全 文 ：第 28 卷 第 1 期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 1
2002 年 1 月　 6～ 10 页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 6～ 10　 Jan. , 2002
对基因组原位杂交信号释译可能出现的片面性
——来自一个小麦易位系 (A-3)中外源遗传物质鉴定的启示α
茹岩岩1　张学勇1, 3 　李大勇1　游光霞1　晏月明2
(1中国农业科学院作物品种资源研究所, 农业部作物种质资源与生物技术重点实验室, 北京 100081; 2 首都师范大学生物系, 北京 100037)
摘　要　利用基因组原位杂交 (G ISH ) 和种子醇溶蛋白电泳 (A 2PA GE) 技术对一个可能携带有 10 倍体长穗偃麦草
( T h inop y rum p onticum (Host) L iu & W ang) 遗传物质的小麦新种质 A 23 进行了综合鉴定。用普通小麦“中国春”
(T riticum aesticum L. cv. Ch inese Sp ring) 基因组 (ABD )DNA 作探针, 拟鹅观草 [P seud oroeg neria stip if olia (Czern ex
N ersk i)A L ve, 10 倍体长穗偃麦草基因组可能供体种之一, 基因组为 St ]基因组DNA 作封阻进行原位杂交, 检测到
小麦的一对染色体与外源染色体发生了罗泊逊易位, 并证明该外源臂携带一个 18S25. 8S226S rDNA 位点。进一步分析
表明, 易位发生在B 基因组染色体上。种子醇溶蛋白电泳分析表明该材料具有黑麦 1R S 的标记位点G ldB 3。再用黑麦
(S ecale cereale L. R ) 基因组DNA 作探针, 普通小麦基因组DNA 作封阻进行 G ISH 分析, 最后证明该材料确为 1BL ö
1R S 易位系。本文还对 G ISH 分析中可能出现的假象进行了讨论。本文研究结果提示我们: 在鉴定外源染色体 (质) 时
必须非常慎重, 单凭一种技术很难得出准确的结论, 需要多种方法相互印证, 相互补充。
关键词　小麦; 10 倍体长穗偃麦草; 黑麦; 罗泊逊易位; 基因组原位杂交 (G ISH ) ; 种子醇溶蛋白
中图分类号: S512　　　文献标识码: A
R isk in Explana tion of GISH Signa ls: En l ightenmen t from Ver if ica tion of A l ien
Chroma tin in a W hea t Tran sloca tion L ine (A-3) by GISH
RU Yan2Yan1　ZHAN G Xue2Yong1, 3 　L ID a2Yong1　YOU Guang2X ia1　YAN Yue2M ing2
(1 ICGR of CA A S , K ey L ab of C rop Germ p lasm R esources & B iotechnology , M inistry of A g riculture, B eij ing 100081, P. R. China; 2D epartm ent
of B iology , Cap ital N orm al U niversity , B eij ing 100037)
Abstract　 Genom ic in situ hybridization (G ISH ) and acid po lyacrylam ide gel electrophoresis (A 2PA GE) of
gliadin w ere used to iden tify the alien ch rom atin in a novel germp lasm (A 23) derived from a w heat2T h inop y rum
p onticum hybrid. U sing genom ic DNA of“Ch inese Sp ring”(T riticum aestivum L. ABD ) as p robe, genom ic
DNA of P seud oroeg neria stip if olia (one possible genom e donor of T h. p onticum , its genom e is St) as block,
one pair of Robertson ian translocation ch romosom es w ere detected via G ISH. A n 18S25. 8S226S rDNA locus
w as located on the alien arm by F ISH of pT a71, a rDNA sequence iso lated from w heat. Further analysis of
G ISH w ith genom ic DNA p robes of the th ree dip lo id p rogen ito rs of T. aestivum respectively indicated that the
translocated ch romosom es w ere concern ing the B 2genom e ch romosom es. T he result of A 2PA GE of gliadin
show ed that A 23 conveyed the 1R S2specific gliadin m arker G ldB3. U sing rye (S ecale cereale L. R ) genom ic
DNA as p robe and common w heat genom ic DNA as block, it w as then p roved that A 23 w as a truly 1BL ö1R S
translocation line by G ISH. T he risk fo r m ak ing false exp lanation on G ISH signals caused by cross2hybridiza2
tion betw een genom es w as discussed. T he results indicate that w e m ust be p ruden t in exp lanation of the G ISH
signals and iden tification of alien ch romosom e. It is easy to draw a false conclusion if on ly a single techn ique is
adop ted. M ultip le m ethods should be used to confirm the results and check w ith each o ther.
Key words　W heat; T h inop y rum p onticum ; S ecale cereale; Robertson ian translocation; G ISH; Gliadin
基金项目; 国家自然科学基金资助项目 (39870494)。Foundation item: The N atural Science Foundation of China (39870494).
作者简介: 茹岩岩, 女, 1977 年生, 山东济宁人。中国农业科学院和首都师范大学联合培养硕士生。　 3 通讯作者。
Received on (收稿日期) : 2001206211, A ccep ted on (接受日期) : 2001207206

　　小麦的近缘属种中蕴藏着丰富的有益基因, 是
小麦遗传改良的重要基因源之一。通过栽培小麦与
近缘物种属间远缘杂交, 结合染色体工程, 进行定
向选择, 可将外源优良基因转移到小麦中[ 1 ]。而外
源基因的有效转移与利用, 在很大程度上依赖于对
导入小麦背景中的外源染色体或染色体片段的准确
鉴定。小麦背景下外源遗传物质的鉴定方法主要
有: (1) 经典的农艺性状及形态标记性状鉴定; (2)
以核型分析、染色体分带、非整倍体系统测交、染
色体配对行为分析等技术为手段的细胞学鉴定;
(3) 以同工酶电泳分析和贮藏蛋白组分分析等为主
的生化鉴定; (4) 原位杂交鉴定; (5) 分子标记技
术鉴定等[ 2 ]。本文报道了对一个新创制的小麦种质
A 23 中外源遗传物质的鉴定过程, 确定了该材料中
外源染色体片段的位置和来源, 同时讨论了在基因
组原位杂交中, 不同基因组之间的交叉杂交可能造
成的假象和误导。
1　材料和方法
1. 1　植物材料
待检测新材料A 23, 是普通小麦与 10 倍体长
穗偃麦草 (R 431) 的杂交后代, 其系谱为: 晋 2148ö
3ö北京 837ööFuhukoöR 431, 由中国农业科学院张
学勇选育。10 倍体长穗偃麦草 (T h inop y rum p on2
ticum (Host ) L iu & W ang, 2 n = 10 x = 70,
StStEeEbEx ) : 亲本编号为 R 431; 拟鹅观草 [ P seu2
d oroeg neria stip if olia (Czern ex N evsk i) A L ve 2 n
= 2 x= 14, St ]: P I313960; 黑麦 (S ecale cereale L.
2 n = 2 x = 14, R ) 品系: 武功 774; 普通小麦
(T riticum aestivum L. , 2 n= 6 x= 42, ABD ) 品种:
北京 837 (CA 837)、Fuhuko、晋 2148、中国春、京
411、矮孟牛、洛夫林 10 号等; 乌拉尔图小麦 (T.
u rartu T hum. , 2 n= 2 x= 14, A u) ; U R 1; 拟斯卑
尔脱山羊草 (A eg ilop s sp eltoid es T ausch, 2 n= 2 x=
14, Ss≈B ) : A e48 和粗山羊草 (A e. tausch ii Coss. ,
2 n= 2 x= 14, D ) : Y128。以上供试材料均由中国
农业科学院品种资源研究所保存。
1. 2　基因组总D NA 的提取和浓度测定
酚—氯仿法提取植物幼嫩叶片DNA [ 3 ]。DNA
浓度和纯度用 Pharm acia 公司的L KB U ltrospec Ë
紫外分光光度计测定。
1. 3　原位杂交
1. 3. 1　染色体制片　　种子在 22～ 25℃萌发, 待
根长至 0. 5～ 1. 5 cm 时, 取下根尖。根尖在冰水中
预处理 36 h, 卡诺固定液 (无水乙醇: 乙酸= 3∶1)
固定 2～ 3 天。45% 乙酸压片, 液氮冷冻揭片, 气
干, 待用。杂交前, 载片用 RN ase (100 ngömL )
37℃处理 1 h, 2×SSC 中漂洗 3×5 m in, 70%、
85%、95%、100% 酒精逐级脱水。
1. 3. 2　探针标记及封阻DNA 的处理　　基因组
DNA 和重组质粒 pT a71 经纯化后用 D IG2N ick
T ranslation M ix ( Boeh ringer M annheim ) 标 记。
pT a71 含有一个克隆自普通小麦的 9 kb 的插入片
段, 它包括编码 18S、5. 8S 和 26S rRNA 基因 ( rD 2
NA ) 和基因间的非编码序列[ 4 ]。封阻DNA 使用前
用超声波处理 5 m in。
1. 3. 3　杂交　　参照 Chen [ 5 ]的方法, 略有改进,
详细操作过程见文献[ 18 ]。
1. 3. 4　信号检测　　加 50 ΛL A nti2D IG2F ITC (1
～ 2 ΛgömL ) , 37℃保 温 1 h. 4 × SSCö0. 1%
Tw een20 37℃ 洗 3×8 m in, 最后用含适量 P I的抗
褪色剂封片。OL YM PU S B×60 荧光显微镜检测,
Fuji 400 彩色胶片摄影或利用计算机辅助的 CCD
(charge2coup led device) 成像系统 (SPO T TM , D IA G2
NO ST IC instrum en ts, In s. )采集图象。
1. 4　A-PAGE 分析
使 用 ISTA 于 1986 年 颁 布 的 A 2PA GE
(pH 3. 2) 标准程序[ 6 ] , 并加以改进; 电泳仪器为
B io2R ed 公司的 PRO T EAN ○R Ê x i Cell 型电泳槽。
2　实验结果
2. 1　原位杂交分析
2. 1. 1　用地高辛标记的普通小麦“中国春”(CS) 基
因组DNA 为探针, 20 倍的拟鹅观草基因组DNA
为封阻, 与A 23 根尖细胞进行杂交。荧光检测时,
有杂交信号的染色体或片段呈现黄绿色, 为普通小
麦的染色体; 没有杂交信号的染色体片段被 P I 衬
染呈红色, 这部分区域与 St 基因组同源性较高 (图
版É . 1) , 可清楚观察到小麦的一对染色体与外源
染色体发生了罗泊逊易位, 在外源染色体臂上距离
着丝点约 2ö3 的位置处, 有一条黄绿色的杂交带。
2. 1. 2　为了证明易位所牵涉的基因组, 我们先用
基因组原位杂交的方法, 分别显示出A、B、D 三个
基因组的染色体[ 7 ] , 当用拟卑尔脱山羊草基因组
DNA 作探针, 50 倍的乌拉尔图小麦和粗山羊草基
因组DNA 作封阻, 与A 23 根尖细胞杂交, 结果如
71 期　　　　　　　　　　　　茹岩岩等: 对基因组原位杂交信号释译可能出现的片面性　　　　　　　　　　　　　　　

图版É . 2 和图版É . 3a, 表明易位发生在B 基因组
染色体上。洗去杂交信号, 再与“中国春”基因组探
针杂交、St 作封阻, 更进一步证明了这一结论 (图
版É . 3b)。
2. 1. 3　用标记的重组质粒 pT a71 为探针, 与A 23
根尖细胞杂交, 检测该材料基因组中的 18S25. 8S2
26S rDNA 位点 (图版É . 4a) ; 洗去pT a71 杂交信号
和探针, St 作封阻, 再与“中国春”基因组DNA 探
针杂交, 结果发现: 外源染色体臂上有一个很强的
杂交带 (黄绿色条带) , 其位置与该染色体臂上的
18S25. 8S226S rDNA 位点完全相一致 (图版É .
4b) ; 而且该位点与 pT a71 的杂交信号明显高于普
通小麦所携带的 18S25. 8S226S rDNA 位点 (图版É . 4a) , 表明它所包含的 rDNA 重复单位的拷贝数
高于普通小麦 rDNA 位点。
图 1　A 23 的种子醇溶蛋白A 2PA GE 分析
a. 晋 2148　b. 京 411　c. 北京 837　d. Fuhuko　e. A 23
f. 洛夫林 10 号　g. 矮孟牛　h. 黑麦品系武功 774
i. 中国春。箭头所示为 1RS 特征带
F ig. 1　A 2PA GE analysis of gliadin illustrated that A 23 conveyed
the 1RS of rye, inherited from one of its parent, Beijing
837. The arrow s indicated the 1RS2specific bands. a. J in2148,
b. J ing411, c. CA 837 d. Fukuho, e. A 23, f. Lovrin 10,
g. A im enniu, h. Rye W ugong774 i. CS
2. 1. 4　用标记的黑麦基因组DNA 为探针, 15 倍
的“中国春”基因组DNA 为封阻, 与A 23 的染色体
杂交, 结果如图版É . 5 所示。有杂交信号的染色体
片段呈黄绿色为外源染色体, 无杂交信号的染色体
呈红色为小麦染色体。一对小麦染色体与外源染色
体之间发生了罗泊逊易位, 且杂交信号非常强, 但
在 18S25. 8S226S rDNA 位点区域无杂交信号, 呈一
橙红色条带。
2. 2　种子醇溶蛋白酸性聚丙稀酰胺电泳分析 (A-
PAGE)
种子醇溶蛋白A 2PA GE 分析 (图 1) 表明: 武功
774、矮孟牛、洛夫林 10 号、北京 837、以及A 23 都
含有黑麦 1R S 的标记位点G1dB 3[ 8 ]。结合原位杂交
结果, 说明A 23 确为 1R Sö1BL 易位系。黑麦染色
体臂 (1R S)上的 rDNA 位点应为N or2R 1, A 23 中的
1R S 可能来自其亲本之一的“北京 837”, 10 倍体长
穗偃麦草的染色体在选育过程中完全被排除。
3　讨论
1992 年本文第二作者配制的一个杂交组合
(Fuhuko×R 431)×北京 837, 其中R 431 为 10 倍体
长穗偃麦草 (T h. p onticum ) 的一个系, 这一组合的
F 1 具有抗病、晚熟的特性。将 F 1 再与“晋 2148”等
回交, 经两代自交, 选育出了一系列具有优良农艺
性状、相对稳定的新种质 (结果另文发表) , A 23 便
是其中之一。选育这批材料的主要目的是向普通小
麦中转移 10 倍体长穗偃麦草的遗传物质, 为小麦
遗传改良积累中间材料。在鉴定A 23 的染色体组成
时, 我们首先考虑的是它可能含有 10 倍体长穗偃
麦草的染色质。10 倍体长穗偃麦草含有 E 和 St 两
种基本基因组, 而且 E 和 St 的亲缘关系又非常
近[ 9 ]。在 G ISH 分析时, St 基因组DNA 常被用来
鉴定小麦背景下偃麦草的染色体或染色体片段[ 9 ]。
用“中国春”基因组DNA 为探针, St 基因组DNA
为封阻或用 St 基因组DNA 为探针, “中国春”基因
组DNA 为封阻, 都可鉴定出A 23 中的一对罗泊逊
易位染色体 (图版É . 1) , 至此, 似乎可以下一结
论: A 23 是小麦与 10 倍体长穗偃麦草的易位系。进
一步分析确定易位发生在B 基因组上, 外源染色体
臂距着丝点约 2ö3 处有一 rDNA 位点 (图版É . 22
4)。前人的工作表明: 偃麦草属植物与普通小麦易
位和代换绝大部分涉及到D 基因组染色体, 其次是
A 基因组染色体, 很少涉及到B 基因组染色体[ 2 ];
而且 10 倍体长穗偃麦草的 18S25. 8S226S rDNA 均
位于染色体顶端 (本课题组工作, 待发表) ; A 23 又
携带有黑麦 1R S 醇溶蛋白标记位点G ldB 3, 而 1R S
距着丝点约 2ö3 处又恰好有一 rDNA 位点 N or2
R 1[ 10 ]; 基于以上事实, 我们怀疑A 23 携带的外源染
8　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　28 卷

色体臂可能来自黑麦、而并非 10 倍体长穗偃麦草。
用黑麦基因组DNA 作探针, “中国春”基因组DNA
为封阻, 得到了很典型的 1R Sö1BL 易位系杂交图
象 (图版É . 5) , 对亲本材料的种子醇溶蛋白分析,
表明A 23 中的外源染色体臂可能来自于小麦品种
“北京 837”(图 1) , 后者是 1R Sö1BL 衍生物, 10 倍
体长穗偃麦草R 431 的染色体在A 23 选育过程中可
能完全被丢失。
1R Sö1BL 易位系在全球小麦改良和生产中发
挥了巨大的作用, 我国 80 年代育成的小麦品种大
多含有 1R Sö1BL 易位染色体[ 11, 12 ]。在利用远缘杂
交和染色体工程向小麦导入其他种属 (非 R 基因
组 ) 遗传物质时, 要注意弄清楚有无 1R S″污染″。
1R S 的存在使小麦的遗传背景更加复杂, 增加了对
杂种后代遗传分析的难度。因此, 利用 G ISH 鉴定
发现含有罗泊逊易位的材料后应该慎重, 最好能再
进行A 2PA GE 或 PCR 分析, 排除 1R Sö1BL 易位系
的干扰, 以提高鉴定的准确性。
基因组原位杂交是直接检测目标DNA 在细胞
核中存在与分布的一种较理想的技术, 特别有利于
鉴定附加系、代换系、易位系等遗传材料中外源染
色体或染色体片段和异源多倍体物种基因组组
成[ 13 ]。利用该技术已成功检测到小麦背景下大
麦[ 14 ]、黑麦[ 15、16 ]、中间偃麦草[ 17、18 ]、长穗偃麦
草[ 9, 19 ]、披碱草[ 20 ]、大赖草[ 21 ]、簇毛麦[ 22 ]等多种来
源的染色体或染色体片段, 其范围几乎涵盖了小麦
族的所有属。尽管 G ISH 具有快速、直观、操作简
便、不需分离特异性探针等优点, 但它也有一定的
局限性, 如: 单纯用 G ISH 无法确定外源染 色体或
染色体片段属于哪个同源群、代换系所取代的特定
染色体、易位系所发生的位置和断点 (breakpo in t) ;
此外, 当外源染色体与小麦染色体亲缘关系较近
时, 难以得到比较理想的杂交效果。
比较基因组学的研究表明: 尽管禾本科植物的
基因组大小差异很大, 但它们的功能基因数目大体
相当, 且在染色体上的排列次序也基本一致, 造成
它们基因组大小、结构差异的主要因素是重复序
列; 小麦族各个基因组之间序列同源程度很高, 而
且许多重复序列家族在它们之间是共享的[ 23, 24 ]。在
封阻DNA 存在的条件下, 原位杂交信号可能主要
由探针基因组DNA 中相对特异的重复序列所产
生。因此, G ISH 探针只是具有相对的“特异性”。封
阻DNA 与探针DNA 的选用以及二者之间的比例
是杂交成功与否、鉴定是否准确的关键。G ISH 可
产生多种假象; 当封阻DNA 量不足时, 部分普通
小麦染色体会出现杂交信号, 易被误认为是外源染
色体; 当封阻DNA 过量时, 又会降低信号的检出
率, 造成部分外源染色体或染色体片段“丢失”; 基
因组间共享的高度重复序列如 rDNA , 端粒序列等
也常被误认为是外源小片段易位 (图版É . 4a、4b) ;
特别值得一提的是用作探针的基因组与小麦基因组
关系越远, N or 区交叉杂交信号越明显, 主要原因
是关系越远, 背景越轻, 而N or 转录区在进化过程
中又十分的保守, 物种间差异极小; 再有一种情况
如本文所描述的现象, 不同来源的基因组之间的交
叉杂交, 容易造成对易位染色体片段来源的错误判
断 (图版É . 1, 5) , 类似的交叉杂交不仅会发生在 St
和R 基因组之间, 而且会在许多关系较近的基因组
间发生。因此, 对于不同的材料应结合其系谱, 选
择最合适的探针及相应的封阻, 同时优化实验程
序, 特别是探针和封阻的比例, 最好能进行实验对
照, 并作到多次重复, 才能作出判断。在推广品种
以及各研究机构创制的中间材料中, 由于频繁的人
工杂交和低频率的天然杂交, 不少材料的遗传背景
很复杂, 系谱模糊不清, 同一材料可能含有多种来
源的遗传物质, 因此在鉴定小麦背景下的外源遗传
物质时必须慎重, 不要轻易下结论, 单凭一种技术
难以作出完全准确的判断, 需要多种技术相互补
充、印证, 方为妥善。
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图版 I A-3 的原位杂交分析
1. “中国春”基因组DNA 作探针, 拟鹅观草基因组DNA 作封阻, G ISH 检测到一对罗泊逊易位染色体, 外源染色体呈桔红色 (箭头所
示) , 在外源染色体臂上有一很强的杂交带
2. 拟斯卑尔脱山羊草基因组DNA 作探针, 50 倍乌拉尔图小麦和粗山羊草基因组DNA 作封阻进行 G ISH 分析, 可以清楚的看到罗泊逊
易位发生在B 基因组染色体上。
3a、3b. 拟斯卑尔脱山羊草和“中国春”基因组DNA 作探针, 分别以A + D 和 St 作封阻, 对同一细胞进行G ISH 分析, 更进一步证实易位
发生在B 基因组染色体上。
4a. 用 pT a71 作探针进行原位杂交分析, 染色体上的绿点为N or 区。4b. 洗去探针, 用“中国春”基因组DNA 为探针, 20 倍 St 基因组
DNA 为封阻与同一细胞杂交, 证明外源染色体臂携带一个 18S25. 8S226S rDNA 位点。
5. 以黑麦基因组DNA 为探针, 15 倍的“中国春”基因组DNA 为封阻进行 G ISH 分析, 检测到罗泊逊易位染色体上的外源染色体臂与探
针强烈杂交, 呈桔黄色 (箭头所示)。
Pla te É Genom ic in situ hybr id iza tion ana lysis of a novel germ pla sm A-3
1. using genom ic DNA of Chinese Sp ring as p robe, genom ic DNA of P s. stip if olia as block, a pair of Robertsonian translocation chromosom es
w as detected. The alien arm s w ere orange2red (arrow s). A strong hybridization band (yellow 2green) w as observed on the alien arm.
2 & 3 show ed that the translocated chromosom es w as concerning w ith B genom e chromosom e. 2. A fter hybridization w ith A e. speltoid es (B)
genom ic DNA as p robe, blocked w ith genom ic DNA of T. urartu (A ) and A e. tausch ii (D ) , w heat B genom e2chromosom es w ere discrim inated
clearly by yellow 2green fluorescence. A rrow s indicated the Robertsonian translocation chromosom es. 3a & 3b. The sam e chromosom es are p robed
w ith A e. speltoid es and T. aestivum (ABD ) genom ic DNA blocked by A + D and St respectively.
4a & 4b illustrated the strong hybridization band on the alien arm w as the 18S25. 8s226S rDNA locus. 4a. Chromosom es at m etaphase w as first
hybridized w ith the pT a71, the green2yellow dots on chromosom es are N OR regions. 4b. A fter the pT a71 signals and p robesw ere striped aw ay, the
sam e chromosom es w ere subsequently re2hybridized w ith genom ic DNA p robe of Chinese Sp ring and blocked by St2genom ic DNA. The strong hy2
bridization signals appear again at the N OR regions on the Robertsonian translocated chromosom es (ho llow arrow ).
5. U sing rye genom ic DNA (R) as p robe and Chinese Sp ring genom ic DNA as block, the alien arm s on the Robertsonian translocation chromo2
som es w ere strongly p robed and appear in orange color (arrow s).
01　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　28 卷