全 文 ：Vol131 , No13
pp 1 374 - 380 　Mar1 , 2005作 　物 　学 　报ACTA AGRONOMICA SINICA第 31 卷 第 3 期2005 年 3 月 　374～380 页
小麦谷蛋白大聚合体亚基定量分析技术研究
熊玉英　张春庆 3 　李中存　高荣岐　尹燕枰 Ξ
(山东农业大学农学院 ,山东泰安 271018)
摘 　要 : 本文在 Fu 等 (1996)和 Bean(1998)蛋白提取方法的基础上 ,对面粉细度、提取温度、蛋白酶抑制剂以及正丙醇浓
度等方面进行了研究 ,建立了一种提取彻底 ,并且蛋白各组分间交叉污染较少 ,适于谷蛋白大聚合体亚基准确定量的提
取方法。具体步骤如下 :选用 200 目的面粉 ,首先用 0125 mol/ L 乙二胺四乙酸钠盐在 60 ℃下预处理 1 h ,然后再在 60 ℃下
用 45 %正丙醇提取单体蛋白 ,最后用样品提取液进行谷蛋白大聚合体的提取。谷蛋白大聚合体亚基的定量采用 Alpha
Innotech 公司的 ChemilmagerTM4400 型凝胶成像扫描仪 ,并与 Photoshop 710 处理软件相结合 ,研究了稳定的谱带面积测定方
法和稳定的灰度获取方法。建立了待测亚基含量的计算公式 CX = CS SX/ SS ×[1 + ( WS - WX) / (255 - WS - G) ]。
关键词 : 小麦 ;谷蛋白大聚合体 ;亚基 ;定量
中图分类号 : S512
A Method of Determing Subunit Quantitation of Wheat Glutenin Macropolymer
XIONG Yu2Ying , ZHANG Chun2Qing 3 , LI Zhong2Cun , GAO Rong2Qi , YIN Yan2Ping
( College of Agronomy , Shandong Agricultural University , Tai’an 271018 , Shandong , China)
Abstract :Protein is an important factor for bread quality , the variety with high quality subunit often brings about good bread
quality1 But only the type of subunit cannot explain all variation of bread quality , other factors , such as the content and
ratio of subunit also have a great influence to flour processing quality1 So far , there are many studies on the relation
between relative content of subunit and processing quality , however , but no reports about the relation among subunit
content , ratio and wheat quality1 The purpose of this experiment was to set up a method that subunit of wheat glutenin
macropolymer( GMP) could be quantified precisely , so the function could be studied thoroughly1
Based on Fu’s (1996) [13] and Bean’s ( 1998) [14] methods , the effect of granular diameter of flour , extraction
temperature (Fig11) , proteinase inhibitor ( Fig122B) and concentration of 12propanol to extraction were studied1 A new
method suited to quantifying GMP was set up , by which protein could be extracted thoroughly and GMP could avoid the
contamination with other protein fractions1 The procedure was as follows : firstly , flour grinded to 200 mesh sieve was
disposed with 0125mol/ L EDTA Na + for 1 h at 60 ℃; secondly , extracting monomeric proteins with 45 % 12propanol at
60 ℃; thirdly , extracting GMP from 45 % 12propanol insoluble fractions1 After electrophoresis of GMP , the peak area and
grey value of band were determined with ChemilmagerTM 4400 and Photoshop 710 software1 The content of each subunit
could be calculated with the equation CX = CS SX/ SS ×[1 + ( WS - WX) / (255 - WS - G) ]1
In order to verify the method set up , six wheat varieties were used to measure GMP content1 The range of GMP content
of six varieties was from 1184 % to 5166 % , and this range was consistent with that measured with biuret method1 It proves
that the method we have set up is applicable and precise1
Key words :Wheat ; Glutenin macropolymer ; Subunit ; Quantitation
基金项目 : 国家计委“山东省聊城大型优质小麦生产基地项目 (200021405)”。
作者简介 : 熊玉英 (1978 - ) ,女 ,在读硕士 ,现从事小麦品质的研究。3通讯作者 (Author for correspondence) :张春庆。E2mail :cqzhang @sdau1edu1cn
Received(收稿日期) :2003211228 ,Accepted(接受日期) : 20042042061

　　众多研究认为 ,蛋白质是决定面包加工品质的
重要因素[1～3 ] ,含有优质亚基的品种常常具有较好
的面包加工品质 ,某些亚基甚至可以作为优良加工
品质的标志[4～6 ] 。Payne 等研究表明 ,HMW2GS 的组
成与烘烤品质存在一定的相关性 ,且在不同的研究
中表现出一致性。如亚基 1Ax2 3 、1Dx5 + 1Dy10、
1Bx17 + 1By18 与品质指标呈正相关关系 ,而亚基
1Ax0、1Dx2 + 1Dy12 则呈负相关关系[4 ,5 ,7 ,8 ] 。然而仅
仅谷蛋白各亚基的类型并不能解释面包加工品质的
所有变异。蛋白质的其他因素 ,例如亚基的含量和
比例对面粉的加工品质性状也有较大影响[9 ] 。
Payne 等 (1979)首次利用 SDS2PAGE凝胶扫描确定了
高分子量谷蛋白亚基 1Ax1 的相对含量[7 ] ,Weegels
等 (1996)研究了单个 HMW2GS 亚基相对含量与 SDS
沉淀值和 Zeleny 沉淀值、面包体积及面团特性之间
的关系。结果表明 ,虽然由单个高分子量谷蛋白亚
基所解释的面包体积变异的比例很小 ,但它们不同
的研究结果相对一致[11 ] 。孙辉 (2000) 的研究表明 ,
谷蛋白亚基的相对含量与烘烤品质性状有一定的相
关性 , 但这种相关性受亚基和性状两方面的影
响[12 ] 。加工品质不仅受蛋白质亚基相对含量的影
响 ,更重要地受到蛋白质含量的影响 ,特别是谷蛋白
大聚合体的含量。但目前关于亚基绝对含量及其比
例与品质指标关系的研究还未见报道。本实验旨在
在前人对大聚合体亚基定性研究的基础上 ,建立其
各亚基准确定量的方法 ,以便更深入地研究谷蛋白
大聚合体的作用。
1 　材料与方法
111 　材料
　　选用 PH6209、PH8222、PH9724、PH99264、D208、
D9401 共 6 个小麦品种 (系) 。
112 　方法
11211 　小麦贮藏蛋白各组分的分离 　　参考 Fu 等
(1996)和Bean(1998)的方法 [13 ,14 ] 。前人的方法主要
用于蛋白亚基的定性研究 ,为了使蛋白质的提取尽
量完全和降低在提取过程中蛋白质的分解 ,在此基
础上分别从面粉细度、正丙醇提取单体蛋白的温度、
蛋白酶抑制剂、正丙醇的浓度等几个方面对大聚合
体定量提取的影响进行了研究。
11212 　小麦谷蛋白大聚合体的凝胶电泳 　　参考
Payne (1981) 的方法[15 ] ,采用不连续缓冲系统 ,浓缩
胶丙烯酰胺浓度为 3175 % ,分离胶为 10 % ,交联度
为 216 %。用 BIO2RAD 公司的 PROTEAN Ⅱ型电泳
槽 ,选用高度为 20 cm 的玻璃板 ,灌制 1 mm 厚的凝
胶。每板 15 孔 ,每孔上样 20μL。上样时 ,在每一张
凝胶板上都留出一个泳道只加入已知含量的牛血清
蛋白 ,作为标准蛋白 ,其他泳道加待测样品。用 Tris2
甘氨酸作电极缓冲液 ,每个泳道电流强度为 1 mA ,
电泳 12 h。过夜染色 (10 %的三氯乙酸 ,0108 %的考
马斯亮蓝 R250 ,5 %的乙醇) ,蒸馏水漂洗 1～2 d 后
拍照。
11213 　小麦谷蛋白大聚合体亚基的定量 　　谷蛋
白大聚合体亚基的定量采用 Alpha Innotech 公司的
ChemilmagerTM 4400 型 凝 胶 成 像 扫 描 仪 , 并 与
Photoshop 710 处理软件相结合。研究比较了不同扫
描方法 ,灰度获取方法对蛋白谱带定量的影响 ,从而
确定一种准确的蛋白定量方法。
2 　结果与分析
211 　面粉细度、提取温度对分离提纯效果的影响
　　选用 40 目、100 目和 200 目 3 种不同细度的面
粉。称量 01025 g ,加 015 mL 50 %正丙醇 ,分别在
25 ℃、40 ℃、60 ℃和 70 ℃下提取单体蛋白 ,水浴1 h。
然后 10 000 ×g 离心 10 min ,弃掉上清。在沉淀部
分加入 0125 mL 新鲜配制的样品提取液提取谷蛋白
大聚合体 ,60 ℃水浴 1 h ,10 000 ×g 离心 15 min ,重
复 3 次。
从图 1 可以看出 ,面粉细度的增加有利于蛋白
质的完全提取 ,40 目面粉提取 GMP 的 HMW2GS 与
100 目、200 目面粉相比 ,含量较低 ,谱带亮度较弱、
宽度较窄。温度的适当增加也有利于蛋白质的完全
提取 ,提取温度从 25 ℃升到 60 ℃时 ,每条带的蛋白
质含量都在增加 ,并且泳道的背景色降低 ,但是到
70 ℃时 HMW2GS 带变窄、变弱。原因是一方面高温
造成了部分蛋白质的分解 ,另一方面淀粉的糊化阻
碍了蛋白质的提取。
所以 ,用于蛋白质亚基定量研究的面粉细度应
当大于 100 目。并且 ,60 ℃是正丙醇的最佳提取温
度。另外 ,从图 1 上还可以看出 , HMW2GS 和 LMW2
GS之间还有一些醇溶蛋白的谱带 ,这说明单体蛋白
的提取不是很完全。
212 　正丙醇不同提取次数及提取时间对分离提纯
效果的影响
　　为了完全提取单体蛋白 ,正丙醇的提取次数和
提取时间 ,共设 1 h 1 次、1 h 2 次、015 h 1 次、015 h 2
573　第 3 期 熊玉英等 :小麦谷蛋白大聚合体亚基定量分析技术研究 　　　

图 1 不同面粉细度、提取温度的 GMP的电泳图谱
Fig11 Electropherograms of GMP extracted from the flour with
different gramular diameter at different temperature
1～4 :40 目面粉 ;5～8 :100 目面粉 ;
9～12 :200 目面粉。25 ℃(1 ,5 ,9) ;40 ℃(2 ,6 ,10) ;
60 ℃(3 ,7 ,11) ;70 ℃(4 ,8 ,12) 。
1 - 4 : flour of 40 mesh sieve ; 5 - 8 : flour of 100 mesh sieve ;
9 - 12 : flour of 200 mesh sieve1 25 ℃(1 ,5 ,9) ;
40 ℃(2 ,6 ,10) ; 60 ℃(3 ,7 ,11) ;70 ℃(4 ,8 ,12) 1
次、015 h 3 次 5 个处理。然后 ,进行谷蛋白大聚合
体的提取。
SDS2PAGE电泳结果表明 ,这部分单体蛋白并没
有因为提取次数的增加和提取时间的延长而被去
除。无限延长时间和增加提取次数只能是浪费时
间 ,并不能把这部分单体蛋白去除。正丙醇比较恰
当的提取时间和提取次数是 :015 h 3 次。
213 　蒸馏水预处理面粉对分离提纯效果的影响
淀粉粒内包被一部分蛋白。为了破坏淀粉粒 ,
促使淀粉粒内的单体蛋白提前释放出来 , 称量
01025 g 面粉 ,先加 015 mL 蒸馏水浸泡。以 25 ℃、
40 ℃、60 ℃分别处理 1 h、6 h、12 h、24 h ,然后用 015
mL 50 %正丙醇在 60 ℃下提取单体蛋白 ,水浴 015 h ,
重复 3 次。再进行谷蛋白大聚合体的提取。
从图 22A 可以看出 ,用 60 ℃处理 24 h 时 ,HMW2
GS和LMW2GS 之间的醇溶蛋白带可以被去掉。但
是 ,同时也造成了部分 HMW2GS的分解。
214 　蛋白质变性剂和蛋白酶抑制剂对蛋白分解的
抑制
　　为了抑制 HMW2GS 的分解选用了两种蛋白质
变性剂 (三氯甲烷 ,丙酮)和两种蛋白酶抑制剂 (碘乙
酸 ,乙二胺四乙酸) 。称量 01025 g 面粉 ,100 %三氯
甲烷和 80 %丙酮分别在 25 ℃、40 ℃、60 ℃下处理 1
图 2 蒸馏水、乙二胺四乙酸在 60 ℃下预
处理面粉不同时间后的 GMP的电泳图谱
Fig12 Electropherograms of GMP extracted with distilled
water and EDTA disposing for different time at 60 ℃
A :蒸馏水 60 ℃下预处理 24 h ;
B :015 mol/ L 乙二胺四乙酸 60 ℃下预处理 1 h。
A : disposing 24 h at 60 ℃with distilled water ;
B : disposing 1 h at 60 ℃with EDTA1
h、6 h、12 h、24 h ;0105 mol/ L、015 mol/ L 乙二胺四乙
酸钠盐分别在 25 ℃、40 ℃、60 ℃下处理 015 h、1 h ;
0105 mol/ L、011 mol/ L、015 mol/ L、1 mol/ L 碘乙酸分
别在 25 ℃、40 ℃、60 ℃下处理 1 h。
SDS2PAGE电泳结果表明 ,用丙酮和三氯甲烷处
理后 ,HMW2GS和 LMW2GS 之间的醇溶蛋白带没有
被提取掉 ;用碘乙酸处理后 ,亚基迁移率发生改变 ,
并且发生蛋白质的分解。
从图 22B 可以看出 ,用 015 mol/ L 乙二胺四乙酸
钠盐在 60 ℃下处理 1 h 后 , HMW2GS 和 LMW2GS 之
间很大一部分单体蛋白被去掉了。但是 ,谷蛋白大
聚合体中 HMW2GS 的含量与对照相比 ,稍微偏高。
所以 ,EDTA 钠盐不仅能降低蛋白质组分间的交叉
污染现象 ,而且还能有效抑制蛋白分解 ,增加蛋白质
的提取效果。另外 ,还发现 60 ℃是 EDTA 钠盐的最
佳反应温度。
215 　最适乙二胺四乙酸钠盐浓度的选择
高浓度的钠盐势必引起蛋白质溶解特性的改
变 ,为了降低这种影响 ,应当选择一个能够满足要求
的最低盐浓度。共设 0105、011、0115、012、0125、013、
0135、014、0145、015 mol/ L 10 个浓度。
SDS2PAGE电泳结果表明 ,随着 EDTA 钠盐浓度
673 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷 　

的升高 ,单体蛋白的去除越来越彻底。当 EDTA 钠
盐的浓度达到 0125 mol/ L 时 ,去除单体蛋白的效果
就稳定了。再增加 EDTA 钠盐的浓度 ,并不会带来
处理效果的改变 ,反而会因为盐浓度的增加而加大
蛋白溶解特性的改变。因此 0125 mol/ L 是 EDTA 钠
盐预处理面粉的最适宜浓度。
216 　不同乙二胺四乙酸钠盐处理时间对分离提纯
效果的影响
　　用 0125 mol/ L EDTA 在 60 ℃下处理 1 h 后 ,虽然
HMW2GS和LMW2GS之间的很大一部分单体蛋白被
提取掉 ,但是仍有部分ω2醇溶蛋白存在。所以 ,延
长 EDTA 处理时间 ,共设 1 h ,3 h ,6 h ,12 h ,24 h 5 个
处理。
SDS2PAGE 电泳结果表明 ,该部分ω2醇溶蛋白
并没有因为 EDTA Na + 处理时间的延长而被提取
掉 ,这说明它与谷蛋白具有相似的溶解特性。所以 ,
EDTA 钠盐预处理面粉的最佳时间是 1 h。
217 　对提取谷蛋白大聚合体后的面粉残渣用凯氏
定氮法进行含氮量的测定
　　提取谷蛋白大聚合体后的面粉残渣含氮量的多
少是蛋白质提取是否完全的标志。本实验比较了
EDTA 钠盐处理后的面粉残渣的含氮量与 Fu (1996)
方法提取的面粉残渣的含氮量。
从表 1 可以看出 ,面粉用 EDTA 钠盐处理后 ,残
渣中剩余氮的含量从未处理前的 0169 %降到
0153 % ,蛋白质的提取更加完全。
表 1 面粉残渣的含氮量
Table 1 Nitrogen content of flour remainder after extraction GMP
样品提取液的
提取次数 (次)
Times of extraction
N %(经 EDTA 处理的)
N %(treatment with EDTA)
N %[Fu(1996)方法]
N %[method of Fu(1996) ]
1 0199 ±0103 1107 ±0104
2 0154 ±0101 0171 ±0101
3 0153 ±0101 0169 ±0101
218 　正丙醇浓度的调整
面粉经 0125 mol/ L EDTA Na +处理后 ,首先用 11
种不同浓度的正丙醇提取单体蛋白 ,60 ℃水浴提取
015 h ,重复 3 次。浓度分别是 25 %、2715 %、30 %、
40 %、45 %、46 %、47 %、48 %、49 %、50 %、55 %。
继续往 45PS 中加入正丙醇使其浓度分别至
70 %、71 %、72 %、73 %、74 %、75 %。混匀后 ,室温静
置 1 h ,10 000 ×g 离心 10 min。在上清液中加入丙
酮使其浓度达到 80 % ,沉淀出所有的单体蛋白 ,用
样品提取液溶解后用于电泳分析。
从表 2 可以看出 ,45PI的 HMW2GS 的灰度与 Fu
等方法中的 50PI 的灰度相接近 ,即其含量相接近。
所以 ,45 %正丙醇是进行单体蛋白提取的适宜浓度。
表 2 谷蛋白大聚合体中 HMW2GS 的灰度
Table 2 Grey value of HMW2GS in GMP
高分子量谷蛋白亚基
HMW2GS 灰度 (45PI)Grey value (45PI) 灰度 (50PI)Grey value (50PI)
1 66 ±2183 65 ±4124
2 56 ±2183 48 ±1141
3 45 ±0 41 ±2183
4 67 ±1141 65 ±2183
　　SDS2PAGE电泳结果表明 ,当正丙醇的浓度低于
73 %时 ,单体蛋白中仍混有少量的谷蛋白 ,它是以
HMW2GS的存在作为标志的。当正丙醇浓度达到
73 %时 ,73PS中已经没有了 HMW2GS。这些结果表
明 ,73 % 12Propanol 应当是沉淀 45PS 中谷蛋白聚合
体而单体蛋白污染最少的最佳浓度。
经过以上研究得出 ,谷蛋白大聚合体分离提纯
的适宜路线和具体步骤如下 :
面粉
用 0125 mol/ L EDTA(pH 715) 预处理
用 45 % 正丙醇提取
45 % 正丙醇可溶性组分
45 % 正丙醇浓度增至 73 %
上清液
(单体蛋白)
沉淀
(可溶性谷蛋白)
45 % 正丙醇不溶性组分
GMP
(不溶性谷蛋白大聚合体)
称量已知含水量的 01025 g 面粉 ,用 015 mL
0125 mol/ L EDTA(pH 715) 预处理 ,每隔 15 min 振荡
1 次 ,60 ℃下处理 1 h ,然后10 000 ×g 离心 10 min ,上
清液中含有单体蛋白 ,贮存备用。继续把沉淀用
015 mL 45 %(V/ V) 12Propanol 提取 ,60 ℃水浴 015 h ,
然后 10 000 ×g 离心 10 min ,重复 3 次。这样得到两
种组分 ,溶于 45 % 12Propanol 的可溶性组分 (45PS)
和不溶于 45 % 12Propanol 的沉淀组分 (45PI) 。取
45PS 部 分 加 入 12Propanol , 使 丙 醇 终 浓 度 至
73 %( V/ V) ,将该混合物充分振荡后 ,室温下静置
1 h ,10 000 ×g 离心 10 min。这样又得到两种组分 ,
沉淀部分 (73PI) 为可溶性谷蛋白 ,上清液 (73PS) 为
单体蛋白。在 73PS中加入丙酮使其浓度达到 80 % ,
沉淀出所有单体蛋白。最后 ,分别在 45PI、73PI、
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73PS中加入新鲜配制的样品提取液 [ 0108 mol/ L
Tris2HCl (pH 618) ;2 % SDS( V/ V) ;1 % DTT( W/ V) ;
10 %甘油 ;01002 % ( W/ V ) 溴酚蓝 ]0125 mL ,60 ℃水
浴提取 1 h ,10 000 ×g 离心 15 min ,重复 2 次。上清
液即为备用样品 ,可用于上样。
219 　亚基定量方法
亚基的含量不仅与谱带的面积有关 ,而且也与
谱带的灰度有关。进行亚基定量时 ,首先需要研究
稳定的谱带面积测定方法和稳定的灰度获取方法。
21911 　谱带积分面积的测定 　　采用 Alpha
Innotech 公司的 ChemilmagerTM 4400 型凝胶成像扫描
仪进行数据处理。亚基的含量有两种表示方法 ,一
种是待测亚基浓度值占所有分析亚基总浓度值的百
分率 ,结果不稳定。另一种是用扫描峰的面积表示。
后者结果稳定 ,前者即使在同一泳道中 ,测得的同一
亚基的含量也随着所分析亚基数目的变化而变化。
从表 3 可以看出 ,调节处理软件规定的扫描峰
的最小宽度、最小高度、最小面积时并不改变某个亚
基的积分面积。只有大于处理软件所规定临界值的
谱带才会对应一个扫描峰 ,否则就会丢失这条谱带
的信息。
表 3 改变扫描峰的最小宽度、最小高度、最小面积时 ,同一泳道谱带扫描峰数目和面积的变化
Table 3 Change of peak area and number when alter the smallest peak width , peak area and peak height
最小高度
Smallest height
最小宽度
Smallest width
最小面积
Smallest area
扫描峰面积
Peak area
1 5 1 169 311 484 400 352 327 327 209 193 446 389 664
1 20 1 — — 484 — — — — — — 446 — 664
21912 　谱带灰度的测定 　　用 Photoshop 710 进行
灰度测定。灰度也有两种表示方法。一种是用所选
带的平均灰度表示 ,它受选带面积及选带部位的影
响 ,由于圈带时很难把握带的边缘 ,所以结果不稳
定 ;另一种是用所选带的最低灰度表示 ,结果稳定 ,
即使选上带范围以外的背景也不会对结果造成影
响。所以 ,用最低灰度表示谱带的灰度值结果较好。
灰度值的范围是从 0 到 255 ,0 表示全黑 ,255 表示全
白。另外 ,谱带的灰度受图像亮度和对比度的影响 ,
在不同的亮度和对比度下测得的同一谱带的灰度值
是不一样的。
表 4 不同亮度和对比度下的谱带灰度
Table 4 Band grey value under different brightness and contrast
亚基
Subunit
亮度 Brightness 对比度 Contrast
0 16 24 40 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
1 120 136 144 160 119 117 115 113 110 107 103 99 93 88 80 71 60
2 117 133 141 157 116 114 111 109 106 103 99 94 88 82 74 65 52
3 109 125 133 149 108 105 103 100 96 92 87 82 75 68 58 47 32
4 104 120 128 144 103 100 97 94 90 86 80 74 67 59 48 36 20
　　从表 4 可以看出 ,在不同亮度下 ,同一谱带的灰
度测定值之差等于亮度值之差。调整亮度对不同谱
带的影响是等同的。但是 ,在不同对比度下 ,同一谱
带的灰度测定值之差并不等于对比度之差。在低对
比度范围时 (对比度 < 35) ,调整对比度 ,谱带灰度的
变化速度较慢 ,随着对比度的升高 ,变化速度逐渐加
快。所以认为 ,在对比度为 0 的情况下 ,即不改变原
图像对比度的条件下 ,测量亚基的灰度较为准确。
综上 ,稳定准确测定谱带积分面积和灰度的方
法 ,首先用 ChemilmagerTM 4400 型凝胶成像扫描仪进
行图像处理 ,规定一个扫描峰的最小宽度、最小高度
和最小面积 ,只要含量大于规定临界值的亚基就会
对应一个扫描峰 ,软件可以自动读出峰的积分面积。
然后用 Photoshop 710 测定每一条带的灰度 ,打开一
幅凝胶照片 ,选定某泳道一条带 ,单击菜单栏中的
【图像】/【直方图】命令 ,弹出【直方图】对话框 ,在这
个对话框中显示一个由柱形图组成的峰 ,峰的宽度
表示该带灰度的变化范围 ,高度表示在该灰度下的
象素总数。用最低灰度来代表该条带的灰度。那
么 ,待测亚基的量就可以用下面的公式计算。
CX = CS S X/ S S ×[1 + ( WS - WX) / (255 - WS - G) ]
　　式中 , CX :待测亚基的量 ; CS :标准蛋白的量 ;
S X :待测亚基的扫描峰面积 ; S S :标准蛋白的扫描峰
面积 ; WS :标准蛋白的灰度 ; WX :待测亚基的灰度 ;
G :图像的亮度。
用该公式计算的亚基含量不仅考虑到亚基扫描
873 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷 　

峰的面积、亚基的灰度 ,而且还考虑到了图像的亮
度。用 ( WS - WX) / (255 - WS - G) 计算的灰度系
数 ,消除了图像亮度的影响 ,在一定程度上也降低了
图像对比度对灰度测定值的影响。因此 ,用该公式
计算亚基含量更加准确。
2110 　用上述定量方法测得的 6 个小麦品种谷蛋白
大聚合体亚基的含量
表 5 6 个小麦品种谷蛋白大聚合体中亚基的含量
Table 5 Subunits content of GMP in six wheat varieties(μg)
亚基分子量
Subunit molecular
(kDa)
品种 Cultivar
PH6209 PH8222 PH9724 PH99264 D208 D9401
141100 120186 ±1117　 0 0 0 0 0
139141 0 56121 ±0135 65161 ±0147 0 0 0
131169 82103 ±0190 0 0 0 0 174156 ±0182
128172 0 79124 ±0178 0 0 153120 ±0178 0
127127 0 0 129116 ±1119 0 0 0
124140 0 0 0 199138 ±0152 0 0
113157 53147 ±0117 0 0 0 0 0
107128 0 0 0 210159 ±0195 0 139192 ±0188
106106 0 86135 ±0152 222178 ±0131 0 0 0
103168 0 0 0 0 185169 ±0118 0
99106 0 134176 ±1112 0 0 0 0
84146 0 0 0 245158 ±0158 0 0
83150 56198 ±0137 0 180159 ±0190 0 0 0
82156 0 179119 ±0165 0 0 188147 ±0128 150193 ±0117
58133 0 0 0 0 0 96174 ±0176
53133 0 0 0 0 155179 ±0164 0
50100 17133 ±0195 0 0 44189 ±0122 0 0
46167 0 241157 ±1106 79152 ±0147 67130 ±0126 106197 ±0183 83114 ±0171
45100 60107 ±0134 0 0 0 91121 ±0158 0
43133 0 0 0 0 0 105129 ±0147
41167 0 176155 ±0154 309119 ±0162 0 0 0
40100 0 0 0 210181 ±0188 0 0
38133 0 0 168164 ±0137 0 0 0
35100 0 322160 ±0116 158115 ±0168 0 219141 ±0126 0
33133 0 0 0 193119 ±0156 0 0
30100 0 127143 ±0196 0 0 134173 ±0157 0
21167 9116 ±0114 0 0 0 0 0
16167 36145 ±0141 0 0 0 0 0
GMP 含量
GMP content ( %) 1184 5166 5147 4169 4192 311
　　注 : 分子量是以 Marquis 为对照 ,采用 ChemilmagerTM 4400 型凝胶成像扫描仪测得的。
Note : Molecular weight was measured by ChemilmagerTM 4400 , Marquis was used as control1
　　从表 5 可以看出 ,6 个小麦品种 GMP 的最低含
量为 1184 % ,最高含量为 5166 %。其含量范围与用
双缩脲法测得的 GMP 的含量范围一致。
3 　讨论
本文通过对蛋白质的提取及电泳图象分析 ,建
立了一种用于小麦谷蛋白大聚合体亚基的定量方
法。在提取方法上 ,与前人定性研究谷蛋白大聚合
体亚基时有所不同。定量研究要求蛋白质的提取尽
量完全 ,而面粉细度的增加有利于蛋白质的完全提
取。本实验首先表明 ,进行定量研究的面粉细度应
当大于 100 目。其次 ,称量好的面粉要求先用乙二
胺四乙酸钠盐预处理 ,这不仅解决了高温带来的蛋
白质分解问题 ,而且也使蛋白质的提取更加完全 ,降
低了蛋白质不同组分间的相互污染。另外 ,为了促
进单体蛋白的提取 ,降低其对 GMP 的污染 ,将正丙
醇提取单体蛋白的温度提高到 60 ℃,并增加提取次
数。最后 ,调整正丙醇的浓度 ,与 Fu 等 (1996) [13 ]的
方法相比 ,提取单体蛋白的浓度由 50 %降为 45 % ,
沉淀 45PS 中谷蛋白聚合体的浓度由 70 %升至
73 % ,防止了加入 EDTA Na + 带来的蛋白质溶解特性
的改变。
亚基的含量不仅与谱带的面积有关 ,而且也与
谱带的灰度有关。在定量方法上 ,首先研究了稳定
的谱带面积测定方法和稳定的灰度获取方法 ,并研
究比较了图像亮度和对比度对谱带灰度的影响。在
不同亮度下 ,同一谱带的灰度测定值之差等于亮度
值之差 ,但关于对比度与谱带灰度值的关系还需进
973　第 3 期 熊玉英等 :小麦谷蛋白大聚合体亚基定量分析技术研究 　　　

一步研究。本方法是用扫描峰的积分面积及灰度系
数来表示对应亚基的含量 ,充分考虑到谱带面积及
灰度与蛋白质含量的关系 ,与以往只用扫描峰的积
分面积来表示亚基含量相比 ,更加准确、可靠。从而
使蛋白质各亚基的准确定量成为可能 ,克服了以往
蛋白质的定量只是一个相对含量的局限性。
References
[1 ] Schofield J D , Booth M R1 Wheat proteins and their technological
significance1 In : Hudson B J F ed1 Developments in Food Proteins1
Vol121 Applied Science Publishers Ltd , Barking , Essex , UK1 19831
1 - 65
[2 ] Shewry P R , Miflin B J1 Seed storage proteins of economically important
cereals1 In : Pomeranz Y ed1 Advances in Cereal Science and
Technology1 Vol171 AACC , St1 Paul , MN , USA1 19851 1 - 83
[3 ] Wrigley C W , Bietz J A1 Proteins and amino acids1 In : Pomeranz Y ed1
Wheat Chemistry and Technology1 AACC , St1 Paul , MN , USA , 19881
159 - 275
[4 ] Lorenzo A , Kronstad W E , Vieira L G E1 Relationships between high
sodium dodecyl sulphat sedimentation test1 Crop Science , 1987 , 27 :
253 - 257
[5 ] Payne P I1 Genetics of wheat storage protein and the effect in allelic
variatuin in bread making quality1 Ann Rev Plant Physiol , 1987 , 38 :
141 - 153
[ 6 ] Lawrence GJ , MacRitchie F , Wrigley C W1 Dough and baking quality of
wheat lines deficient in glutenin subunits controlled by the Glu2A1 , Glu2
B1 and Glu2D1 loci1 Journal of Cereal Science , 1988 ,7 : 109 - 112
[7 ] Payne P I , Corfield K G1 Subunit composition of wheat glutenin proteins
　 isolated by gel filtration in a dissociating medium1 Planta , 1979 , 145 :
83 - 88
[8 ] Rogers W J , Payne P I , Harinder K1 The HMW glutenin subunits and
gliadin compositions of German2grown wheat varieties and their
relationship with bread2making quality1 Plant Breed , 1989 , 103 : 89 -
100
[9 ] Huang D Y, Khan K1 quantitative determination of high weight molecular
weight glutenin subunits of hard red spring wheat by SDS2PAGE1 Ⅱ1
Quantitative effects of individual subunits on breadmaking quality
characteristics1 Cereal Chem , 1997 , 74 : 786 - 790
[10 ] Payne P I , Corfield K G, Blackman J A1 Identification of a high2
molecular2weight subunit of glutenin whode prence correlates with bread2
making quality in wheats of related pedigee1 Theor Appl Genet , 1979 ,
55 : 153 - 159
[11 ] Weegels P L , Hamer R J , Schofield J D1 Critical review functional
properties of wheat glutenin1 Cereal Science , 1996 , 23 : 1 - 18
[12 ] Sun H(孙辉) , Li B2Y(李保云) , Wang Y2G(王岳光) , Zhang S2Z
(张树榛) , liu G2T(刘广田) 1 Correlation between glutenin subunits
and bread2making quality characteristics of common wheat1 Journal of
China Agricultural University (中国农业大学学报) , 2000 , 5 (3) :
18 - 24(in Chinese with English abstract)
[ 13 ] Fu B X , Sapirstein H D1 Procedure for isolating monomeric proteins and
polymeric glutenin of wheat flour1 Cereal Chem , 1996 , 60 : 65 - 71
[ 14 ] Bean S R , Lyne R K, Tilley KA , Chung O K, Lookhart GL1 A rapid
method for quantitation of insoluble polymeric protein in flour1 Cereal
Chemistry , 1998 , 75 : 374 - 379
[15 ] Payne P I , Holt LM , Law C N1 Structural and genetical studies on the
high molecular subunits of wheat glutenin1 Theor Appl Genet , 1981a ,
60 : 229 - 236
083 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷