全 文 ：增强 UV鄄B辐射对小麦根尖分裂期细胞肌动蛋白的影响*
陈慧泽, 翟菁如, 杜美婷, 韩摇 榕**
(山西师范大学生命科学学院, 山西 临汾摇 041004)
摘要: 以增强 UV鄄B (10. 08 kJ·m-2·d-1) 辐射后的小麦根尖细胞为材料, 异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽
(FITC鄄Ph) 为探针, 利用激光共聚焦扫描显微镜, 观察分析小麦根尖分裂期细胞肌动蛋白在分裂周期的
分布及形态变化。 结果表明: UV鄄B辐射处理后, 间期细胞肌动蛋白纤丝排列紊乱; 前期细胞周质中肌动
蛋白纤丝变为短的片段, 点状荧光随机分布在周质; 中期细胞荧光强度明显减弱, 明亮的肌动蛋白片段消
失, 点状荧光消失; 有丝分裂后期到末期, 成膜体区域肌动蛋白纤丝或成弥散状或完全消失, 且出现落后
染色体、 染色体桥、 不均等分裂及三束分裂等染色体畸变类型和异常分裂现象。
关键词: 增强 UV鄄B; 小麦; 分束分裂细胞; 肌动蛋白; 激光共聚焦扫描显微镜
中图分类号: Q 942摇 摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2011)03-306-05
Influence of Enhanced UV鄄B Radiation on
F鄄actin in Wheat Division Cells
CHEN Hui鄄Ze, ZHAI Jing鄄Ru, DU Mei鄄Ting, HAN Rong**
(College of Life Science, Shanxi Normal University, Linfen 041004, China)
Abstract: The distribution of F鄄actin was examined by confocal laser scanning microscopy (CLSM) in the wheat
root鄄tip cells under the enhanced ultraviolet鄄B (10. 08 kJ·m-2·d-1) radiation treated with FITC鄄Phalloidin. The re鄄
sults showed that under the condition of the enhanced ultraviolet鄄B radiation, distribution of actin MFs were disorder鄄
ed in interphase cells; The arrays of the F鄄actin disintegrated into short fragments of random during prophase; Fluores鄄
cence intensity significantly decreased and bright fragments of microfilaments disappeared in Metaphase cells; Actin
MFs disappeared in the phragmoplast regions when cells were in anaphase and telophase time. And some types of chro鄄
mosome aberration were induced, including Chromosomal logging, chromosomal bridge and partition鄄bundle division.
Key words: Enhanced UV鄄B radiation; Wheat; Partition bundle division cells; Actin; Confocal laser scanning mi鄄
croscope (CLSM)
摇 大气臭氧层变薄导致到达地面的 UV鄄B 辐射
增强, 增强的 UV鄄B 辐射将会对植物的生长发
育、 生理生化过程以至整个地球生态系统产生极
大的影响。 大量研究表明, 增强 UV鄄B 辐射对植
物的生长发育有明显的抑制作用; 在细胞水平
上, UV鄄B辐射可导致细胞膜结构的损伤, 引起
细胞膜功能的一系列改变; 在分子水平上, UV鄄
B辐射可导致碱基和多核苷酸链损伤, 产生嘧啶
二聚体 (Li等, 2004)。
韩榕等 (2002) 在细胞水平的研究中发现,
增强 UV鄄B能降低小麦细胞的有丝分裂率, 产生染
色体等畸变类型; 并在小麦根尖细胞中首次观察
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2011, 33 (3): 306 ~ 310
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2011. 10180
*
**
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30671061) 增强 UV鄄B辐射与 He鄄Ne激光对小麦细胞分束分裂影响机制的研究; 山西
省自然科学基金资助项目 (200811059) 作物相关基因的定位、 克隆及转化
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: hhwrsl@ yahoo. com. cn
收稿日期: 2010-10-21, 2011-03-09 接受发表
作者简介: 陈慧泽 (1986-) 男, 汉族, 在读硕士, 主要从事植物细胞学研究。 E鄄mail: michael3m@ 163. com
到在有丝分裂的后期到末期染色体分成 3 束、 4
束或 6束的现象, 并提出了 “两极多束分裂冶 。
作为细胞骨架的重要成分之一, 肌动蛋白聚
合成的微丝在植物细胞的生命活动中执行着多种
功能, 如维持细胞的正常形状、 细胞质流动、 参
与有丝分裂、 极性生长及细胞器的定位运动等
(徐世雄, 1996)。 本研究以小麦根尖细胞为材料,
异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽 (FITC鄄Ph) 为
探针, 通过观察增强 UV鄄B 辐射后肌动蛋白骨架
在有丝分裂周期中的形态及分布变化, 试图就分
束分裂现象与肌动蛋白之间的关系进行探讨。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
选用晋小麦 8 号为材料 (Triticum aestivum), 由山
西省农科院小麦研究所提供。
1. 2摇 方法
1. 2. 1 摇 种子的萌发 摇 选取籽粒饱满, 大小均一的小麦
种子, 5%次氯酸钠消毒 30 min, 清水漂洗, 培养于盛有
湿滤纸的培养皿内, 25益培养, 每皿 50 粒。
1. 2. 2摇 处理设置 摇 实验共设对照 (CK) 和 UV鄄B (B)
两组处理。 处理程序见表 1。
1. 2. 3摇 UV鄄B辐射处理摇 UV鄄B发生用 UV鄄B灯 (南京华
强, 30 W, 297 nm), 将其垂直悬于培养皿的上方, 通
过调整 UV鄄B灯与植物培养皿之间的距离来控制并同时
测量 UV鄄B辐射的强度。 剂量采用 10. 08 kJ·m-2·d-1, 相
当于臭氧下降 20%、 UV鄄B增强 40%的强度 (RAF=2. 0).
表 1摇 各处理组的设置及处理程序
Table 1摇 Establishment and treatment procedure of different groups
处理组
Treatment
光照
Light
(h / d)
增强 UV鄄B辐射
Enhanced UV鄄B
radiation (h / d)
暗培养
Dark culture
(h / d)
CK 8 - 16
B 8 8 16
1. 3摇 小麦根尖有丝分裂细胞制备
参照 (McCurdy 等, 1988; 1990) 的方法并略加改
进: 取 2 ~3日龄小麦根尖, 经 4%多聚甲醛 (50 mmol·L-1
pH 6. 8 PIPES缓冲液配置) 常温固定 1 h, 然后用 PIPES
缓冲液清洗 3 次。 经 1%的纤维素酶 (PEM缓冲液配置,
50 mmol·L-1 PIPES, 2 mmol·L-1 MgSO4和 5 mmol·L-1
EGTA, pH 6. 8) 酶解 1 h; PEM 缓冲液清洗 3 次, 经
0. 2% Triton X鄄100 处理 40 min; 清洗 3 次, 以 FITC标记
的鬼笔环肽在 37益孵育 1 h, 用指甲油封片观察。 每次
重复观察 10 个根尖, 每根尖至少观察 1 000 个细胞, 统
计其畸变类型、 畸变率。 用 t 检验检验处理组与对照组
之间的差异显著性。
1. 4摇 图象的观察及处理
采用激光共聚焦扫描显微镜 ( CLSM, NIKON TE鄄
2000 confocal laser scanning microscope) 观察, 激发光波
长 488 nm, 物镜镜头使用 60 倍油镜, 图象采集选用 512
伊512 像素。
2摇 结果与分析
2. 1摇 小麦根尖细胞内肌动蛋白纤丝在细胞分裂
周期中的时相变化
小麦根尖细胞内肌动蛋白纤丝在有丝分裂过
程中呈现周期性的变化。 在间期, 小麦根尖分生
组织细胞中肌动蛋白纤丝存在两种典型的分布格
局。 一种是存在于周质下的细胞质中与细胞长轴
平行的肌动蛋白纤丝, 这些纤丝几乎通过整个细
胞的长度, 还分出许多细的分支, 由核四周随机
地进入周质 (图 1: 1)。
从间期进入前期, 肌动蛋白纤丝的分布发生
较大的变化。 与微管在前期 PPB 的变化相对应,
小麦在这个时期的周质微丝分布呈现随机且不规
律地排布。 周质中肌动蛋白纤丝在微管处于最早
形成宽的 PPB 时, 周质中部的微丝逐渐向横向
排列的格局发展 (图 1: 3)。
细胞进入中期, 染色体整齐地排列在赤道板
上, 原先围绕核区的肌动蛋白纤丝逐渐消失, 细
胞质中只存在短的明亮的肌动蛋白纤丝及点状的
荧光 (图 1: 5)。
进入有丝分裂后期, 染色体分裂成两组子染
色体, 在纺锤体微管的牵拉下分别向两极运动。
此时在成膜体区域可观察到平行排列的微丝骨架
连接着子染色体, 且与赤道板相垂直。 亦存在明
亮的扩散的荧光与成膜体结合 (图 1: 7、 9)。
有丝分裂末期, 形成的两个子细胞质中, 可
观察到两个子核周围扩散的荧光区域亮度加强,
出现随机分布的微丝片段及点状荧光, 又重新出
现有丝分裂间期肌动蛋白纤丝的荧光时相 (图
1: 11)。
2. 2摇 增强 UV鄄B 处理对小麦根尖细胞肌动蛋白
纤丝的影响
摇 摇 增强 UV鄄B辐射处理后, 小麦根尖细胞肌动蛋
白纤丝的排列发生了一定的变化。 与对照组相比,
7033 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 陈慧泽等: 增强 UV鄄B辐射对小麦根尖分裂期细胞肌动蛋白的影响摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 1摇 对照组 (CK) 及增强 UV鄄B辐射处理组 (B) 小麦根尖细胞肌动蛋白有丝分裂时相
1. CK组间期细胞, 微丝沿细胞长轴分布; 2. B组间期细胞, 周质中微丝分布紊乱; 3. CK组前期细胞微丝横向分布在周质中; 4. B组
前期细胞, 横向分布的微丝减少; 5. CK组中期细胞, 微丝片段和点状荧光分布于细胞质中; 6. B组中期细胞, 胞质中微丝片段分布减
少; 7, 9. CK组后期细胞成膜体区域可见微丝分布; 8. B组出现的染色体畸变, “三束分裂冶; 10. B 组出现的染色体畸变, 染色体桥;
11. CK组末期, 形成两个子细胞, 核周围可见点状荧光; 12. B组末期, 形成两个子细胞, 细胞内肌动蛋白纤丝不明显, 呈点状分布
Fig. 1摇 F鄄actin during the mitotic phase of the wheat division cells in the control group (CK) and the enhanced UV鄄B radiation group (B)
1. Interphase cells of the control group, the MFs ranked along the macro鄄axis of cells; 2. Interphase cells of the enhanced UV鄄B radiation group,
the MFs in periplasmic ranked abnormality; 3. Earlypjase cells of the control group, the MFs in periplasmic lateral distribution; 4. Earlypjase
cells of the enhanced UV鄄B radiation group, the MFs in periplasmic lateral distribution has reduced; 5. Metaphase cells of the control group, frag鄄
ment of the MFs and the little bits of fluorescent ranked in periplasmic; 6. Metaphase cells of the enhanced UV鄄B radiation group, fragment of the
MFs ranked in periplasmic has reduced; 7, 9. Late anaphase cells of the control group, the region of phragmoplast ranked MFs; 8. Chromosome
aberrations in the enhanced UV鄄B radiation group, three鄄bundle division; 10. Chromosome aberrations in the enhanced UV鄄B radiation group,
chromosome bridge; 11. Telophase of the control group, generated two daughter cells, little fluorescent around the blastomere nuclei; 12. Telo鄄
phase of the enhanced UV鄄B radiation group, generated two daughter cells, the MFs wasnt obviously, ranked as patchy
间期小麦根尖细胞中肌动蛋白纤丝的排列变得无
规律, 且较紊乱。 肌动蛋白纤丝聚集成团或点状
随机地分布于周质中。 (图 1: 2) 前期细胞中,
周质表面横向排列的肌动蛋白纤丝也变得紊乱,
周质中只能观察到极少数横向分布的微丝, 大部
分变为短的片段, 有的只能看到一些点状荧光随
机地分布在周质, 周质表面还能观察到一些无荧
光的暗斑。 (图 1: 4) 分裂中期, 与对照组相
比, 荧光强度明显减弱, 原先存在于细胞质中明
亮的的微丝片段消失, 点状荧光也消失, 而排列
在赤道板上的染色体仍可清晰可见。 (图 1: 6)
有丝分裂末期细胞中, 成膜体区域肌动蛋白纤丝
或成弥散状或完全消失, 但在周质中仍然可以观
察到短的肌动蛋白纤丝的痕迹 (图 1: 12)。
2. 3摇 增强 UV鄄B 处理对小麦 “分束分裂冶 细胞
肌动蛋白纤丝的影响
增强 UV鄄B辐射处理后, 可引起小麦根尖细
胞染色体发生畸变, 产生落后染色体、 染色体
桥、 不均等分裂等异常分裂现象。 在有丝分裂中
期, 可观察到由于染色体移动不同步而导致的染
803摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
色体落后现象。 胞质中仍可见到一些短的明亮的
微丝片段及点状荧光 (图 1: 10)。 在分裂后期,
出现了由于辐射而引起的另一种畸变类型, 即染
色体桥。 染色体桥是两条染色体断裂后产生染色
体断片, 游离末端有时会相互愈合产生双着丝粒
染色体, 由于受两个着丝点的牵引而引起的。
在有丝分裂的后期到末期, 观察到了三束分裂
的异常分裂现象。 一种出现在有丝分裂后期, 同一
轴上的染色体被分成三束, 另一轴上并没发生变
化, 且在束与束之间没有观察到荧光的出现, 但在
两群子染色体间隐约可见点状荧光 (图 1: 8)。
2. 4摇 异常微丝骨架的统计与分析
本研究共观察对照组细胞 60 789个, UV鄄B辐
射处理组细胞 60 822 个, 与对照组相比, UV鄄B辐
射处理后, 有丝分裂周期变化最为明显的是从后期
到末期, 成膜体微丝畸变数量较多, 为总畸变率的
35. 37%。 有丝分裂周期中间期周质微丝受 UV鄄B辐
射变化较小, 占总畸变率的 5%。 在有丝分裂的后
期到末期, 观察到了三束分裂的异常分裂现象, 是
染色体畸变类型中较多的, 占总畸变率的 9. 75%,
落后染色体其次。 并对 CK组与 B组畸变率进行 t
检验, 结果表明两者差异显著。 说明增强 UV鄄B处
理会造成明显的微丝骨架异常。
3摇 讨论
在间期的细胞质中, 与细胞长轴平行的肌动
蛋白纤丝和与细胞长轴垂直的周质微管一起通过
调节细胞壁物质的沉积来维持细胞的空间结构。
本研究发现, 增强 UV鄄B处理后, 间期细胞肌动
蛋白纤丝排列紊乱, 且细胞形态发生了改变, 成
不规则状。 推测很可能是肌动蛋白纤丝结构的改
变引起了细胞形态的改变。
早前期带的一个重要功能就是预定胞质分裂
发生的位置。 植物细胞的分裂面, 在分裂期前就
被决定, 这种决定作用由微丝与微管共同控制。
在细胞分裂的早期阶段, 周质微管有序地沿质膜
内侧环绕细胞核而成带状聚集束, 即早前期带
(preprophase band, PPB)。 微丝也出现在早前期
带上。 纺锤体形成时, 早前期带完全消失, 但仍
有大量的肌动蛋白结合在该位置。 Kennard 等
(1997) 研究发现, 在非对称分裂中, 细胞核的
位置决定了早前期带和细胞板的位置, 而细胞核
的位置是由肌动蛋白聚合成的微丝骨架的结构所
决定的, 微丝将细胞核和细胞的皮层连接起来。
Li等 (2006) 证实在 PPB 形成期间, 肌球蛋白
在 PPB 区域有富集现象, 当宽微管带变窄形成
PPB时, 微丝骨架可能在 PPB 区域作为轨道利
用肌球蛋白运输周质微管。 这些无一不暗示了微
丝骨架对于细胞板的位置所起的重要的作用。 增
强 UV鄄B辐射后, 小麦根尖细胞有丝分裂前期观
察不到横向分布的肌动蛋白纤丝, 相反, 肌动蛋
白纤丝变成短的片段, 无一定的排列规律。 可能
UV鄄B辐射促使微丝解聚成肌动蛋白纤丝片段,
排列紊乱, 很可能影响细胞板的位置变化, 进而
影响将来细胞分裂的方向, 产生异常分裂现象。
摇 摇 细胞发展到有丝分裂后期到末期, 在两群子
染色体之间的中区出现成膜体。 植物以 “成膜
体冶 为胞质分裂细胞器, 依靠成膜体指导细胞板
表 2摇 异常微丝骨架的统计
Table 2摇 The statistics of aberrant microfilament arrangements
微丝畸变类型 Aberration type of MFs
对照组 Control groups
畸变总数 (个)
Total of aberration
百分率 (% )
Percentage
UV鄄B组 Treated groups
畸变总数 (个)
Total of aberration
百分率 (% )
Percentage
间期周质微丝 Cortical actin MFs 22 8. 46 39 5
前期微丝 Prophase MFs 38 14. 61 85 11. 05
中期微丝 Metaphase MFs 49 18. 85 156 20. 30
成膜体微丝 Phragmoplast MFs 64 24. 61 272 35. 37
游离染色体 Fragments chr. 37 14. 23 44 5. 72
染色体桥 Chr. bridge 50 19. 23 71 9. 23
不均等分裂 Diaparate bundle 0 0 27 3. 51
三束分裂 Three鄄bundle 0 0 75 9. 75
总和 Summation 260 100 769 100
9033 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 陈慧泽等: 增强 UV鄄B辐射对小麦根尖分裂期细胞肌动蛋白的影响摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
的形成, 而后细胞板不断扩展, 形成完整的细胞
壁, 将母细胞一分为二 (叶纨芝等, 2005)。 小
麦根尖细胞中可以观察到丰富的肌动蛋白纤丝结
合在成膜体区域, 且呈平行排列连接着子染色体
向细胞两级运动, 表明肌动蛋白纤丝在染色体运
动中所起的作用。 而经 UV鄄B 辐射后, 成膜体区
域肌动蛋白纤丝消失不见。 肌动蛋白纤丝消失,
将无法形成沉积的细胞板, 无法在两个子细胞间
构建新的细胞壁, 进而产生双核或多核现象。
本研究运用 FITC 标记的鬼笔环肽技术, 在
小麦根尖分生组织细胞中检测到间期细胞核周围
绕着丰富的肌动蛋白纤丝。 近年来, 也有许多学
者证实, 在细胞核和染色体中存在肌动蛋白。 陶
伟等 (1998) 以大麦根尖分生细胞为实验材料,
采用免疫荧光标记技术证明了大麦细胞核骨架及
染色体骨架中存在肌动蛋白。 李桂英和邢苗
(1998) 利用抗肌动蛋白抗体和鬼笔环肽双标记的
方法证明 F鄄肌动蛋白是蒜根端分生组织细胞核和
染色体的组成成分。 万里红等 (1997) 以蚕豆根
尖分生组织细胞为材料, 以抗肌动蛋白抗体为探
针, 采用免疫荧光和免疫胶体金技术, 对完整的
细胞核和染色体以及去除 DNA和组蛋白的细胞核
和染色体进行研究, 结果发现, 肌动蛋白存在于
染色体和细胞核中, 且可能是细胞核骨架和染色
体骨架的组成成分。 有学者认为在核仁和染色体
中都有肌动蛋白分布 (曾宪录等, 1997)。 细胞核
内染色体的收缩包装、 RNA的转录与运输等生命
过程都需要收缩蛋白的参与, 而肌动蛋白作为真
核细胞中一类重要的收缩蛋白, 很可能与核的移
动有一定联系。 目前有研究发现, 肌动蛋白与其
结合蛋白相互结合, 可能参与了染色质集缩成染
色体的过程。 Armbrusher 等 (1983) 证实肌动蛋
白大部分分布在核液和集缩的染色质中, 认为肌
动蛋白和染色质转录调控、 核物质运输有关。 这
说明核物质的主动伸缩迁移可能由核内肌动蛋白
所主宰, 因而推测染色体的运动除受纺锤体微管
的牵拉力之外还受核内的肌动蛋白的影响。 由此
推测, 增强的 UV鄄B 辐射使小麦根尖细胞核中肌
动蛋白趋向于解聚状态, 使纺锤体微管不能如正
常情况将染色体拉向两极, 完成有丝分裂, 而相
反染色体不规则地停留在细胞核的部位, 纺锤体
从不同的方向牵拉染色体, 而在这种情况下完成
的有丝分裂很可能是 “分束分裂冶。
也参摇 考摇 文摇 献页
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013摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷