全 文 ：一条卡瓦胡椒特异 RAPD 带转化成 SCAR 标记的研究?
施 江1 , 辛 莉1 , 谭 琳2 , 郑学勤2
( 1 河南科技大学农学院 , 河南 洛阳 471003; 2 华南热带农业大学热带作物生物技术国家重点实验室 , 海南 海口 571101 )
摘要 : 采用 27 份不同来源的胡椒属 ( Piper) 材料和 1 份不同属的草胡椒 ( Peperomia pellucida) 材料用引物
OPQ-03 扩增得到一条约 400 碱基对 ( bp) 卡瓦胡椒特异片段。对该片段进行了克隆和序列分析 , 并根据序
列分析结果将上述 RAPD 分子标记转化为重复性和特异性更好的 SCAR (sequence characterized amplified re-
gions, 序列特征化扩增区 ) 分子标记。本研究设计出了 1 对卡瓦胡椒特异 SCAR 引物 P7.1 ( 5′-GGT CAC
CTC ACC GCA GCA GGA TGA ACG-3′) 和 P7 .2 (5′-GGT CAC CTC AAT GAC ATG GGA TGA ATC-3′) , 用这对特
异引物对本次试验的 28 份材料进行 PCR 扩增 , 结果只有不同属的草胡椒材料无任何扩增 , 其它材料均扩
增出了预期大小 440 bp的特异带。
关键词 : 胡椒 ; 卡瓦胡椒 ; 胡椒属 ; RAPD; SCAR
中图分类号 : Q 78 , Q 943 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2007) 04 - 457 - 04
Study on the RAPD Specific Band of Kava ( Piper , Piperaceae)
Transferring to the SCAR Molecular Marker
SHI Jiang1 , XIN Li1 , TAN Lin2 , ZHENG Xue-Qin2
( 1 Agriculture College, Henan University of Science & Technology, Luoyang 471003 , China; 2 State Key Biotechnology
Laboratory for Tropical Crops, South China University of Tropical Agriculture, Haikou 571101 , China)
Abstract : This paper studied on 28 pepper materials, including16 cultivated papper materials, 3 wildpepper materials, 2
wild relatives of pepper materials, 6 kava ( Piper methysticum) materials, and 1 Peperomia pellucida materials . According
to RAPD analysis, we generate SCAR marker for identifying Kava ( Piper , Piperaceae) . A Kava-associated fragment with
a length ofabout 400 bp was generated with OPQ-03 primer . The fragment was cloned and sequenced . PCR amplification
with the specific primers P7 .1 ( 5′-GGT CAC CTC ACC GCA GCA GGA TGA ACG-3′) and P7 .2 (5′-GGT CAC CTC
AAT GAC ATG GGA TGA ATC-3′) was performedto28 materials, which27 materials amplified the440 bp specific band
except for Peperomia pellucida Kunth .
Key words: Piper nigrum; Piper methysticum; Piper; Randomamplified polymorphic DNA ; Sequence-characterized am-
plified region
卡瓦胡椒 ( Piper methysticumFont . f .) , 俗称
卡瓦 ( Kava or kawa) , 是瓦努阿图、斐济、汤
加、巴布亚一新几内亚及所罗门群岛等中南太平
洋诸岛野生或种植的一种多年生胡椒科胡椒属灌
木类药用植物。
卡瓦胡椒具有治疗焦虑症、抑郁症、促进睡
眠和提高睡眠质量的显著疗效 , 对于缓解精神紧
张和放松肌体都有很好的作用 , 且毒负作用小。
2001 年 , 卡瓦胡椒种植技术被列为我国“十五”
科技攻关项目。
云 南 植 物 研 究 2007 , 29 (4) : 457～460
Acta Botanica Yunnanica

? ?基金项目 : 国家十五重点攻关课题 (编号 : 2001BA707B) 资助 , 河南科技大学校基金资助
收稿日期 : 2006 - 10 - 27 , 2007 - 02 - 27 接受发表
作者简介 : 施江 ( 1966 - ) 男 , 博士 , 河南科技大学副教授 , 研究方向 : 植物分子生物学与植物基因工程。
Tel : 0379 - 64280115 ; E-mail : shijiang@ mail .haust. edu. cn, shijiang66@ 21cn. com
胡椒及其近缘种的 SCAR 分子标记研究 , 目
前国内外尚未见有报道。在我们进行胡椒、卡瓦
胡椒与草胡椒的 RAPD 聚类分析中 ( 辛莉等 ,
2005; 施江等 , 2005 ) , 我们发现一些卡瓦胡椒
的特异带。若把这些特异带转化成 SCAR 标记 ,
就可以提高所找到的某一 RAPD 标记在应用上的
稳定性。可将该 RAPD 标记片段从凝胶上回收并
进行克隆和测序 , 根据其碱基序列设计一对特异
引物 (18～24 个碱基左右 )。以此特异引物对基
因组 DNA 再进行 PCR 扩增 , 便可扩增出与克隆
片段同样大小的特异带。这种经过转化的特异
DNA 分子标记称为 SCAR 标记。相对于 RAPD 标
记 , SCAR 标记由于所用引物较长及引物序列与
模板 DNA 完全互补 , 因此扩增结果稳定性好、
可重复性强。
1 材料方法
1 .1 材料
卡瓦胡椒采自太平洋岛国 , 胡椒采自兴隆热带植物
园种质资源圃 , 其它胡椒属野生种采自霸王岭、儋州中
国热带农业科学院、华南热带农业大学。
Taq酶、dNTPs 购自华美生物工程公司 , 克隆载体
pMD18-T 购自大连宝生生物公司 , 大肠杆菌 XL-1 blue为本室
保存 , SCAR 引物由上海 Sangon公司合成 , 实验材料见表 1。
1 .2 植物基因组 DNA 的提取和 RAPD 扩增
参照王关林和方宏筠 (2002 ) 的方法 , 采用 CTAB
法提取 28 份实验材料的基因组 DNA。通过对模板 DNA
用量、Mg2+ 浓度、退火温度、电泳上样量等几个单因子
试验来建立 RAPD 稳定扩增体系和反应条件。优化的
RAPD 反应条件 : 95℃ , 5 min; 94℃ , 1 min; 36℃ , 1
min; 72℃ , 2 min; 45 个循环 ; 72℃ , 7 min。
采用 OPQ-03 随机引物对 28 份材料进行了 RAPD 扩
增 (图 1)。对其中 OPQ-03-400 (前面为引物编号 , 后面
为片段大小 ) 进行回收和克隆。
1 .3 ?从琼脂糖凝胶电泳回收卡瓦胡椒 RAPD扩增特异带
采用 QIAGEN公司的 QIAquickGel Extraction kit试剂盒
回收 OPQ-03-400 这条卡瓦胡椒特异带。按 TaKaRa公司
pMD18-T vector连接试剂盒使用说明书提供的方法 , 将
PCR 回收产物分别与 pMD18-T vector连接。16℃反应 2 h,
然后置于 4℃冰箱备用。
表 1 供试材料
Table 1 Test Materials
编号 材料名称 采集地 备注
1 E山胡椒 ( Piper hancei Maxim) 霸王岭 Piperaceae
2 E草胡椒 ( Peperomia pellucida Kunth .) 儋州两院 Peperomia
3 E蒌叶 ( Piper betleL .) 儋州两院 原产印度尼西亚 , Piper
4 E?蒌 ( Piper sarmentosumRoxb .) 两院海口校区 Piper
5 E卡瓦胡椒 1 ?号 ( Piper methysticum Forst . f ., 俗名 Kava) 南太平洋岛国斐济 Piper, 绿杆
6 E卡瓦胡椒 2 ?号 ( Piper methysticum Forst . f ., 俗名 Kava) 南太平洋岛国斐济 Piper, 绿杆
7 E卡瓦胡椒 3 ?号 ( Piper methysticum Forst . f ., 俗名 Kava) 南太平洋岛国斐济 Piper, 绿杆 , 节部肿大
8 E卡瓦胡椒 4 ?号 ( Piper methysticum Forst . f ., 俗名 Kava) 南太平洋岛国斐济 Piper, 绿杆 , 节部肿大
9 E卡瓦胡椒 5 ?号 ( Piper methysticum Forst . f ., 俗名 Kava) 南太平洋岛国斐济 Piper, 红杆
10 X卡瓦胡椒 6 ?号 ( Piper methysticum Forst . f ., 俗名 Kava) 南太平洋岛国斐济 Piper, 红杆
11 X印尼大叶种 ( Piper nigrum L .) 兴隆热带植物园 Piper
12 X班尼约尔 1 ?号 ( Piper nigrumL .) 同上 Piper, 原名 Panniyur-1 @
13 X古晋 ( Piper nigrumL .) 同上 Piper, 原名 Kuching
14 X大山 ( Piper sp .) 同上 Piper
15 X山蒌 ( Piper sp .) 同上 Piper
16 X1 2号杂交种 ( Piper nigrumL .) 同上 Piper, 班尼约尔 1 ?号×印尼大叶种
17 X3 2号杂交种 ( Piper nigrumL .) 同上 Piper, 班尼约尔 1 ?号×印尼大叶种
18 X5 2号杂交种 ( Piper nigrumL .) 同上 Piper, 班尼约尔 1 ?号×印尼大叶种
19 X6 2号杂交种 ( Piper nigrumL .) 同上 Piper, 班尼约尔 1 ?号×印尼大叶种
20 X7 2号杂交种 ( Piper nigrumL .) 同上 Piper, 班尼约尔 1 ?号×293 (印尼大
叶种×班尼约尔 1 ?号 )
21 X8 2号杂交种 ( Piper nigrumL .) 同上 Piper, 班尼约尔 1 ?号×胜 20 (柬埔寨×
印尼大叶种 )
22 X印柬 45 ?( Piper nigrumL .) 同上 Piper, 印尼大叶种×柬埔寨
23 X班 293 ?( Piper nigrumL .) 同上 Piper, 印尼大叶种×班尼约尔 1 号
24 X班柬印 ( Piper nigrum L .) 同上 Piper, 班尼约尔1 ?号×柬埔寨×印尼大叶种
25 X班云大 ( Piper nigrum L .) 同上 Piper, 班尼约尔 1 ?号×云选一号×大山
26 X云选一号 ( Piper nigrumL .) 同上 Piper
27 X大山×印尼 ( Piper nigrum L .) 同上 Piper
28 X柬印 93 ?( Piper nigrumL .) 同上 Piper, 柬埔寨×印尼大叶种
854 云 南 植 物 研 究 29 卷
图 1 OPQ-03 在 400 bp 处卡瓦胡椒特异带
Fig . 1 OPQ-03 expression in Kavawith specific band at 400 bp
1 .4 重组质粒的酶切鉴定 (参照黄培堂等译 , 2003 )
对电泳滞后的质粒进行进一步的酶切鉴定。由于
pMD18-T Vector在外源片段插入缺口的两端近旁分别有
HindⅢ和 EcoRI 酶切位点 , 故选用 HindⅢ和 EcoRI 进行
双酶切以确认插入片段的大小。37℃保温 3 h, 酶切反应
结束后 , 取反应液进行电泳检查 , 用 TaKaRa公司生产的
100 bp DNA Ladder Marker 和 MBI 公司生产的 MassRulerTM
DNA Ladder 作分子量标记。
1 .5 克隆产物的测序与测序结果的分析
将附加有 100 mg?L Amp的 LB 固体培养基倒入经高
压灭菌的 1 .5 mL 离心管中 , 待其凝固后 , 挑取含有重组
质粒的菌液插入培养基中 , 直达管底数次 , 将管盖盖
紧 , 封上膜 , 置于 37℃培养过夜。将穿刺培养物交与上
海生工生物工程技术服务有限公司 , 由其采用双脱氧终
止法在 ABI 377 型 DNA 测序仪上进行测序。根据 OPQ-03-
400 克隆片段的测序结果 , 结合引物设计的一般原则 ,
如两条引物不能相互配对 , 5′端和 3′端两条引物的 Tm值
相近 , 两条引物的 3′端最好不能有 A , 引物长度在 20～
30 碱基 ( nt) , 在原有随机引物的基础上 , 向 3′端延伸
13～19 个 nt, 设计了 1 对 OPQ-03-400 特异 PCR 引物。
2 SACR 结果与分析
2 .1 RAPD 扩增产物的回收
卡瓦胡椒特异带 OPQ-03-400 回收结果如图 2
所示 ( 7 号 )。7 号泳道呈现出一条清晰的带 , 表
明此次回收是成功的 , 各回收片段都比较纯 , 适
宜连接 T 载体。
2 .2 重组质粒的酶切鉴定
小量提取重组质粒 , 用 EcoRI 和 HindⅢ进
行双酶切 , 结果见图 3 (编号 7) 。挑选含有目的
插入片段的重组子进行穿刺培养以备测序分析。
2 .3 克隆序列的测序和分析
克隆序列测序结果见图 5 , 序列测定的结果
较好 , 两端的随机引物位点和酶切位点均正确无
误。根据序列测定结果 , SJ7 克隆片段的准确大
小为 440 bp。
2 .4 与胡椒属特异的 SCAR 标记鉴定
引物序列见表 2:
特异引物 P7.1 和 P7.2 对这 28 份材料的扩增
结果显示 (图 4 ) , 除不同属的草胡椒 ( 图 4 中 2
号泳道 ) 不出带外 , 其余 27 份胡椒属材料均扩增
出了预期大小 (440 bp) 的带 , 说明 P7 .1 和 P7 .2
这对特异引物有可能是胡椒属的特异 SCAR 标记。
图 2 卡瓦胡椒特异带回收电泳结果 ( 7 号带 )
Fig . 2 Recovery of specific band of Kava
图 3 重组质粒的酶切鉴定
Fig . 3 Enzymatic lysis of recombination plasmid
9544 期 施 江等 : 一条卡瓦胡椒特异 RAPD 带转化成 SCAR 标记的研究
图 4 引物 P7 .1 和 P7 .2 的 PCR 扩增结果
Fig . 4 Gel of PCR amplificatio with specific primers P7 .1 and P7 .2
图 5 OPQ-03-400 克隆片段的测序结果
Fig . 5 The sequencing result of the clonal fragment
注 : “方框”表示酶切位点 , “双下画线”表示 RAPD 引物位点 ,
“单下画线”表示 SCAR 引物延长位点。
表 2 OPQ-03-400 SCAR 引物设计序列
Table 2 The sequences of SCAR primers
引物编号 引物序列
P7 |. 1 5 ?′-GGT CAC CTC ACC GCA GCA GGA TGA ACG-3′
P7 |. 2 5 ?′-GGT CAC CTC AAT GAC ATG GGA TGA ATC-3′
3 讨论
SCAR 标记被广泛应用于一些形态上难以区
分而且经济价值差异较大的种和品种鉴别及种质
评价。Wang等 (2001) 用 SCAR 标记能鉴别 6 种
常用的西洋参品种和 2 种常用的掺假物。Das 等
(2005 ) 利用种特异 SCAR 标记 Baclco836 和 Tul-
do609 能有效的鉴别巴库竹和马甲竹 , 两者无意
识的混淆往往影响纸浆的产量和质量。由卡瓦胡
椒 RAPD 特异 带 转化 成 SCAR 标记 , 并 不 是
100%的成功率 , 各种情况都会出现。在我们进
行的卡瓦胡椒及其近缘种的 SCAR 研究中 , 共开
发了 4 对特异卡瓦胡椒 SCAR 标记 , 有两对可用
于卡瓦胡椒种的分子鉴定 , 而 P7 .1 和 P7 .2 有可
能成为胡椒属的 SCAR 标记。
从 P7.1 和 P7.2 对这 28 份材料的扩增结果来
看 , 27 份胡椒属材料均扩增出了预期大小 (440
bp) 的带 , 而不同属的草胡椒则不出带 , 从目前
的结果看这对特异引物是胡椒属的特异 SCAR 标
记。但需扩大试验材料的范围 , 更进一步地加以
验证 , 若真能成为胡椒属特异 SCAR 标记 , 则对
胡椒属的种质鉴定及分子分类有一定意义。若想
把 P7.1 和 P7 .2 开发成为卡瓦胡椒特异 SCAR 标
记 , 也可 进一步 作成 CAPS 标记 ( 黄健 华等 ,
2005) , 看能否成为卡瓦胡椒特异 CAPS标记。
〔参 考 文 献〕
王关 ?林 , 方宏筠 , 2002 . 植物基因工程 ( 第二版 ) [ M] . 北京 : 科
学出版社 , 742—744
黄培堂等译 ( 萨姆布鲁克 , 拉塞尔编著 , 2001) , 2003 . 分子克隆
实验指南 (第三版 ) [ M] . 北京 : 科学出版社 , 461—512
Das ?M, Bhattacharya S, Pal A , 2005 . Generation and characterization of
SCARs for species-specific marker development in bamboo [ J ] . Ann
Bot (Lond) , 95 (5 ) : 835—841
Huan ?g JH (黄健华 ) , Miao XX ( 苗雪霞 ) , Li MW (李木旺 ) et al .
2005 . The acquisition of twosilkworm CAPsmarkers and their use in
genetic diversity and phylogenetic relationship [ J ] . Hereditas ( 遗
传 ) , 27 (4 ) : 584—588
Shi ?J (施江 ) , Xin L ( 辛莉 ) , Zheng K ( 郑楷 ) et al . 2005 . Study
on the clustering analysis of Piper methysticum and Piper nigrum by
RAPD [ J ] . Biotechnology ( 生物技术 ) , 15 (6) : 34—37
Wang ?JH , NganWY , But FN et al . 2001 . Application of sequence char-
acterized amplified region ( SCAR) analysis to authenticate Panax
species and their adulterants [ J ] . Planta Med, 67 ( 8) : 781—783
Xin ?L (辛莉 ) , Shi J ( 施江 ) , 2005 . Study on the RAPD amplification
system of kava [ J ] . Biotechnology ( 生物技术 ) , 15 (4) : 32—34
064 云 南 植 物 研 究 29 卷