全 文 ：24 种香稻品种甜菜碱醛脱氢酶 2 基因突变位点
的分析及分子标记开发*
徐小龙, 赵国超**, 李建粤***
(上海师范大学生命与环境科学学院, 上海摇 200234)
摘要: 根据香型与非香型水稻甜菜碱醛脱氢酶 2 基因 (badh2) 在第 2、 第 4 内含子、 第 7 外显子 3 处序列
差异和第 2 外显子 1 处序列差异, 分别设计了两类检测 badh2 第 7 和第 2 外显子突变的功能性分子标记引
物 M7 和 M2; 利用两类引物, 分别对属于第 7 外显子突变的香型水稻 W香 99075 和第 2 外显子突变的香
型水稻武香 14、 非香型水稻以及两种香稻分别与非香稻杂交的 F1植株基因组 DNA进行 PCR检测后发现,
M7和 M2 引物完全能够分别被用于以第 7 和第 2 外显子突变的香稻作为亲本, 进行分子标记辅助培育香
稻新品种的研究。 M7 引物综合考虑了 badh2 内含子和外显子两方面突变情况而设计的。 以非香稻 261S、
分别发生第 7 和第 2 外显子突变的香稻品种W香 99075 和武香 14 为对照, 使用 M7 和 M2 引物, 对本实验
室收集的另外 22 份香稻品种进行 badh2 突变位点检测, 结果可将这些香稻分为 badh2第2外显子突变类型、
第 7外显子突变类型和外显子未发生突变类型, 同时明确了大多目前在上海等周边地区种植的香稻品种的
badh2 所属的突变位点。 开展本研究为利用分子标记辅助选育香型水稻新品种研究奠定了重要的基础。
关键词: 香稻; 甜菜碱醛脱氢酶 2 基因 (badh2); 功能性分子标记引物; 突变位点分析
中图分类号: Q 75摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2011)06-667-07
Development of Molecular Markers Used to Identify Two Types
of Fragrant Rice and Analysis of Mutation Sites of
BADH2 Gene in 24 Varieties of Fragrant Rice
XU Xiao鄄Long, ZHAO Guo鄄Chao**, LI Jian鄄Yue***
(College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)
Abstract: Functional molecular markers M7 and M2 have been developed based on the DNA sequence differences of
badh2 between fragrant rice varieties and non鄄fragrant varieties in intron2, intron 4, exon7 and exon 2 respectively.
PCR analyses on genome DNA of exon7鄄mutated fragrant rice Wxiang 99075, exon2鄄mutated fragrant rice Wux鄄
iang14, non鄄fragrant rice 261S and the F1 plants by M7 and M2 showed that M7 and M2 could be absolutely used to
the molecular marker鄄assisted rice breeding experiments when exon7鄄mutated and exon2鄄mutated fragrant rice varie鄄
ties are used as parents. The design of M7 primers took mutations both in exons and intrones into account. Moreo鄄
ver, taking 261S, Wxiang 99075 and Wuxiang14 as controls, the mutation sites of badh2 in 22 fragrant rice varie鄄
ties were analyzed, it was showed that fragrant rice varieties could be classified into 3 types: exon 2鄄mutated fragrant
rice, exon 7鄄mutated fragrant rice and non鄄exon鄄mutated fragrant rice. At the same time, the mutation sites of badh2
in the main fragrant rice varieties which are grown in Shanghai and the surrounding areas have been verified. This
research laid an important foundation for molecular marker鄄assisted selection for novel fragrant rice.
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2011, 33 (6): 667 ~ 673
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2011. 11019
*
**
***
基金项目: 上海市科学技术委员会课题 (10391900603)
与第一作者同等贡献
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: lijianyue01@ yahoo. com. cn
收稿日期: 2011-01-21, 2011-05-11 接受发表
作者简介: 徐小龙 (1985-) 男, 在读硕士研究生, 主要从事植物分子遗传学研究。
Key words: Fragrant rice; BADH2 gene (badh2); Functional molecular marker; Mutation site analyses
摇 香稻因其优良的香味品质而为人们所喜爱,
在国际稻米市场中占有重要地位, 其中印度和巴
基斯坦的 Basmati香米和泰国的茉莉香米更是受
到消费者的青睐 (Singh 等, 2000)。 香稻不仅在
亚洲得到赞誉, 而且在欧洲、 澳大利亚、 美国和
中东地区都得到广泛的认可 (Sakthivel等, 2009)。
随着香米市场需求的增加, 水稻香味性状和香稻
育种的研究也日益受到重视。
过去香稻育种一直采用传统选育方法, 例如
咀嚼米粒法 (Berner和 Hoff, 1986) 和 KOH浸泡
法 (Sood和 Sidiq, 1978) 等, 但这些方法往往准
确性不高。 最近几年, 随着分子生物学的发展及
香味形成机理的进一步研究, 使分子标记辅助育
种成为可能。 Ahn等 (1992) 通过一系列分子标
记定位表明, 香味基因是位于第 8 号染色体上的
隐性基因。 尽管对于香味基因的定位也有不同的
报道 (Lorieux 等, 1996), 然而近年来的研究进
一步支持了 Ahn 等的研究结果。 分子标记辅助
育种的方法因可减少传统育种过程中产生的误差
和降低对人体嗅觉系统的损害而得以迅速发展。
但由于早期人们使用的分子标记主要是与香味基
因呈连锁关系的标记, 因此在辅助选育香稻中还
缺乏足够的准确性。 最理想的方法还是根据目的
基因序列本身来发展分子标记 (Andersen等, 2003;
Wang等, 2004)。
Bradbury等 (2005a) 报道 8 号染色体上编
码甜菜碱醛脱氢酶 2 基因 badh2 与水稻香味直接
相关, badh2 第 7 外显子有 8 个碱基缺失和 3 个
核苷酸多态性, 导致该基因表达的酶失去原有功
能, 使水稻变香。 还有报道 ( Shi 等, 2008) 显
示, 某些香型水稻的 badh2 与非香水稻比较, 第
7 外显子核苷酸序列与非香水稻相同, 但在第 2
外显子处缺失 7 个碱基。 如要根据目的基因序列
本身来发展分子标记, 对于有可能作为育种亲本
的香稻品种进行 badh2 突变位点的分析是非常重
要的。 本研究根据目前已报道的两种香型水稻以
及非香型水稻的 badh2 DNA 序列之间的差异,
设计出两类基于 PCR 检测香型水稻功能标记的
引物, 并对主要从上海市农科院等单位收集得到
的 24 种香稻材料进行 badh2 突变位点的鉴定。
1摇 材料与方法
1. 1摇 水稻材料
本实验有 3 种类型的水稻材料。 24 份香稻品种分别
为: W香 99075、 泰国香稻、 云粳 15、 银香 18、 苏沪香
粳、 滆湖香糯、 云粳优 15、 武运 2645、 07-08 香稻、 通
运粳、 07-06-2 香稻、 C 香 517、 中香一号、 香稻一号、
Della光身稻、 大华香粳、 香稻 05-7、 武香 14、 紫香糯
861、 99983 香稻、 大粒香、 南海 318、 49于香稻、 2008-
321H (B1) 香稻; 1 份非香米品种: 261S; W 香 99075
和武香 14 分别与非香水稻杂交的 F1水稻。 以上香型及
非香型水稻品种分别由上海市农业科学研究院作物所陆
家安高级农艺师、 中科院上海植物生理生态研究所林鸿
宣研究员、 上海师范大学董彦君教授、 上海市闵行区农
科所陆文龙高级农艺师和上海跃进农场许建华农艺师提
供。 两种杂交 F1水稻由本实验室培育。
1. 2摇 水稻香味鉴定
采用氢氧化钾 (KOH) 浸泡法鉴定叶片香味。 取每
种植株叶片鲜重 1克左右, 剪成碎片放入试管, 加入 1. 7%
KOH溶液 5 mL, 立即塞住试管口, 在室温下保持 10
min, 然后逐一打开试管塞迅速用鼻嗅来鉴别香味有无。
为确保鉴定的准确性, 由三人同时闻味。
采用咀嚼法鉴定米粒香味。 即每株随机选取一穗中
的 16粒晒干后的种子进行检测。 如果 16粒种子全不香则
认为该植株所有种子都没有香味; 如果首先连续 5粒种子
都有香味则认为该植株所有种子都有香味; 如果 16 粒种
子中香与不香的米粒同时存在则认为存在香味性状分离。
1. 3摇 功能性分子标记引物设计及 PCR检测
根据赵国超等 (2009) 报道的属于第 7 外显子突变
类型的香型水稻W香 99075 和非香型水稻 261S badh2 核
苷酸的差异序列, 针对 badh2 第 7 外显子突变核苷酸设
计一组能够检测水稻是否具有香味和非香味基因的功能
性分子标记引物 M7: 7FS / 7FN / 7nFS / 7nFN。 比较属于第
二外显子突变的香型水稻与非香水稻的 badh2 序列, 设
计能够针对检测 badh2 第二外显子是否有缺失突变的功
能性分子标记引物 M2: 2FS和 2FN。
提取水稻叶片总 DNA, 分别以香型水稻 W香 99075、
非香型水稻 261S 以及 W香 99075 与非香水稻杂交的 F1
植株基因组 DNA为模板, 把设计的功能性分子标记 M7:
7FS / 7FN / 7nFS / 7nFN 的 4 个引物同时放在一个 PCR 管
中, 进行扩增反应。 PCR 反应总体系为 50 滋L, 其中添
加 2. 5 滋L DMSO。 PCR 反应程序: 94益预变性 5 min;
94益变性 30 s、 55益退火 30 s、 72益延伸 1 min, 共 38 个
循环; 最后 72益延伸 10 min。 扩增后, 取 PCR 产物在
1%的琼脂糖凝胶上进行电泳。
866摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
分别以香型水稻武香 14、 非香型水稻 261S 以及武
香 14 与非香水稻杂交的 F1水稻基因组 DNA 为模板, 以
M2 引物进行扩增。 PCR 反应程序: 94益预变性 5 min;
94益变性 30 s、 52益退火 30 s、 72益延伸 1 min, 共 34 个
循环; 最后 72益延伸 10 min。 在 DNA扩增时, 也需要在
反应体系中添加 5%的 DMSO。 扩增后, 取 PCR 产物在
3. 5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
1. 4摇 24 种香稻 badh2 突变类型的鉴定
提取水稻叶片总 DNA, 利用 M7 和 M2 引物以及相
应的反应程序, 对本实验室收集的 24 种香稻的 badh2 突
变类型进行鉴定。 扩增产物也同样分别在 1%和 3. 5%的
琼脂糖凝胶上进行电泳分析。
2摇 结果与分析
2. 1摇 水稻香味鉴定结果
通过 KOH 浸泡法和咀嚼米粒法鉴定发现,
24 份香稻品种的幼叶和全部米粒均有香味, 其
中南海 318 香味较淡; 261S 品种幼叶和全部米
粒均没有香味; W 香 99075 和武香 14 分别与非
香水稻杂交的 F1水稻幼叶没有香味, 但部分米
粒有香味, 说明香味基因是隐性的。
2. 2摇 M7 功能性分子标记引物的设计及鉴定
用于检测 badh2 第 7 外显子突变的功能性分
子标记引物 M7 共有 4 个序列, 序列分别为: ag鄄
gaatatatatatatatatatatatataatg (7FS)、 accataggagcagc鄄
tgaaatatatac (7FN)、 gcgcaacaacaagtgtatattgttt (7nFS)
和 gcagctgaagccataatctttttac (7nFN)。 这些序列在
非香水稻和香型水稻 badh2 上的结合位置见图
1。 7FS和 7FN互为上下游引物, 能分别与香味
等位基因 badh2 第 4 内含子和第 7 外显子处核苷
酸特异性配对; 7nFS 和 7nFN 互为上下游引物,
能分别与非香味等位基因 badh2 第 2 内含子和第
7 外显子处核苷酸特异性配对。 根据 M7 中的 4
个引物在 badh2 上结合的位置, 推测使用这 4 个
引物对香型水稻 W 香 99075 和非香型水稻基因
组 DNA扩增的产物分子量分别为 780 bp和 2 100
bp, 对 W 香 99075 与非香型水稻杂交的 F1植株
基因组 DNA扩增产物有两条, 同时具有 780 bp
和 2 100 bp两条条带。
使用 M7 引物分别对 W香 99075、 非香水稻
以及 W香 99075 与非香型水稻杂交 F1植株基因
组 DNA进行扩增, 扩增产物经电泳检测显示与
引物设计时的预计结果一致 (图 2)。 而且, 780
bp和 2 100 bp 两条 DNA 条带分子量差异较大,
很容易从 1%的琼脂糖凝胶中区分开。 电泳检测
图 1摇 M7 引物序列在 badh2 上的位置
“-冶 为缺失碱基; 灰色阴影碱基显示为 M7 引物序列的位置; 右向箭头表示该引物为上游引物, 左向箭头表示
该引物为下游引物; 数字表示该碱基的核苷酸在 badh2 中的位置 (起始密码子第一个核苷酸为+1 bp)
Fig. 1摇 The location of M7 primer sequences in the badh2
“-冶 indicates the deleted bases; The bases with gray shadows indicate the locations of the M7 primer sequences in the badh2.
The forward and reverse primers are indicated with right and left arrows respectively. Numbers show the location
of corresponding nucleotides in the badh2 (The first nucleotide of starting codes is +1 bp)
9666 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 徐小龙等: 24 种香稻品种甜菜碱醛脱氢酶 2 基因突变位点的分析及分子标记开发摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
结果说明, 使用 M7 引物能够有效地鉴定水稻植
株的 badh2 是呈香型或非香型纯合状态以及杂合
状态; M7 引物能够作为以第 7 外显子突变的香
稻为亲本进行分子标记辅助选育新型香稻中的
PCR鉴定。
图 2摇 W香 99075 和非香稻及 F1 植株香味基因 badh2 的鉴定
M: DL2000 DNA Marker; A: W香 99075; B: 非香水稻;
C: W香 99075 与非香水稻杂交 F1 植株
Fig. 2摇 Identification of the badh2 in fragant rice Wxiang 99075,
non鄄fragant rice and F1 cross line
M: DL2000 DNA Marker. A: Wxiang 99075. B: non鄄fragant rice.
C: F1 cross line of Wxiang 99075 and non鄄fragance rice
2. 3摇 M2 功能性分子标记引物的设计及鉴定
用于检测 badh2 第 2 外显子突变功能性分子
标记 M2 有 2 个引物, 序列分别为: gcgat tgcgc
ggagg tactt (2FN) 和 caccctctccaccctctgcttc (2FS)。
该对引物在 badh2 上的结合位置见图 3。 预计使
用这对引物对已报道 ( Shi 等, 2008) 属于第 2
外显子突变的武香 14 水稻和非香水稻基因组
DNA的扩增产物分子量分别为 203 bp 和 210 bp,
对武香 14 与非香水稻杂交的 F1植株基因组 DNA
扩增产物也应该有两条条带。
利用 M2 引物对 badh2 基因第 2 外显子突变
类型的武香 14、 非香水稻以及武香 14 与非香水
稻杂交 F1植株的基因组 DNA 扩增, PCR 产物经
3. 5%琼脂糖凝胶电泳检测, 结果也与引物设计
时的预计一致 (图 4)。 尽管针对香型和非香型
水稻的两条扩增条带之间分子量差异较小, 但采
用 3. 5%琼脂糖凝胶电泳检测, 将电泳时间设定
在 80 mim, 还是能够将 badh2 基因呈香型或非香
型纯合及杂合状态区分开。 由此表明, 采用本实
验设计的 M2 引物还是能够被用于以 badh2 基因
第 2 外显子突变类型香稻为亲本, 进行香稻新品
种培育中香味基因分子标记的检测。
图 3摇 M2 引物序列在 badh2 基因上的位置
“-冶 为缺失碱基; 灰色阴影碱基显示为 M2 引物序列的位置; 右向箭头表示该引物为上游引物, 左向箭头表示
该引物为下游引物; 数字表示该碱基的核苷酸在 badh2 中的位置 (起始密码子第一个核苷酸为: +1 bp)
Fig. 3摇 The location of M2 primer sequences in the badh2
“-冶 indicates the deleted bases. The bases with the gray shadows indicate the locations of the M2 primer sequences in the badh2;
The forward and reverse primers are indicated with right and left arrows respectively. Numbers show the location
of corresponding nucleotides in the badh2 (The first nucleotide of starting codes is +1 bp)
076摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
图 4摇 武香 14 和非香稻及 F1 植株香味基因 badh2 的鉴定
A: 武香 14; B: 非香稻; C: 武香 14 与非香水稻杂交 F1 植株
Fig. 4摇 Identification of the badh2 in fragant rice Wuxiang 14,
non鄄fragance rice and the F1 cross line
A. Wuxiang 14. B. non鄄fragance rice. C. F1 cross line
of Wuxiang 14 and non鄄fragant rice
2. 4摇 利用M7 和 M2 引物鉴定 24 种香稻 badh2
突变类型
以非香水稻 261S 为对照, 利用 M7 检测 24
份香稻香味基因 badh2 突变类型。 检测结果发
现, 泰国香稻、 云粳 15、 云粳优 15、 07 -08 香
稻、 C香 517、 中香一号、 香稻一号、 Della 光身
稻、 紫香糯 861、 大粒香 10 种香稻能够扩增出
与 W香 99075 相同的 780 bp 左右的 DNA 条带
(图 5), 而另外 13 种香稻只能够扩增出与非香
水稻 261S 相同分子量 2 100 bp 左右的 DNA 条
带。 这说明泰国香稻、 云粳 15、 云粳优 15、 07-
08 香稻、 C香 517、 中香一号、 香稻一号、 Della
光身稻、 紫香糯 861、 大粒香这 10 种香稻的香
味基因 badh2 与 W香 99075 一样, 也是属于第 7
外显子突变类型香稻, 同时可以推测另外 13 种
香稻的 badh2 第 7 外显子无突变现象。
同样以非香水稻 261S 为对照, 利用 M2 对
24 份供试香稻材料进行 badh2 突变类型检测。
结果发现, 原先在使用 M7 引物扩增时只能产生
与非香稻相同大约 2 100 bp 的 13 种香稻中, 有
11 种材料: 银香 18、 苏沪香粳、 滆湖香糯、 武
运 2645、 通运粳、 07 -06 -2 香稻、 大华香粳、
香稻 05-7、 99983 香稻、 49于香稻、 2008-321H
(B1) 香稻能够扩增出与武香 14 相同分子量 203
bp的 DNA条带 (图 6), 而已确定属于 badh2 基
因第 7 外显子突变的 11 种香稻扩增的 DNA条带
分子量与非香水稻 261S 相同, 也是 210 bp 的条
带。 这说明, 苏沪香粳、 滆湖香糯、 武运 2645、
通运粳、 07-06-2 香稻、 大华香粳、 香稻 05-7、
银香 18、 99983 香稻、 49于香稻、 2008 - 321H
(B1) 与武香 14 一样也属于 badh2 第 2 外显子
突变类型的香稻。 由 M2 检测结果还可以确定,
11 个香味基因 badh2 第 7 外显子突变的香稻在
第 2 外显子处也没有核苷酸缺失现象。
图 5摇 利用 M7 鉴定 24 种香稻 badh2 突变位点
M: DL2000 Marker;上图: A至 K分别为 261S、 W香 99075、 泰国香稻、 云粳 15、 银香 18、 苏沪香粳、 滆湖香糯、 云粳优
15、 武运 2645、 07-08 香稻、 通运粳、 07-06-2 香稻; 下图: A至 M分别为 C 香 517、 中香一号、 香稻一号、 Della光身
稻、 大华香粳、 香稻 05-7、 武香 14、 紫香糯 861、 99983 香稻、 大粒香、 南海 318、 49于香稻、 2008-321H (B1) 香稻
Fig. 5摇 Identification of mutation sites of badh2 in 24 types of fragrant rice by M7
M: DL2000Marker; Lanes from A to K (up) were, respectely, 261S、 Wxiang99075、 Thailand fragrant rice、 Yunjing 15、 Yinx鄄
iang 18、 Shuhuxianjing、 Gehuxiangnuo、 Yunjingyou15、 Wuyun2645、 Xiangdao07-08、 Tongyunjing、 Xiangdao07-06-2. Lanes
from A to M (down) were, respectely, C xiang517、 Zhongxiang1、 Xiangdao1、 Della guangshendao、 Dahuaxiangjing、 Xiangd鄄
ao05-7、 Wuxiang14、 Zixiangnuo861、 Xiangdao99983、 Dalixiang、 Nanhai318、 Xiangdao49于、 Xiangdao2008-321H (B1)
1766 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 徐小龙等: 24 种香稻品种甜菜碱醛脱氢酶 2 基因突变位点的分析及分子标记开发摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 6摇 利用 M2 鉴定 24 种香稻 badh2 突变位点
上图: 至 L分别为261S、 W香99075、 泰国香稻、 云粳15、 银香18、 苏沪香粳、 滆湖香糯、 云粳优15、 武运2645、
07-08 香稻、 通运粳、 07-06-2 香稻; 下图: 至分别为 C 香 517、 中香一号、 香稻一号、 Della光身稻、 大华香粳、
香稻 05-7、 武香 14、 紫香糯 861、 99983 香稻、 大粒香、 南海 318、 49于香稻、 2008-321H (B1) 香稻
Fig. 6摇 Identification of mutation sites of the badh2 in 24 types of fragrant rice by M2
Lanes from A to L (up) were, respectely, 261S、 Wxiang99075、 Thailand fragrant rice、 Yunjing15、 Yinxiang18、 Shuhux鄄
ianjing、 Gehuxiangnuo、 Yunjingyou15、 Wuyun2645、 Xiangdao07-08、 Tongyunjing、 Xiangdao07-06-2. Lanes from A to
M (down) were, respectely, C xiang517、 Zhongxiang1、 Xiangdao1、 Della guangshendao、 Dahuaxiangjing、 Xiangdao05
-7、 Wuxiang14、 Zixiangnuo861、 Xiangdao99983、 Dalixiang、 Nanhai318、 Xiangdao49于、 Xiangdao2008-321H (B1)
摇 在使用 M7 和 M2 引物检测 24 种香稻 badh2
的结果中, 南海 318 香稻表现较为特殊, 它既不
能扩增出对应第 7 外显子突变类型约 780 bp 条
带, 也不能扩增出对应第 2 外显子突变类型的
203 bp条带, 而与非香稻 261S 表现相同 (图 5,
6)。 此结果说明, 南海 318 水稻的香味基因
badh2 既不属于第 7 外显子突变类型, 也不属于
第 2 外显子突变类型, 是一种特殊突变类型的香
稻。 参考赵国超等 (2009) 的方法, 将南海 318
水稻 badh2 克隆后, 送上海鼎安生物公司进行测
序。 测序结果显示, 南海 318 水稻 badh2 编码链
与非香水稻 261S 完全相同, 而第 2 和第 4 内含
子核苷酸序列突变情况则与香型水稻W香 99075
基本相同, 故可将其归类为外显子序列未发生突
变类型的香稻。
3摇 讨论
通过目的基因本身的序列开发分子标记, 能
够加快培育高产优质香型水稻新品种的进程。
Bradbury等 (2005b) 确定在第 8 号染色体上
badh2 与水稻香味直接相关的研究报道, 为从目
的基因本身序列开发分子标记奠定了重要基础。
Bradbury等 (2005b) 根据香型水稻 badh2 与非
香型水稻 badh2 第 7 外显子序列差异, 首次建立
了 “等位基因特异扩增法冶。 之后, 王丰等
(2008) 也采用类似本研究鉴定 badh2 第 2 外显
子突变类型的方式, 在 badh2 第 7 外显子出现 8
个核苷酸缺失的两端设计一对引物, 用于香味基
因型鉴定。 同年, 王军等 (2008) 采用相同的
设计思路, 也在 badh2 第 2 和第 7 外显子出现 7
个和 8 个缺失核苷酸的两端, 设计了两对分别能
够鉴定香味基因型的引物。 由于王丰等和王军等
都是根据 badh2 编码链上缺失几个核苷酸序列设
计引物, 对于 PCR 扩增对应产生的 badh2 产物
长度之间只有几个核苷酸序列差异, 因此在进行
电泳检测时, 需要与本试验采用 M2 引物鉴定时
使用高浓度琼脂糖凝胶或操作更为复杂和麻烦的
聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。 而且, 前人在设
计引物时都只注重了对 badh2 外显子之间的差异
性进行筛选, 即只根据编码链之间的差异性区分
香型和非香型水稻。 对于真核生物基因, 除了作
为编码链的外显子之外, 还有内含子序列等非编
码序列。 人们对内含子的功能提出过许多见解,
其中最重要的一个方面是内含子在基因表达调控
中起着重要的作用 (Fu 等, 1995; Lee 等, 2000;
程世军等, 2001; 徐军望等, 2003; 陈俊和王宗阳,
276摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
2004)。 本实验设计的 M7 引物首次综合考虑了
badh2 的外显子和内含子两方面的突变情况。
在利用分子标记进行香型水稻新品种培育
时, 首先要明确作为香源亲本水稻的 badh2 属于
什么样的突变类型。 王丰等 (2008) 曾对广东
省农业科学院水稻研究所提供的 16 个香型水稻
badh2 进行鉴定, 本实验使用的 24 种香稻品种
都不同于王丰等的报道, 而且大多都是目前适应
上海等周边地区水稻生产中应用的香稻品种。 由
于不同水稻品种种植受到地域限制, 为了更快地
培育适合本地区种植的香稻新品种, 应该选用原
先就适宜在本地区种植的香稻品种作为亲本。 因
此, 开展本研究为上海等周边地区进行香稻新品
种育种研究奠定了重要的基础。
在本实验中, 我们发现了一种甜菜碱醛脱氢
酶 2 基因编码链无变异, 而在内含子则存在核苷
酸序列变化的香型水稻———南海 318。 Bradbury
等 (2005a) 认为, 甜菜碱醛脱氢酶 2 基因编码链
突变导致了甜菜碱醛脱氢酶 2 功能丧失使水稻变
香。 对于甜菜碱醛脱氢酶 2 基因编码链无变异的
南海 318水稻, 又是什么原因使其稻米也表现出
香味, 是一个值得进一步研究的问题。
也参摇 考摇 文摇 献页
徐军望,冯德江,宋贵生等, 2003. 水稻 EPSP合酶第一内含子增
强外源基因的表达 [J] . 中国科学 C辑, 33 (3): 224—230
Ahn SN, Bollich CN, Tanksley SD, 1992. RFLP tagging of a gene for
aroma in rice [J] . Theoretical and Applied Genetics, 84: 825—
828
Andersen JR, Thomas Lubberstedt, 2003. Functional markers in
plants [J] . Trends in Plant Science, 8 (11): 554—560
Berner DK, Hoff BJ, 1986. Inheritance of scent in American long gri鄄
an rice [J] . Crop Science, 26: 876—878
Bradbury LMT, Fitzgerald TL, Henry RJ et al., 2005a. The gene for
fragrance in rice [ J] . Plant Biotechnology Journal, 3 (3 ):
363—370
Bradbury LMT, Henry RJ, Jin Q et al., 2005b. A perfect marker for
fragrance genotying in rice [ J] . Molecular Breeding, 16 (4):
279—283
Chen J (陈俊), Wang ZY (王宗阳), 2004. Expression of OsBP鄄73
gene requires involvement of its intron in rice [J] . Acta Photo鄄
physiologica Sinica (植物生理与分子生物学学报), 30 (1):
81—86
Cheng SJ (程世军), Ge HF (葛鸿飞), Wang ZY (王宗阳) et al.,
2001. Analysis of influence of Wx intron 1 on gene expression in
transgenic rice plant [J] . Acta Photophysiologica Sinica (植物
生理学报), 27 (5): 381—386
Fu HY, Soo Young Kim, William D. Park, 1995. High鄄level tubule
expressionand sucrose inducibility of a potatoSus4 sucrose syn鄄
thasegene require 5忆 and 3忆 flanking sequences and the leader in鄄
tron [J] . The Plant Cell, 7: 1387—1394
Lorieux M, Petrov M, Huang N et al., 1996. Aroma in rice: genetic
analysis of a quantitative trait [J] . Theoretical and Applied Genet鄄
ics, 93: 1145—1151
Lee S, Jung KH, Jun SH et al., 2000. Tissue鄄preferential expression
of a rice 琢鄄tubulin gene, OsTubA1, mediated by the first intron
[J] . Plant Physiology, 12 (3): 1005—1014
Sood BC, Sidiq EA, 1978. A rapid technique for scent determination
in rice [J] . Indian Journal of Genetics and Plant Breeding, 38:
268—271
Singh RK, Singh US, Khush GS, 2000. Genetics and biotechnology of
quality traits in aromatic rices [J]. Aromatic Rices, 5: 47—70
Shi WW, Yang Y, Chen SH et al., 2008. Discovery of a new fra鄄
grance allele and the development of functional markers for the
breeding of fragrant rice varieties [ J] . Molecular Breeding, 22
(2): 185—192
Sakthivel K, Sundaram RM, Neeraja CN et al., 2009. Genetic and
molecular basis of fragrance in rice [J] . Biotechnology Advances,
4: 1—6
Wang ZH (王忠华), Jia YL (贾育林), Wu DX (吴殿星) et al.,
2004. Molecular markers assisted selection of the rice blast resist鄄
ance gene Pi ta [ J] . Acta Agronomica Sinica (作物学报), 30
(12): 1259—1265
Wang F (王丰), Li JH (李金华), Liu WG (柳武革) et al.,
2008. Development of a functional marker for fragrance gene in
rice [J] . Chinese Journal of Rice Science (中国水稻科学), 22
(4): 347—352
Wang J (王军), Yang J (杨杰), Chen ZD (陈志德) et al., 2008.
Development and application of fragrance gene markers in rice
[J] . Molecular Plant Breeding (分子植物育种), 6 ( 6 ):
1209—1212
Zhao GC (赵国超), Cao XY (曹晓燕), Li JY (李建粤), 2009.
Gene cloning and sequence analysis of betaine aldehyde dehydro鄄
genase in rice varieties of W xiang99075 and 261S [J] . Journal
of Shanghai Normal University (Nature Sciences) (上海师范大
学学报, 自然科学版), 38: 120—124
3766 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 徐小龙等: 24 种香稻品种甜菜碱醛脱氢酶 2 基因突变位点的分析及分子标记开发摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇