要想突
破作物的现有产量应进一步提高光能利用效率。在
现有高 O2、高光强和低 CO2 的条件下 ,C4 植物比 C3
植物具有较高的光合速率。将 C4 光合基因导入水
稻可能是超高产育种的又一途径。Wang 等[10 ]
(2002)指出 ,从转玉米 pepc 基因水稻 ,在高光强下
比原种有较高的光合速率 ;在连续高光强下 (2 h)
PS Ⅱ光化学效率下降较少 ,光化学猝灭系数比较稳
定 ;在光氧化条件下叶绿素衰减速度减慢 ,表现出耐
光抑制和光氧化的特性。Jiao 等[11 ] (2001) 研究表
152 3 期 王德正等 :转 C4 光合基因水稻特征特性及其在两系杂交稻育种中的应用    

明 ,转 pepc 基因水稻叶片内 PEPC活性高表达时 ,叶
内碳酸酐酶的活性也增大 ,CO2 的传输能力增强 ,
Rubisco 羧化反应能力提高 ,植株光合能力大为增
加。本研究表明 ,将玉米 C4 光合途径中的关键酶基
因 pepc、ppdk 整合到 C3 作物水稻中 ,不仅稳定表达 ,
而且明显提高饱和光合速率 ,使水稻单株有效穗和
单株谷重增加 ,这与水稻在不同 CO2 浓度下的试验
结果十分吻合[12 ] 。说明 pepc、ppdk 基因在水稻植株
内有利于 CO2 的传输、同化和光合能力的提高 ,进而
增加产量。
从本研究结果还看出 ,导入一个基因的增产幅
度远不及两个基因。原因可能是 C4 光合途径是一
个多酶参与的系统 , PEPC 在 C4 途径中只是催化
HCO - 固定的酶 ,它的高表达能激活或促进诸如碳
酸酐酶的活性[11 ] ,要维持高表达还需要烯醇式丙酮
酸 (PEP)再生能力的提高 ,同时要保证 C4 酸能及时
脱羧释放出进入卡尔文循环的 CO2 , ppdk 基因的导
入及其高表达无疑对 C4 循环是一个很大的促进。
聚合 pepc 和 ppdk 基因后 ,植株有效穗数和单株产量
有了很大提高 ,但是 ,结实率却比对照低 ,从表 3 看 ,
培矮 64S/ CK水稻的结实率如果提高到 80 % ,产量
可达到 18. 4 t/ hm2。结实率的高低除了与亲本亲缘
关系较远有关外 ,可能与抽穗灌浆期光合产物分配
和叶功能期长短有关 ,有关问题的深入研究 ,将会促
进水稻产量的进一步提高。
在玉米植株内 ,C4 光合途径是在 kranz 结构的
外围叶肉细胞中进行的 ,通过基因工程将 C4 光合途
径中的关键酶基因导入水稻后 ,似乎还缺乏结构上
的支持 ,但近年来无论在水生植物还是陆生植物中
均发现无 kranz 结构而进行 C4 光合的植物[13~16 ] 。
本文的结果也表明将 C4 光合基因导入水稻 ,提高了
光合速率的事实 ,看来这一人工创造的新种质具有
类似初级的 C32C4 中间型植物的某些生理表
现[13~16 ] ,其机理值得进一步研究。
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