全 文 ：快速碱化因子基因BcRALF在菜心中的克隆及序列分析*
李焰焰1,2,曹家树2**
(1阜阳师范学院生命科学学院,安徽 阜阳暋236041;2浙江大学蔬菜研究所细胞与
分子生物学实验室,浙江 杭州暋310029)
摘要:快速碱化因子是近年来新发现的一种植物多肽类信号分子,广泛存在于高等植物中。通过已得到的
普通白菜的快速碱化因子基因 BcMF14 (GenBank序列登录号EF523516)的核苷酸序列,在其编码框两
侧设计引物,从菜心中克隆出该类信号分子基因,命名为BcRALF(登陆号:GU086228)。序列同源比对
表明该基因与花椰菜、拟南芥等的快速碱化因子基因有很高的相似性,证明BcRALF属于快速碱化因子
家族。蛋白质特征预测以及蛋白序列结构分析发现BcRALF蛋白包含有多个生物活性位点,符合其作为
多肽类信号分子类蛋白的特征。
关键词:菜心;BcRALF;快速碱化因子
中图分类号:S634灡3,Q785暋暋 暋暋文献标识码:A暋暋暋暋暋文章编号:0253灢2700(2010)02灢147灢04
IsolationandMolecularCharacterizationofRALF灢Like
GeneBcRALFfromBrassicacampestris
ssp灡chinensisvar灡parachinensis
LIYan灢Yan1,2,CAOJia灢Shu2**
(1SchoolofLifeSciences,FuyangTeachersColege,Fuyang236041,China;2LaboratoryofCeland
MolecularBiology,InstituteofVegetableScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310029,China)
Abstract:Therapidalkalinizationfactor(RALF)geneisanewfoundplantpolypeptidesignalmolecule,wide
spreadinginhigherplants.InthisstudyBcRALFwasclonedfromBrassicacampestrisssp灡chinensisMaki灢
novar灡parachinensisbasedonBcMF14 (GenBankaccessionnumberEF523516)from B灡campestrisssp.
chinensisvar.communiscv.Aijiaohuang.Thesequenceofthisgenewas273bp(GU086228)andwasiden灢
tifiedasarapidalkalizationfactorgeneaccordingtoitshighidentitywithB灡oleraceavar灡botrytisBoRALF1
andArabidopsisthalianaRALFL9.Proteincharacteristicsandsequencestructurewerepredicted,andmore灢
over,manybioactivesiteswerefound.TheresultsshowedthatthecharacteristicsoftheBcRALFprotein
consistentwithitscategoryasapeptidesignalmolecule.
Keywords:Brassicacampestrisssp灡chinensisvar灡parachinensis;BcRALF;Rapidalkalizationfactorgene
暋 快 速 碱 化 因 子 (rapidalkalizationfactor,
RALF)是植物多肽类信号分子的一种,是Pearce
等 (2001)在对系统素的研究中偶然发现的。多
肽信号是重要的胞间信号感应分子 (Franssenand
Bisseling,2001;RyanandPearce,2001;Matsuba灢
yashi等,2001;Pearce等,2001;RyanandPearce,
2003;Yang等,2000),它们与植物中非蛋白质
类的信号分子 (生长素、赤霉素、细胞分裂素、
云 南 植 物 研 究暋2010,32(2):147~150
ActaBotanicaYunnanica暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋DOI:10灡3724/SP灡J灡1143灡2010灡09204
*
**
基金项目:国家自然科学基金 (30671426)、浙江省重大科技项目 (2005C12019灢02)、安徽省高校青年教师资助项目 (2008jq1121)
通讯作者:Authorforcorrespondence;E灢mail:jshcao@zju灡edu灡cn
收稿日期:2009灢10灢14,2009灢11灢23接受发表
作者简介:李焰焰 (1976-)女,博士,副教授,研究方向:植物生物技术。E灢mail:liyanyan1976@yahoo灡com灡cn
乙烯、脱落酸、芸薹素、茉莉酸等)共同形成一
个信号网络,调节植物的生长发育。作为多肽信
号分子中的一大类别,快速碱化因子广泛存在于
植物中。被证明在植物多个器官的不同发育时期
都表达。花粉发育在植物生殖发育过程中是一个
研究热点,许多与花粉发育相关的基因和功能也
相继被报道 (Scott等,2004;WilsonandYang,
2004;McCormick,2004)。Bedinger等 (2003)
和Germain等 (2005)先后报道了一类快速碱
化因子基因,在花粉中特异表达,且与番茄、马
铃薯的生殖发育、育性等有明显关联,表明在
RALF家族中,可能存在一些专用于调控植物花
粉发育的信号分子。
本实验室在对 ‘矮脚黄暞普通白菜 (Bras灢
sicacampestrisL.ssp灡chinensisvar灡communis
TsenetLeecv.Aijiaohuang)小孢子发育的研
究中,发现一个快速碱化因子类基因BcMF14
(GenBank序列登录号:EF523516),并证实它
在白菜两用系的可育株系中特异表达。RT灢PCR
表达分析表明该基因在 ‘矮脚黄暞白菜可育系花
蕾的雄蕊部位专一表达,而在不育系的相应部位
不表达。由于在RALF家族中,可能存在一些
专一调控植物花粉发育的RALF信号分子,推
测BcMF14很可能参与并调控白菜花粉发育的复
杂过程。
菜心 (B灡campestrisL.ssp灡chinensisvar灡
parachinensisTsenetLee)是一种生长周期短的
芸薹属植物,适宜作为转基因的材料,本实验室
已经建立了成熟的菜心遗传转化体系,并成功用
于多种基因的转基因实验。为证明快速碱化因子
基因可能参与调控植物的花粉发育过程,本研究
从芸薹属的菜心中克隆出该类信号分子基因,对
其序列特征和系统进化进行初步分析,为下一步
在菜心中进行BcRALF转基因研究提供支持。
1暋材料与方法
1灡1暋材料
以浙江大学蔬菜研究所细胞及分子生物学实验室保
留的广东东莞白沙 ‘45天油青暞菜心为材料,并播于试
验田,田间管理按常规进行。在苗龄50d时,从群体中
随机选取单株,每株取2~3片鲜嫩叶片,所选材料用
75%的酒精棉擦洗干净,做好记号,用纱布包好,立即
投入液氮中固定,-75曟保存备用。
1灡2暋DNA的提取及基因的克隆
模板DNA的提取及检测参照本实验室的方法并略加
改进 (曹家树等,1995)。在BcMF14编码框两侧设计引
物P1 (5曚TAT GGGGATGTCTGAAAGTAT C3曚)和
P2 (5曚GTAAAATTAACCAAGGGTGGTG3曚),在菜
心中扩增同源基因。PCR反应总体积25毺L,包括DNA
模板 (20ng·毺L灢1)1毺L,10暳 PCR反应缓冲液2灡5毺L,
dNTP (10毺mol·L灢1)0灡5毺L,上下游引物 (10毺mol·
L灢1)各0灡5毺L,Taq酶 (5U·毺L灢1)0灡5毺L,反应条件
为94曟预变性2min;94曟变性30s,56曟退火30s,
72曟延伸2min,30个循环;72曟延伸10min。
扩增产物用1灡0%的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、
纯度及亮度。对于扩增效果良好且足量的样品用 VITA灢
GENE公司的 DNA 凝胶回收试剂盒回收,T4连接酶
4曟连接过夜,转入 DH5毩大肠杆菌中。挑取单个白色
菌落,以碱裂解法抽提质粒,用EcoRI进行单酶切鉴定
和PCR鉴定后,送上海博亚生物公司测序。
1灡3暋核酸序列及编码蛋白的特征分析
利用DNAStar软件对从菜心中得到的BcRALF基因的
核苷酸序列进行分析,包括序列的开放阅读框的查找、氨
基酸序列的翻译。预测蛋白质特征及蛋白序列结构分析通
过蛋白质专家分析系统 (http://ca灡expasy灡org)进行。
1灡4暋同源比对和系统树构建
将推测的BcRALF氨基酸序列在GenBank数据库用
blast软件与网上的快速碱化因子蛋白序列进行比对,并
将该基因编码的氨基酸序列用SequenceRetrieval系统在
网上的Swiss灢Prot蛋白数据库中进行同源比较,进一步
找出该基因的生物信息,用 MEGA3灡1软件对 Evalue
为0灡01的氨基酸进行序列分析,并用NJ法 (Nighbour灢
joing)和 ME法 (MinimumEvolution)构建进化树,采
用BootStrap1000检验分子系统树各处的置信度。
2暋 结果与分析
2灡1暋 BcRALF基因的克隆
以菜心DNA为模板,用引物P1、P2进行
PCR扩增反应,PCR产物经电泳鉴定,得到一
个大小为280bp左右的特异性条带 (图1)。将
该条带切胶回收,连接到pGEM灢T灢easy灢vector
载体上,转化E灡coliDH5毩感受态细胞,酶切
检测后,将阳性克隆后送出测序。
2灡2暋BcRALF序列特征分析
序列测定结果表明,BcRALF的DNA序列
由280个核苷酸组成 (登陆号:GU086228)。利
用DNAStar软件分析BcRALF最大开放阅读框
841暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
图1暋BcRALF基因PCR扩增结果
1.1kb核酸分子量标记;2.以菜心DNA为模板扩增结果
Fig灡1暋AmplicationresultsofBcRALF
1.1kbDNAmarker;2.amplifiedproductwithB灡campestris
chinensiscv.ParachinensisDNAastemplate
为240个碱基,编码79个氨基酸 (图2),对
BcRALF编码蛋白质的特征进行分析表明,该
基因编码的氨基酸序列的分子量为8灡7481kDa,
等电点为7灡814,pH7灡0时的电荷为1灡459;含
有碱性氨基酸 (K、R)9个,酸性氨基酸 (D、
E)8个,疏水氨基酸 (A、I、L、F、W、V)
23个,极性氨基酸 (N、C、Q、S、T、Y)23
个。通过Prosite数据库查询,发现BcRALF基
因编码的蛋白包含有多个生物活性位点。包括一
个N灢豆蔻酰化位点 (2~7),两个蛋白激酶C磷
酸化位点 (6~8、51~53),一个酪氨酸激酶II
磷酸化位点 (24~27),和一个酪氨酸激酶磷酸
化位点 (53~60)。
2灡3暋BcRALF同源比对和系统树构建
把BcRALF 的cDNA在 GenBank数据库用
blast软件进行同源性搜索,结果表明与花椰菜的
快速碱化因子 (BoRALF1,登录号DQ059310)、
拟南芥RALFL9 (登录号NM104838)的 mRNA
序列相似性很高,分别为97%、85%。并且与拟
南芥花和角果的一些cDNA序列的相似性也很高,
由此初步推断该基因属于快速碱化因子类基因。
进一步将该基因编码的氨基酸序列用Sequence
Retrieval系统在网上的Swiss灢Prot蛋白数据库比
对,证实该基因是快速碱化因子类基因。
用MEGA3灡1软件对Evalue为0灡01的蛋白
序列构建进化树,建树的蛋白序列来自花椰菜
(蛋白序列号:Q4TTZ9)、拟南芥 (Q3ECL0,
Q8LBS8,Q1ECR9,Q8LBK5)、水稻 (Q2QP50,
Q7G716,Q10LK5)、白 杨 (Q84UC8)、高 粱
(Q6TF28)、茄属 (Q5QJ47,Q945TO)。NJ法和
ME法构建的系统进化树结果一致,在此仅列出
NJ法的树 (图3)。从进化树上可以看出快速碱化
因子蛋白起源于共同的祖先,后来进化为不同的
类别,基本上反映了这些物种进化的规律,主要
的三个分支和传统分类学吻合。
3暋讨论
BcRALF与 GenBank数据库中登录的多个
RALF基因比较表明,它们的同源性很高,说明
BcRALF是一个快速碱化因子类新基因。并且,
图2暋BcRALF的序列分析结果。起始和终止密码子加框表示,单下划线是N灢豆蔻酰化位点,双下划线是酪氨酸激
酶磷酸化位点,阴影区是两个蛋白激酶C磷酸化位点,波浪线是酪氨酸激酶II磷酸化位点
Fig灡2暋ThestructureanalysisofBcRALF.Initiationandstopcodeareshowninframing.Underlinedsequencesis
N灢myristoylationsite,doubleunderlinedistyrosinekinasephosphorylationsit,shadedregionsare2Protein
kinaseCphosphorylationsite,wavelineiscaseinkinaseIIphosphorylationsite
9412期暋暋暋暋暋暋暋李焰焰和曹家树:快速碱化因子基因BcRALF在菜心中的克隆及序列分析暋暋暋暋暋暋暋暋暋
图3暋基于推测的BcRALF编码蛋白的氨基酸序列构建的NJ系统进化树。图中数字为自举检验置信值 (1000个复制序列)
Fig灡3暋PhyiogenetictreebasedonputativeBcRALFproteinandotherRALFproteinsusingNJmethod.
Numbersonthetreerepresentedconfidencevaluesfrombootstraptest(1000replicates)
和其它的RALF蛋白一样,推导的BcRALF蛋
白有4个保守的半胱氨酸残基。BcRALF 编码
的蛋白包含有一个 N灢豆蔻酰化位点,两个蛋白
激酶C磷酸化位点,一个酪氨酸激酶II磷酸化
位点和一个酪氨酸激酶磷酸化位点。多个生物活
性位点的存在说明作为信号分子,BcRALF蛋
白的功能可能有多种。研究发现,在RALF 基
因家族中有一类参与植物生殖发育的调节过程
(Germain等,2005;Bedinger等,2003;张国裕
等,2006)。BcRALF与白菜的BcMF14基因的
相似性极高 (编码框内仅有1个核苷酸的差异),
都属于快速碱化因子类基因。已证明BcMF14是
白菜花粉发育中的相关基因,因此推测菜心中的
BcRALF在花粉发育中必定起到关键作用,本
实验室已在菜心中进行转基因试验,深入研究该
基因的功能。
暡参暋考暋文暋献暢
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