全 文 ：Vol. 29 , No. 6
pp. 806～809 　Nov. , 2003
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 29 卷 第 6 期
2003 年 11 月 　806～809 页
利用花粉管通道法将 cry Ia 基因导入小麦
侯文胜1 , 3 　郭三堆2 , 3 　路　明1 Ξ
(1西北农林科技大学农学院 ,国家小麦改良中心杨凌分中心 ,陕西杨凌 712100 ;2中国农业科学院生物技术研究所 ,北京 100081)
摘 　要 　利用适用于禾谷类作物的表达载体 pGU4ABBar ,采用花粉管通道法 ,将人工合成的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基
因 cry Ia 导入了优良冬小麦品系西农 2208 和西农 132 ,经 PCR 和 Southern blot 鉴定 ,证明获得了 27 株导入了 cry Ia 基因的
转基因植株 ,转化率约为 1. 13 %～1. 21 % ,并通过 Western blot 鉴定检测到了目的蛋白的表达。
关键词 　遗传转化 ; 小麦 ; 基因 ; 质粒 ; 蛋白质
中图分类号 : S512 　　　文献标识码 : A
Development of Transgenic Wheat with a Synthetical Insecticidal Crystal Protein
Gene via Pollen2tube Pathway
HOU Wen2Sheng1 , 3 　GUO San2Dui2 , 3 　LU Ming1
(1 Yangling Branch of China Wheat Improvement Center , College of Agronomy , Northwest Sci2Tech University of Agriculture and Forestry , Yangling , Shaanxi
712100 ; 2 Biotechnology Research Institute , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100081 , China)
Abstract 　The cryIa gene , a synthetical insecticidal crystal protein gene of Bacillus thuringiensis , was transferred into the
wheat varieties Xinong 2208 and Xinong 132 using the gramineous expression vector pGU4ABBar by pollen2tube pathway.
By PCR and Southern blotting analysis 27 transgenic plants with cryIa gene were obtained. Western blotting analysis
showed that the protein was expressed in the transgenic plants. The transformation frequency was about 1. 13 %—1. 21 %.
Key words 　Transformation ; Wheat ; Gene ; Plasmid ; Protein
　　小麦虫害每年都会造成相当严重的产量损失 ,
因此尽快将小麦现有种质资源中非常缺乏的抗虫基
因导入小麦 ,创造转基因小麦抗虫新种质是非常必
要的[1 ] 。郭三堆等合成的碱基序列经过优化的苏云
金芽孢杆菌 ( Bacillus thuringiensis ,简称 Bt) 杀虫蛋白
基因 cryIa 是我国拥有自主知识产权的新型杀虫基
因 ,其编码的蛋白对鳞翅目 ( Lepidoptera) 害虫具有毒
杀作用 ,在转基因抗虫棉的选育中已发挥了良好的
作用[2 ] 。利用以该基因为主体构建的适合应用于小
麦的植物表达载体进行小麦遗传转化 ,可为小麦的
转基因研究及抗虫新种质的创造提供研究基础。
花粉管通道法早在 20 世纪 70 年代末 80 年代
初就已在远缘杂交中开始应用[3 ,4 ] ,曾君祉等和
Chong 等先后用该法转化小麦 ,经过筛选、Southern
blot 和 Northern blot 鉴定以及基因表达产物检测 ,证
实获得了小麦转基因植株[5 ,6 ] ,目前 ,花粉管通道法
已运用在多种作物中并获得成功 ,确定了其在 DNA
直接转化法中的地位。
本研究利用自行构建的载体进行了花粉管介导
的小麦遗传转化 ,并获得了可育转基因植株及其分
子生物学检测证据。
1 　材料与方法
1. 1 　材料
1. 1. 1 　小麦材料 　　选用小麦优质高产品系西农
2208 和西农 132。
1. 1. 2 　质粒 　　选用基础质粒 p G4AB[2 ] 及转化质
粒 p GU4ABBar , 其中 p GU4ABBar 质粒是由质粒Ξ基金项目 :“九五”国家重点科技攻关资助项目 (专题) (962009201214) ,杨凌农业生物技术育种中心开放课题资助项目 (1999219) 。
作者简介 :侯文胜 (1969 - ) ,男 ,北京市人 ,博士 ,副研究员 ,主要从事小麦基因工程和遗传育种研究。3 通讯作者 :侯文胜 ,郭三堆 E2mail :
houwensheng @163. net ΠΠgsdui @public. bta. net . cn
Received(收稿日期) :2002208205 ,Accepted(接受日期) :2003201226.

pAHC20[7 ] Hind Ⅲ酶切位点插入了 Ubiqution 启动子
驱动下的 cry Ia 基因表达盒构建而成[8 ] 。
1. 1. 3 　菌株 　　大肠杆菌 ( Escherichia coli) DH5α菌
株。
1. 2 　方法
1. 2. 1 　小麦的转化及筛选 　　选取将要开花的麦
穗剪去麦芒和上部约 1Π4 颖壳 ,标记麦穗备用 ,麦穗
授粉 1～3 h 后剪去柱头 ,用微量注射器滴上 5～10
μL 0. 1μgΠμL 质粒 DNA ( PEG纯化) ,转化麦穗套袋
后 ,标明转化受体和质粒 ,待小麦正常成熟后收获转
化种子 ,转化种子在含 5 mgΠL Basta 的筛选液[9 ]中发
芽 ,抗性苗温室移栽后 1 周涂抹 5 mgΠL Basta 进一步
筛选 ,抗性苗喷洒 40 mgΠL Basta 进一步筛选 ,标记抗
性苗进行鉴定。
1. 2. 2 　转化植株的鉴定 　　提取抗性苗叶片 DNA ,
利用根据 cry Ia 基因序列设计的引物进行 PCR 初步
鉴定 ,以酶切 p G4AB 质粒回收的约 1. 4 kb 大小的
cry Ia 基因片段为探针参照[10 ]的方法进行 Southern
dot blot 和 Southern blot 鉴定 ,并提取叶片蛋白进行
Western blot 鉴定 ,其中探针制备采用 Promega 随机
引物探针标记试剂盒 ,利用同位素标记探针 ,酶切的
Southern blot 鉴定提取了约 30μg 植物 DNA ,过量酶
切 16～20 h , Bt 杀虫蛋白及抗血清由北京大学许崇
仁教授提供。
2 　结果与分析
2. 1 　转基因小麦植株的获得
2. 1. 1 　遗传转化的不同处理设置及除草剂筛选 　
　转化种子经除草剂筛选 ,获得生长正常的抗性苗 ,
初步标记株号以备进一步筛选。获得的除草剂抗性
苗在温室中正常成熟 ,但结实相对较差。花粉管通
道法介导的遗传转化的不同处理设置及其种子的获
得和除草剂筛选情况见表 1。
表 1 不同处理的种子收获和除草剂筛选情况
Table 1 Setting and Basta resistance plants of different process
处理
Experiment
小麦品系
Wheat line
转化小花数
No. of
floret
结实数
No. of
setting
抗性苗数
No. of Basta
resistance plant
FT2 Xinong132 1506 988 26
FT5 Xinong2208 1512 1322 32
　　由表 1 可见 ,两个转化处理均得到了除草剂抗
性苗 ,但结实率低于正常水平 ,这可能是转化过程中
的机械损伤所致。
2. 1. 2 　除草剂抗性植株的 PCR 鉴定 　　以 5’2CCA
TAC AAC TGC TTG AGT AAC CCA GAA GTT G23’Π
5’2 GGG CCC GCT GAA TCC AAC TGG AGA GGC23’
为引物在转化植株中对 cry Ia 基因进行 PCR 检测 ,
其 PCR 产物的电泳结果见图 1。
图 1 除草剂抗性植株的 cry Ia PCR 检测
Fig. 1 PCR testing of Basta resistance plants for cry Ia gene
M:100 bp ladder ;1 :CK+ (p GU4ABBar) ;2 :CK- (Xinong 2208) ;
Other :Basta resistance plants
图 2 PCR 阳性植株的 cry Ia Southern 斑点杂交分析
Fig. 2 Southern dot blotting analysis of PCR positive plants
CK+ : p GU4ABBar ;1CK- :Xinong 132 ;2CK2 :Xinong 2208 ;
1 —51 :PCR positive plants
由图 1 可以看出 ,利用根据 cry Ia 基因序列设
计的引物 ,在质粒阳性对照 (p GU4ABBar) 和多数除
草剂抗性植株中扩增出了约 960 bp 的特异性片段 ,
而在阴性对照和少数除草剂抗性植株中未扩增出目
的片段 ,证明在多数除草剂抗性植株中可能有 cryIa
基因序列的插入。在 58 株除草剂抗性植株中有 51
株表现为 PCR 阳性 ,其中 FT2 中 23 株、FT5 中 28
株。
2. 1. 3 　PCR 阳性植株的 Southern 鉴定 　　为较为
准确地估算转化频率 ,以 Pst Ⅰ酶切 p G4AB 质粒
DNA ,回收约 1. 4 kb 大小的包含 cry Ia 基因部分序
列的 DNA 片段制备探针 ,对 51 株 PCR 阳性的植株
叶片 DNA 进行 Southern 斑点杂交后发现 ,其中 27 株
有明显的杂交信号 (见图 2) ,进一步确证了这些植
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株中有 cry Ia 基因序列的插入 ,其中 12 株来自于
FT2、15 株来自于 FT5 ,以实际收获的种子数为基数 ,
其转化频率分别约为 1. 21 % (12Π988) 、1. 13 % (15Π
1322) 。这些阳性植株依次编为正式系谱号 ,分别为
FT221～FT2212 和 FT521～FT5215。
以 Pst Ⅰ酶切 p G4AB 质粒 DNA ,回收约 1. 4 kb
大小的包含 cry Ia 基因部分序列的 DNA 片段制备
探针 ,以 Hind Ⅲ酶切小麦叶片 DNA (约 30 μg) 及
p GU4ABBar质粒 DNA 进行 Southern 杂交分析 ,用于
鉴定的小麦植株分别选自不同处理中 Southern 斑点
杂交信号明显且生长较好的植株 ,鉴定结果见图 3。
图 3 转基因植株的 cry Ia Southern 杂交分析
Fig. 3 Southern blotting analysis of transgenic plants
M: 1 kb DNA ladder ;1 :CK+ (p GU4ABBar) ;2 :CK- (Xinong2208) ;
3 :FT221 ; 4 :FT222 ;5 :FT224 ;6 :FT229 ;
7 :FT2212 ;8 :FT521 ;9 :FT524 ;10 :FT525 ;11 :FT528 ;12 :FT5215
由图 3 可以看出 ,选用的小麦植株中 FT221、
FT222、FT224、FT229、FT2212、FT521、FT524、FT525 和
FT528 叶片 DNA 经 Hind Ⅲ酶切电泳后进行 Southern
杂交 ,出现了约 4. 3 kb 大小的阳性目的带 ,与阳性
对照 p GU4ABBar 质粒 DNA 经 Hind Ⅲ酶切杂交后的
结果相符 ,该片段相当于 cry Ia 基因完整表达盒的
大小 ,证明 cry Ia 基因表达盒已完整整合于转基因
小麦的基因组中 ,但 FT5215 未出现明显的杂交信
号。
2. 2 　转基因植株中 Bt 蛋白的表达
为了检测 cry Ia 基因在转基因小麦植株中的表
达情况 ,选取部分 Southern 杂交呈阳性的植株 ,利用
相应的兔抗血清和小麦叶片可溶性蛋白进行了
Western 杂交分析 ,检测结果见图 4。
由图 4 可以看出 ,转基因植株 FT221、FT222、
FT229、FT521、FT525、FT528 和阳性对照 (Bt 纯品蛋
白)在同一位置均出现了明显条带 ,约为 60 kD 大
小 ,相当于完整的 Bt 蛋白大小 ,表明转基因植株表
达出了完整的 Bt 蛋白。
图 4 转基因植株的 Bt 蛋白 Western 杂交分析
Fig. 4 Western blotting analysis of transgenic plants
1 :CK+ (50ng Bt protein) ;2 :CK+ (20ng Bt protein) ;
3 :CK- (Xinong2208) ;4 :FT221 ;5 :FT222 ;6 :FT229 ;
7 :FT521 ;8 :FT525 ;9 :FT528
3 　讨论
本研究分别以优良冬小麦品系西农 2208 和西
农 132 为受体 ,利用花粉管通道法 ,获得了 27 株导
入了 cry Ia 基因的转基因小麦植株 ,转化率约为
1113 %～1121 % ,并得到了 Southern 斑点杂交的确
证 ,酶切 Southern 杂交分析证明目的基因表达盒已
完整整合于转基因小麦的基因组中 ,Western 杂交分
析检测到了目的蛋白的表达。
cry Ia 基因在转基因抗虫棉的选育中已发挥了
良好的作用 ,其编码的蛋白对鳞翅目 ( Lepidoptera) 害
虫具有毒杀作用[2 ] ,对棉铃虫具有较好的毒杀作用 ,
本研究的目的是进一步筛选到对小麦鳞翅目害虫
(如粘虫、麦蛾等)具有抗性的小麦植株 ,为小麦抗虫
育种提供新种质。目前 ,转基因植株后代的抗虫性
鉴定和抗虫品系的选育正在进行中。
花粉管通道法早在 20 世纪 70 年代末 80 年代
初就已在远缘杂交中开始应用[3 ,11 ] ,随着现代生物
技术的不断发展 ,该方法已可完全按照分子生物学
常规手段进行筛选和检测 ,转化效果确实可信 ,确定
了其在小麦 DNA 直接转化法中的地位[5 ,6 ] ,并在我
国转基因抗虫棉育种中发挥了重要作用[2 ] 。
除操作简单、成本低廉等优点外 ,花粉管通道法
最大的优点在于无需经过组织培养过程 ,可直接获
得转化种子 ,为研究提供了更多的方便[11 ] 。对于小
麦而言 ,愈伤组织的分化能力在很大程度上受基因
型的影响 ,这使其转化材料的选用受到很大限制 ,同
时 ,组织培养过程中的影响因素也很多 ,使得基因枪
等方法在具体应用中尚存在着很大的局限性[12 ] 。
尽管目前利用花粉管通道法介导的小麦遗传转化效
率还不高 ,但由于可避免组织培养等诸多麻烦和摈
弃基因枪等昂贵的仪器和试剂 ,其应用前景不容忽
视 ,也更适合我国国情。实际上 ,通过小麦远缘杂交
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育种的成功实践 ,我们不难看出 ,只要能保持千分之
几的转化率 ,这一方法就完全可用于育种实践 ,在多
数小麦远缘杂交的组合中 ,杂交结实率要远远低于
这一频率[13 ] 。
就目前的研究现状来看 ,花粉管通道法介导的
小麦遗传转化程序在很大程度上还可进一步优化和
改良 ,例如对待转化麦穗进行控制授粉从而更为精
确地掌握转化最佳时间、筛选转化用 DNA 介质提高
其进入胚囊的几率等等。总之 ,应正确估价花粉管
通道法在小麦遗传转化中的地位 ,并优化规范其转
化程序 ,提高其转化效率和重复性。
国内外大量转基因作物的商品化生产实践已确
立了转基因技术在创造植物新种质和新品种中的地
位 ,尽管目前还没有小麦转基因品种商业化生产的
先例 ,但从玉米、水稻等粮食作物的转基因品种商品
化生产现状来看 ,这仅仅只是个时间问题 ,当然 ,基
于基因安全性的考虑 ,在选用目的基因上还应当慎
重[14 ,15 ] 。
致　谢 　北京大学许崇仁教授提供了 Bt 杀虫蛋白
及抗血清 (多克隆抗体) 。西北农林科技大学王辉教
授、何蓓如教授提供了小麦材料。
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