全 文 ：中国小麦微核心种质资源 Psy基因的等位变异?
蔡 华1 ,2 , 马传喜2
??
, 司红起2 , 乔玉强2
(1 滁州学院化学与生命科学系 , 安徽 滁州 239000; 2 安徽农业大学农学院 , 安徽 合肥 230036 )
摘要 : 根据已发表的麦族植物 Psy基因序列的保守区设计引物 Psy02 , 克隆小麦 Psy基因 (片段 )。结果表
明 , Psy02 引物的扩增产物出现 2 种带型 : 196 bp和 233 bp, 序列分析表明两条特异条带涵盖了小麦 Psy基
因第 2 外显子全部序列 , 相差的 37 bp为 Psy基因第 2 内含子中的一段插入序列 , 可反映不同黄色素含量
(YPC) , 属小麦 Psy基因的等位变异。验证试验表明 , 248 份小麦微核心种质中有 153 份材料 (占样品数的
65.7% ) 扩增出 196 bp条带 , 群体内 YPC 均值 7.314 mg kg- 1 , 属高 YPC 范畴 ; 另有 95 份材料 (占样品总数的
38.3% ) 扩增出 233 bp条带 , 群体内 YPC 均值为 5 .207 mgkg- 1 , 属低 YPC范畴 , 方差分析表明二者 YPC 差异
达 1%极显著水平差异 , 说明上述 37 bp的插入序列是导致小麦品种间 YPC 产生差异的原因之一 , 因此该引
物扩增的 Psy基因对小麦 YPC 具有显著影响 , 引物 Psy02 是对小麦 YPC 进行分子鉴定的重要标记。
关键词 : 小麦 ; 微核心种质 ; Psy基因 ; 等位变异
中图分类号 : Q 943 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2009) 05 - 408 - 07
Allelic Variation of Psy Gene in Chinese
Wheat Micro-Core Collections
CAI Hua1 , 2 , MA Chuan-Xi2 * * , SI Hong-Qi2 , QIAO Yu-Qiang2
(1 Department of Chemistry and Life Science, Chuzhou University, Chuzhou 239000 , China;
2 Collegeof Agronomy, Anhui Agricultural University, Hefei 230036 , China)
Abstract: Primer Psy02 was designed according to conservative areas of Psy gene sequence of Ttiticum, and partial se-
quence of Psy gene of wheat was cloned . The results showedthat, two different PCR productswereamplified with 196 bp
and 233 bp, both of which covered whole sequence of the second exon of wheat Psy gene, and the 37 bp difference be-
tween two bandswas an insertion sequenceof the second exon of Psy gene, which displaydifferent YPC in wheat . Verifi-
cation test showed, that among248 wheat micro core collections, 153 samplesamplified196 bp band while therest samples
amplified 233 bp band which accounted for 61 .7 % and 38 .3% respectively . The YPC averagevalue of 153 sampleswas
7 .314 mg kg- 1 which belong to high YPC rang and that of 95 smapleswas 5 .207 mg kg- 1 which belongto low YPC rang .
Variance analysis showed that the YPC difference reached1 % significant level , which provedthe37 bp insertion sequence
was oneof thereasons of different YPC incultivars, inaword, theYPC of wheatwassignificantly affectedby the Psygene
and, primer Psy02 was an important molecular marker to identifying YPC .
Key words: Wheat; Micro-Core collections; Psy gene; Allelic variation
普通小麦 ( TtiticumaestivumL . 2 n= 6 x= AA-
BBDD) 籽粒黄色素 ( Yellow Pigment, YP) 是造
成面粉白度下降的重要因素 , 黄色素含量对蒸煮
面食品的色泽以及小麦的营养品质等均具有显著
云 南 植 物 研 究 2009 , 31 (5) : 408～414
Acta Botanica Yunnanica DOI : 10 .3724?SP. J . 1143 .2009.09134
?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : machx@163 . net; Tel : 0551 - 5786213
收稿日期 : 2009 - 07 - 14 , 2009 - 08 - 13 接受发表
作者简介 : 蔡华 ( 1972 - ) 男 , 博士研究生 , 副教授 , 主要从事小麦遗传育种研究。 E-mail : caihua1721220@163 . com ?
基金项目 : ?国家科技支撑计划 (2006BAD01A02) , 公益性行业 (农业 ) 科研支项 ( nyhyzx07-002 ) 和农业部“引进国际先进农业
科学技术” 项目 ( 2006-G2 )
影响 ( 张立平等 , 2006 )。不同食品对面粉色泽
的要求不同 , 日本、东南亚和澳大利亚等国的通
心面和加碱黄面条要求面粉黄色素含量较高 , 而
其他食品如面包、馒头和普通面条等却要求黄色
素含量低 , 这样才能生产出高白度的蒸煮面制食
品 ( 孙道杰等 , 2005) 。
黄色素是由多种物质组成的混合物 , 其主要
成分是类胡萝卜素 (Naik 等 , 2003; Sharp, 2001)。
类胡萝卜素的生物合成是在八氢番茄红素合成酶
(Phytoene synthase, Psy) 作用下进行的 , 此酶为类
胡萝卜素生物合成途径中的首要限速酶 ( Fraser
等 , 2002; Galagher 等 , 2004; Rёmer and Fraser,
2005) , 其基因也是类胡萝卜素基因操作的首选基
因。在禾谷类植物中 , 黄色素最初是在黄玉米
( Zea maysL .) 的成熟籽粒中被发现的 , 而白玉米
中则没有 (Gallagher 等 , 2004 )。研究表明 , 在不
同环境下富含黄色素的黄玉米 (深黄色胚乳 ) 中
Psy基因高剂量表达 , 而在白玉米 (浅白色胚乳 )
中却没有 , 这一现象表明虽然环境对黄色素含量
存在一定影响 , 但基因型是其主要影响因素 (Mi-
skelly, 1984) , 同时黄色素含量表达量的差异也提
示 Psy基因存在等位变异 , 这一点从近年来发表
于 NCBI 网站上的大量玉米 Psy等位基因序列已得
到证明 ( http:??www. ncbi .nlm.nih.gov, 序列号未
列出 )。然而迄今对小麦 Psy基因的等位变异研究
很少 , 鉴于此 , 本文在最近研究的基础上对小麦
Psy基因的等位变异进行研究 , 旨在明确小麦 Psy
基因与黄色素含量之间的关系 , 为解释小麦黄色
素生物合成的分子机制提供理论依据。
1 材料与方法
1 .1 材料
供试小麦品种 (系) 为安徽农业大学小麦育种与品
质改良实验室的育种材料 , 共 248 份遗传多样性丰富的
小麦微核心种质资源 , 于 2004～2005 两年分别种植于安
徽农业大学试验农场 (合肥) 和校外试验基地 (凤阳 )。
1 .2 方法
1 .2 .1 小麦籽粒黄色素含量的测定 参照 AACC 方
法 , 称取 3 .00 g面粉加 15 ml 水饱和正丁醇 , 反复振荡
1 h, 静置 10 min, 移上清液至离心管内 , 4000 r min- 1 下
离心 10 min, 以水饱和正丁醇为对照 , 436 nm下测其吸
光值 , 3 次重复 , 取其平均值乘以 30 .1 作为黄色素含量
YPC 的数值 (AACC, 1995)。
1 .2 .2 小麦基因组 DNA 的提取 采用改良的单籽粒
法 , 取一粒饱满的小麦籽粒充分研碎后放入 1 .5 ml 离心管
中 , 加入 700μl SDS 样品提取液 ( 0 . 288 mol L - 1 NaCl ,
0 .200 mol L - 1 Tris-HCl ( pH8 .0 ) , 0. 025 mol L - 1 EDTA ,
0 .5%SDS) , 60℃水浴 45 min, 酚 + 氯仿 + 异戊醇 (25∶24∶
1 , V?V) 抽提蛋白 , DNA 经异丙醇沉淀、乙醇漂洗后真
空干燥 , 1%琼脂糖凝胶检测 DNA 浓度 , - 20℃保存备用。
1 .2 .3 引物设计和合成 参考 He等 (2008) 的方法
设计引物 Psy02 , 交由上海 Sango 生物公司合成 , 其序列
为 : Forward: 5′-GGACCTTGCTGATGACCGAG-3′; Reverse:
5′-TGACGGTCTGAAGTGAGAATGA-3′。
1 .2 .4 PCR 反应体系和扩增程序 优化的 PCR 反应体
系总体积为 20μl , 各成分如下 : 10×PCR 的 buffer ( 2. 0
μl)、2 .5 mmol L - 1 的 dNTP (0. 8μl )、1μmol L - 1 的 Forward
Primerr和 Reverse Primerr (各 5μl)、1 U 的 Taq DNA 聚合酶
(0 .2μl)、2 .5 mmol L - 1 的 MgCl2 (1 .2μl )、50 ng DNA 模板、
无菌去离子水 (补足至 20μl)。以上试剂均购自上海 Sango
生物工程公司。PCR 反应扩增程序如下 (以引物 Psy04 为
例 , 其它引物的反应条件依据引物设计时提供的退火温
度适当调整 ) : 95℃预变性 5 min; 95℃变性 30 s, 59℃退
火 30 s, 72℃延伸 1.5 min, 共循环 40 次 ; 最后 72℃延伸 5
min。PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳分离检测 , 电泳缓
冲液为 1×TAE 溶液 , 100～120 V 电压电泳 1 h, 溴化乙锭
(EB) 染色 , 凝胶成像系统扫描并保存图像。
1 .2 .5 PCR 扩增产物的测序及序列分析 PCR 扩增产
物交由上海 Sango生物工程公司纯化、测序 (每对引物
的 PCR 扩增结果至少测序列 3 次以上 , 以确保测序结果
的正确性 )。测序结果递交至 http:?linux1. softberry. com?
berry. phtml ? topic = fgenesh&group = programs&subgroup =
gfind网站进行基因结构预测 , 并在 NCBI 网站上进行
BLAST 分析。利用 DNAStar 5 .0 软件包的 EditSeq程序对
BLAST 搜索结果中 E 值≤1e - 20 的各序列进行比对分析
(Li 等 , 2006 ) , 同时寻找被测序列的最大开放阅读框
(Open Reading Frame, ORF) , 并将 ORF 转换成氨基酸序
列 , 在 NCBI 网站对氨基酸序列进行 BLASTx分析。
2 结果与分析
2 .1 小麦籽粒黄色素含量的变异及分布
对供试材料 248 份中国小麦微核心种质的黄
色素含量进行测定 , 结果表明 , 248 份实验材料
的 YPC 变幅在 3 .477～16 .645 mg kg- 1 之间 , 平均
含量为 6 .472 mg kg- 1 , 最高、最低 YP 含量相差
4 .8 倍 , 高于平均数的品种 109 个 , 低于平均数
的品种 139 , 总体呈正态分布 ( 图 1 ) , 品种间
YP 含量达极显著水平差异 ( 表 1 )。
9045 期 蔡 华等 : 中国小麦微核心种质资源 Psy基因的等位变异
图 1 248 份普通小麦品种黄色素含量的分布频率
Fig . 1 Distribution of yellow pigment content in 248 wheat cultivars
表 1 248 份普通小麦黄色素含量的变异
Table 1 Variation of yellow pigment content in 248 wheat cultivars
变异来源 Source 自由度 DF 平方和 SS 均方 MS F 值 F ratio F0 ?. 05 F0 .01
重复间 Repeat 1 ?0 M. 32 0 .32 4 m. 55 3 .94 6 .9
品种间 Cultivar 247 ?7256 . 18 28 . 12 16 p. 18 ** 1 .48 1 .73
误差 Error 247 ?4 M. 48 0 .02
总变异 Total error 495 ?7260 . 98
2 .2 引物 Psy02 的 PCR 扩增结果
引物 Psy02 在黄色素含量不同的小麦品种中
表现出多态性 , 图 2 显示在 6 个高 YPC 品种中
( 编 号 : ANW098, ANW268 , ANW277, ANW261 ,
ANW147 和 ANW146) 扩出一个小于 200 bp的 PCR
产物 , 而在 2 个低 YPC 品种中 ( 编号 : ANW208
和 ANW291) 却扩出一条大于 200 bp的特异条带 ,
表明该引物可能为小麦黄色素含量进行分子鉴定
的重要标记。
2 .3 L引物 Psy02 扩增产物的序列分析及 Psy基
因的等位变异
8 条 PCR 产物经回收纯化后测序 , 结果表明 6
个高 YPC 品种扩增的片段其序列完全一致 , 为
196 bp, 而 2 个低 YPC 品种扩增的基因片段其序列
也完全一致 , 为 233 bp, 两序列相差 37 bp (图 3)。
DNAMAN 序列比对后发现 , 两序列的第 2～52 bp
图 2 引物 Psy02 的 PCR 扩增结果
M : DNA 标准分子量 ; 1、8: YP 含量低的小麦品种 ( ANW208 和 ANW291) ; 2～7 : Y P 含量高的小麦品种
(ANW098 , ANW268 , ANW277 , ANW261 , ANW147 和 ANW146)
Fig . 2 Results of PCR amplification in primer Psy02
M : DNA marker; 1 , 8 : wheat cultivar (ANW208 and ANW291) with low YPC; 2～7: wheat cultivar
(ANW098 , ANW268 , ANW277 , ANW261 , ANW147 and ANW146) with high YPC
014 云 南 植 物 研 究 31 卷
图 3 高、低 PYC 的 PCR 产物及探针的序列比对
阴影部分为 Psy 基因第 2 外显子序列 ; . . . . . .为 37 bp 的插入序列 ; 方框内为引物 Psy02 识别位点
Fig . 3 Sequences alignment between PCR products of high?low YPC wheat and primers
The 2th exon of Psy gene are shadowed, . . . . . . are insertion sequences with 37 bp, the sequence of the forward
primerr and complementary sequence of the reverse primerr for Psy02 are boxed
区域与用于设计引物的探针序列 ( EF600063、
EF600064、EU096090 和 EU096091 ) 的第 2 外显
子序列完全一致 ( 同源率达 100% ) , 因此确定
本次实验获得的 DNA 片段为小麦 Psy基因。
对 照 已 发 表 序 列 EF600063、 EF600064、
EU096090 和 EU096091 的 基因 信 息 , 发 现 序列
EF600064 为 低 YPC 品 种的 Psy 基 因 ( He 等 ,
2008) , 序列 EF600063、EU096090 和 EU096091 为
高 YPC 品种的 Psy基因 (He等 , 2008; Zhang and
Dubcovsky, 2008) , 两类序列在 Psy基因第 2 内含
子区域内也相差 37 bp, 且与本实验高?低 YPC 品
种的 37 bp 序列完全一致 (图 4 ) , 因此 , 可以推
1145 期 蔡 华等 : 中国小麦微核心种质资源 Psy基因的等位变异
断低 YPC 小麦品种相对高 YPC 品种多出的 37 bp
插入序列的差异是导致小麦 YPC 产生表型变异的
原因之一 , 说明不同 YPC 品种间 Psy基因的等位
变异与 YPC 存在明显的相关性。
序列分析同时表明 , 高低 YPC 的扩增片段
内含子部分与探针序列第 2 内含子相应序列的同
源率达 99 .03% , 仅出现 1 个 SNP (图 5 ) , 即使
排除测序错误的可能 , 也能说明小麦 Psy基因的
第 2 外显子和第 2 内含子在不同品种中具有高度
的保守性。但是与玉米 Psy基因相应区段相比 ,
却存在明显的多态性 , 图 6 显示 , 小麦 Psy基因
第 2 外显子虽然与玉米 U32636 一样 , 都含有 51
bp, 共编码 17 个氨基酸 , 但在此区域内二者却
存在 7 个 SNPs, 并由此导致 5 个氨基酸编码顺序
图 4 小麦 Psy基因第 2 内含子内 37 bp 的等位变异
Fig . 4 37 bp allelic variation in the 2th intron of wheat Psy gene
图 5 小麦 Psy 基因第 2 内含子内的 1 个 SNP
Fig . 5 1SNP in the 2th intron of wheat Psy gene
图 6 小麦和玉米 U32636 第 2 外显子及内含子序列比对 (阴影部分为第 2 外显子序列 )
Fig . 6 Sequences alignment between the 2th exons and introns of wheat and maize U32636 (The sequences of 2th exon are shadowed)
214 云 南 植 物 研 究 31 卷
的改变 , 变异率 29 .4%。因此 , 对于不同物种 ,
Psy基因及其编码的氨基酸序列在进化过程中产
生了明显的变异和分化 , 从而导致不同物种黄色
素含量存在明显的表型变异。而且 , 该序列的内
含子部分与玉米相应序列存在更多的 SNPs 和氨
基酸编码的变异 , 说明无论是基因序列结构 , 还
是基因表达调控 , Psy基因在小麦和玉米两物种
间均产生了明显的变异 , 这一结果与此前 Psy基
因第 4 外显子的分子特性的研究结果基本一致
(蔡华等 , 2008)。
2 .4 ?Psy02 引物在核心种质中的稳定性及对
YPC 进行分子鉴定的应用
248 份小麦材料用于重复上述试验和黄色素
含量的分子鉴定 , 其中 95 份扩出 233 bp的基因
片段 , 153 份扩增出 196 bp的基因片段。扩增出
233 bp的样品其 YPC 均值 ( 5. 207 ) 显著低于 196
bp样品 YPC 均值 (7 . 314) ( 表 2 ) , 说明 Psy02 引
物可作为一种功能标记对小麦 YPC 进行分子鉴
定。前已述及 248 份小麦材料 YPC 平均值为
6 .472 , 若以此值为临界将实验材料分为高 YPC
品种 ( 109 个 ) 和 低 YPC 品 种 ( 139 个 ) , 则
Psy02 引物的 PCR 结果与上述 YPC 测定结果不完
全相符 , 符合率 86 .3%。造成这一差异的原因可
能是小麦黄色素 YPC 的测定方法有待完善 , 或者
是因为 YPC 属复杂数量性状 , 不同年份间其含量
的差异导致平均 YPC 测定值产生误差。而且除了
Psy02 引物扩增出的一个基因 (片段 ) 外 , 可能还
有其他非同源染色体上的 Psy基因共同决定或调
控黄色素的生物合成 , 或者 Psy 含量受主效基因
控制 , 其它微效基因也会影响其含量。
3 小结
对麦族植物黄色素含量相关的 Psy基因研究
较少 , 现有的研究已表明 ( He等 , 2008) 麦族植
物 Psy基因主要存在于 7A 染色体上 (EF600063、
EF600064、EU096091 ) , 但 5A 染色体上也有 Psy
基因 ( EF115116、 EF115117、 EF115118 ) , 此 外
也有其它非同源染色体上较丰富等位变异的 QTL
证据。孙道杰等 (2006 ) 用玉米 U32636 序列为
探针设计引物在小麦基因组 DNA 中扩增出一个
Psy基因 , 应用中国春缺体—四体的非整倍体材
料将该基因定位于小麦 1D 染色体上。Kuchel 等
(2006) 和 Pozniak 等 (2007 ) 分别在六倍体普通
小麦和四倍体硬粒小麦的 7BL 染色体上定位了
一个面 粉 黄色 度 b 和 Psy 基因 的 主效 QTL。
Pozniak 等 (2007) 在四倍体硬粒小麦 7B 染色体
长臂上发现了一个黄色素含量的 QTL , 命名为
Psy-B1 基因 , 并认为该基因可能成为禾谷类植
物黄色素育种的一个重要候选基因。上述研究表
明 , 麦族 Psy基因存在丰富的遗传多态性。
本次试验表明 , 引物 Psy02 在普通小麦中具
有典型的多态性 , 这种多态性与小麦黄色素含量
存在明显的相关性 , 即在黄色素含量低的小麦品
种中具有 233 bp的 Psy基因序列 , 而在黄色素含
量高的小麦品种中具有 196 bp的 Psy基因序列 ,
高?低黄色素含量的表型差异与两种序列的差异
显著相关 ( P > 99% ) , 在 DNA 水平上表现为一
段 37 bp插入序列的差异。
基因组序列出现变异是等位基因遗传的基本
特征之一 , 它是各种生物进化和适应环境的必然
结果 , 基因组序列变异导致了“基因多态性”,
其中也包括了等位基因之间的多态性 ( Guo 等 ,
2004)。鉴于 Psy02 引物的特异性 , 我们认为该
引物可作为小麦黄色素含量分子鉴定的遗传标记
和黄色素含量分子育种的辅助选择标记和候选基
因 , 无论对小麦黄色素生物合成分子机制的理论
研究还是黄色素含量遗传育种的实践应用都具有
重要意义。
表 2 248 个小麦品种的黄色素含量方差分析
Table 2 Statistical analysis of the association between PCR band and YPC in 248 wheat accessions
扩增片段大小
Size of PCR products ( bp)
数目
Number
比例 ( % )
YPC
均值
Mean of YPCYPC
变幅
Rang of YPC
233 ?95 35 .6 5 ?. 207a 3 K. 492 - 9 8. 090
196 ?153 64 .4 7 .314b 4 9. 123 - 16 K. 645
注 : a、b 表示两群体 YP 含量均值间达极显著差异 ( P < 0 .01 )
a, b show different letters following the mean Y P content indicate highly significant differences between the two groups ( P < 0 .01)
3145 期 蔡 华等 : 中国小麦微核心种质资源 Psy基因的等位变异
〔参 考 文 献〕
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