全 文 ：夏枯草多糖的分离纯化与抗氧化活性研究?
张德华
( 皖西学院化学与生命科学系 , 安徽 六安 237012 )
摘要 : 对夏枯草多糖 (PP2) 的分离纯化方法作了探讨 , 通过正交试验 , 筛选出多糖提取条件的最佳组合。
采用纸层析、琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法对多糖纯度进行鉴定。通过气相色谱仪对多糖的单糖组成
进行分析。通过体外化学模拟 , 研究夏枯草多糖的抗氧化性。实验表明 , 夏枯草多糖对 O2 - ·、·OH 二种
自由基及亚硝酸根离子具有一定的清除能力 , 对 R·自由基的清除较弱 , 具有防止膜脂质过氧化 , 减少红
细胞溶血和降低脂质过氧化产物丙二醛的生成量的作用。
关键词 : 夏枯草 ; 多糖 ; 抗氧化
中图分类号 : Q 946 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700(2006)04 - 410 - 05
Isolation , Purification and Antioxidant Activity of the
Polysaccharide of Prunella vugaris (Labiatae)
ZHANG De-Hua
( Department of Chemistry and Life Science, West Anhui University, Lu’an237012 , China)
Abstract: This report described the isolation and purification of the polysaccharide from Prunella vugaris L . (PP2) . The
best combination of isolation conditions had been obtainedthrough theorthogonal experiment . Paper Chromatography, agar-
ose gel electrophoresis andultraviolet spectroscopy had been introduced to determinethepurityof the PP2 andfractional dep-
osition andgas chromatographyhad beenappliedto analyzethemonosaccharideconstituents of PP2 . By thechemical simula-
tion invitro, theantioxidant activityof PP2 hadbeen studied . The resultsof theexperiment showedthat PP2 had significant
scavenging effect onoxideradical, hydroxide radical andunivalent radical NO2 but poor scavengingeffect on organic radical .
PP2 could prevent themembrane lipid from peroxidation and reduce hemolysis of red cells and production of MDA aswell .
Key words: Prunella vugaris; Polysaccharide; Antioxidation
夏枯草 ( Prunella vugaris L .) 为唇形科 (La-
biatae) 夏枯草属 ( Prunella) 植物 , 多年生草本。
生于荒地、路旁及丘陵山坡草丛中 , 以山区较多。
主产于江苏、安徽、浙江、河南等省。夏枯草的
干燥果穗和全草均可入药。具有清肝火、明目、
散热、利尿功能。主治头昏目眩、筋骨疼痛、高
血压等 (肖培根等 , 2002)。夏枯草嫩茎叶或花穗
也可食用 , 不仅味道鲜美 , 还有助于增强人体免
疫等功能 (陈吉飞等 , 2001)。
有关夏枯草的药材鉴别、栽培、化学成分的
报道较多 ( 浦湘渝和周俊 , 1987; 张颖君和杨崇
仁 , 1995; 徐仲仙等 , 1996; 罗目和等 , 2005 )。
但关于夏枯草多糖的提取和抗氧化性的研究未见
报道 , 本文进行了夏枯草多糖的分离纯化、单糖
组成分析。着重研究了多糖在体外化学模拟条件
下 , 对超氧阴离子自由基、羟自由基、脂质自由
基和亚硝酸根离子的清除作用。在亚细胞和组织
水平上研究了多糖在降低膜脂质过氧化、减少红
细胞溶血性的能力。以期为夏枯草多糖功能性食
品的开发利用提供理论依据。
云 南 植 物 研 究 2006 , 28 (4) : 410～414
Acta Botanica Yunnanica

? ?基金项目 : 安徽省教育厅自然科学基金 ( No . 2006KJ 233B)
收稿日期 : 2005 - 10 - 24 , 2006 - 02 - 22 接受发表
作者简介 : 张德华 (1957 - ) 男 , 副教授 , 研究方向为生物技术及天然产物的开发。 E - mail : zdhla@ 163 . com
1 材料与方法
1 .1 材料
夏枯草采自大别山区霍山县 , 全草 60℃烘干 , 粉碎
过 40 目筛。昆明种小鼠 , 由安徽医科大学动物实验中心
提供。
1 .2 方法
1 .2 .1 多糖的 提取 称取夏枯 草粉末 , 加石 油醚
(70℃ ) 回流脱脂 2 次 , 回收石油醚 , 固形物中加 80%的
乙醇 (90℃ ) 回流 2 次 , 去除低聚糖及其它醇溶性物质 ,
挥干溶媒 , 加水于水浴中提取 , 提取液经减压浓缩、乙
醇沉淀 12 h, 95 %乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚分别洗
涤 2 次 , 烘干得夏枯草粗多糖 (PP1)。
1 .2 .2 分离纯化 将 PP1 溶解后脱蛋白 , 依次用三氯乙
酸法、盐酸法、鞣酸沉淀法和 Sevag法 (Staub, 1956 ) 4
种脱蛋白方法各 1 次 , 合并上述脱蛋白糖液。再用 0 .5
mol?L NaOH 溶液中和至中性 , 用 1 g活性炭粉末回流提
取 1 h, 脱色 , 离心 (4000 r?min, 10 min) , 除去沉淀得
上清夜。将上清液装入透析袋 (Spectra por 2 再生纤维素
膜) 中 , 流水透析 40 h, 减压浓缩、醇沉、洗涤 2 次
(无水乙醇、丙酮、乙醚 ) , 干燥得夏枯草精多糖 (PP2)。
1 .2 .3 多糖含量测定
PP1 总糖 测 定 : 采 用硫 酸 - 苯 酚 法 ( 周 燕霞 ,
2003) , 以葡萄糖为标准品。
PP1 还原糖测定 : 斐林试剂直接滴定法。PP1 粗多糖
含量 = PP1 总糖—PP1 还原糖
1 .2 .4 单糖组成分析 称取 PP2 10 mg, 加入 2 mol?L 三
氟乙酸 3 ml , 在 100℃水浴锅中密闭水解 6 h, 以碳酸钡
中和至 pH7～8 , 离心 , 取上清液 , 减压蒸发至干 , 重复
1 次。再加入 10 mg盐酸羟胺 , 0 . 5 ml 吡啶 , 放入 90℃水
浴加热反应 30 min并振荡。取出冷至室温 , 加入 0 .5 ml
醋酸酐 , 在 90℃继续反应 30 min, 乙酰化完成 , 反应产
物直接用于气相色谱分析。以鼠李糖、阿拉伯糖、木
糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖为对照的标准单糖 , 同样
处理后进行气相色谱分析。
1 .2 .5 多糖的分级 采用甲醇分级沉淀 (张憔杰 , 1987)
1 .2 .6 纯度鉴定
1 .2 .6.1 紫外分光光度法 将 PP2 配成 500μg?mL 的溶
液 , 作紫外光谱分析 , 测 PP2 的吸光度。紫外光谱扫描
250～280 nm是否有特征吸收。
1 .2 .6.2 纸层析法 新华 2 号滤纸 , 点样量为 0 .5% 精
多糖 (PP2b) 水溶液 20μl , 展开剂 (吕燕等 , 2001) 为
正丁醇∶浓氨水∶水 (40∶50∶5 ) , 饱和 2 h, 上行层析 , 室
温展开 6 h, 取出后吹干 , 染色液 0 .5% 甲苯胺蓝 , 95%
乙醇漂洗至背景褪色 , 吹干。
1 .2 .6.3 琼脂糖凝胶电泳 胶浓度 0.6 % , 厚 3 mm; 上
样液 : PP2b 溶液 20μl ( 2 mg?ml ) , 10% 甘油 5μl。指示
剂 : 溴酚蓝。电泳缓冲液 : 0 .075 mol?L 巴比妥缓冲液
(pH8 .6) ; 电压 : 110 V , 电泳 2 h; 染色液 0 .1% 甲苯胺
蓝 ; 脱色液为乙醇∶水∶醋酸 = 5∶5∶0 .1。
1 .2 .7 抗氧化活性研究
1 .2 .7.1 多糖对 O2 - ·的清除作用 参考 Hassan (1984)
的光化学方法略有改动。反应体系包括 2.4×10 - 6 mol?L
RFV、0 .01 mol?L Met、1 .67× 10 - 4 mol?L NBT、0 .1 mol?L
磷酸缓冲液 ( pH8 .0) 和不同浓度的多糖。在 560 nm处
测各浓度下的吸光度 Ax, 便能测定夏枯草多糖对 O2 - ·
的清除作用。
1 .2 .7.2 多糖对·OH 的清除作用 以 Smirnoff 等 (1989)
的方法为基础并改进。3 ml 反应液含 0 .15 mol?L FeSO4 , 6
mmol?L H2 O2 , 2 mmol?L 水杨酸钠和不同质量浓度的 PP2 ,
最后加 H2 O2 启动反应 , 37℃反应 1 h, 测 510 nmOD值 ,
吸光值越小 , 清除效果越好。
1 .2 .7 .3 多糖对 R·的清除 按周志刚等 (1997) 的方法。
1 .2 .7.4 模拟胃液条件下多糖对亚硝酸钠的清除 按谢
祥茂等 (2001) 的方法。
1 .2 .7.5 PP2 抗 H2 O2 引起的小鼠肝组织丙二醛 (MDA)
的生成 按向荣等 (1990) 的方法。
1 .2 .7.6 PP2 对 H2 O2 诱导的红细胞氧化溶血的抑制作用
按李志孝等 ( 2000) 的方法。
表 1 粗多糖提取实验 L9 ( 34 ) 正交表
Table 1 The orthogonal table derived from the experiment of
polysaccharide extraction
试验号 水提温度 水提时间 料液比 水提次数 多糖含量 ( % )
Experi- (℃ ) ( h) The ratio Frequency Polysaccha-
ment No . Temper- Time of solid to ride
ature solution content
1 ?80 34 10 ?1 t10 . 9
2 ?80 35 20 ?2 t11 . 3
3 ?80 36 30 ?3 t11 . 7
4 ?90 34 20 ?3 t14 . 7
5 ?90 35 30 ?1 t12 . 1
6 ?90 36 10 ?2 t9 .8
7 ?100 F4 30 ?2 t10 . 1
8 ?100 F5 10 ?3 t13 . 5
9 ?100 F6 20 ?1 t11 . 4
k1 ?11 ?. 3 11 .9 11 .4 11 a. 5
k2 ?12 ?. 2 12 .3 12 .5 10 a. 4
k3 ?11 ?. 7 11 11 .3 13 a. 3
R 0 ?. 9 1 m. 3 1 .2 2 O. 9
2 结果与分析
2 .1 夏枯草多糖提取的工艺条件
根据单因素初步试验 , 影响夏枯草多糖提取
率的主要因素有提取温度、时间、料液比、次数
等 , 采用 L9 ( 34 ) 正交试验设计 ( 表 1 )。根据
各实验因素水平 , 取定容至 250 ml 的浓缩液 2
1144 期 张德华 : 夏枯草多糖的分离纯化与抗氧化活性研究
ml , 定容至 100 ml , 用硫酸 - 苯酚法测其吸光
度 , 换算出 PP1 粗多糖含量 ( % )。
由以上正交试验及极差分析结果表明各因素
对夏枯草多糖提取率影响的顺序为 : 水提次数 >
时间 > 料液比 > 温度。最优水平组合为温度
90℃ , 提取时间 4 h, 料液比 1∶20 , 水提取 3 次。
2 .2 多糖含量
测得每 100 g 风干材料获 PP1 总糖含量为
17 .07 g, 粗多糖含量为 14.7 g, 粗多糖占总糖百
分率为 86 .1%。
2 .3 单糖组成
根据图 1 和图 2 得出的表 2 和表 3 , 可看出
PP2 中单糖至少由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘
露糖、葡萄糖、半乳糖等组成。
2 .4 甲醇分级沉淀获级分 PP2a、PP2b、PP2c。
各部分酸解后 , 经气相色谱分析其组成 ( 表 4 )。
表 2 标准单糖的气相色谱表
Table 2 The list of the constitute of standard monosaccharideby gas chromatography
单糖组成 Composing 鼠李糖 Rhamnose 木糖 Xylose 阿拉伯糖 Arabinose 甘露糖 Mannoes 葡萄糖 Glucose 半乳糖 Galactose
出峰时间?min 10 ?. 5 11 ]. 3 12 .1 15 .2 20 6. 3 23 .8
表 3 多糖 PP2 的单糖组成气相色谱表
Table 3 The list of the constitute of monosaccharide fromPP2 by gas chromatography
单糖组成 Composing 鼠李糖 Rhamnose 木糖 Xylose 阿拉伯糖 Arabinose 甘露糖 Mannoes 葡萄糖 Glucose 半乳糖 Galactose
出峰时间?min 10 ?. 2 11 ]. 1 12 .2 15 .4 20 6. 5 23 .7
图 1 标准单糖的气相色谱图
Fig . 1 Gas chromatogram of standard monosaccharide
图 2 PP2 的气相色谱图
Fig . 2 Gas chromatogram of PP2
表 4 甲醇分级夏枯草多糖
Table 4 Fractional deposition of PP2 by methanol
沉淀时甲醇浓度 ( % )
Concentration of methanol
级分
Fractional
沉淀量 ( % )
Deposition
组成 Composing
鼠李糖 木糖 阿拉伯糖 甘露糖 葡萄糖 半乳糖
Rhamnose Xylose Arabinose Mannose Glucose Galactose
33 wPP2 Ja 19 n— — — — + + + —
33 8- 50 PP2 Hb 38 n+ — + + + + +
50 8- 60 PP2 Jc 24 n— + + + — +
从表 4 可知 PP2a为单一级分的葡聚糖 , 其
它级分为杂多糖。
2 .5 纯度鉴定
根据图 3 的紫外光谱图 , 夏枯草多糖 PP2 的
吸光度在 250～280 nm无吸收峰 , 表明样品中已
检测不出蛋白质、多肽、核酸。
夏枯草多糖 PP2b纸层析得单一紫红色斑点 ,
颜色深浅均匀 (图 4 左 )。PP2b琼脂糖凝胶电泳
结果只有一条带 , 表明无其它杂质 (图 4 右 )。
2 .6 夏枯草多糖抗氧化活性
2 .6 .1 多糖清除自由基活性结果 本实验在体
外设计产生 O2 - ·、·OH 和 R·3 个体系中 , 分别
加入不同浓度的夏枯草多糖粗品和精品 , 实验结
果见表 5。由表 5 可知 , 夏枯草多糖对 O2 - ·和·
OH 都有清除作用 , 清除能力与多糖的浓度成正
相关。夏枯草多糖对 R·清除能力较弱 , 并且不
214 云 南 植 物 研 究 28 卷
显示量效关系。
图 3 夏枯草多糖 ( PP2) 的紫外图谱
Fig . 3 UV spectrum of PP2
图 4 PP2b 的纸层析 ( 左 ) 和琼脂糖凝胶电泳图 (右 )
Fig . 4 Paper Chromatogram of PP2b ( left) and agarose
gel electrophoresis pattern ( right)
表 5 夏枯草多糖对 O2 - ·, ·OH 和 R·的清除效果
Table 5 The scavenging effect of PP2 onO2 - ·, ·OH and R·free radical
样品类型 多糖浓度 O2 R- ·清除率 ·OH 清除率 R·清除率
Sample ( g?ml) ( % ) ( % ) ( % )
category Concentration Scavenging Scavenging Scavenging
rate rate rate
粗品 0 ?. 001 8 .3 13 .2 18 .0
粗品 0 ?. 01 25 .3 32 .8 12 .5
粗品 0 ?. 05 42 .1 45 .4 7 u. 8
粗品 0 ?. 1 55 .9 66 .5 5 u. 5
粗品 0 ?. 5 63 .1 84 .1 2 u. 1
精品 0 ?. 001 5 .5 11 .3 12 .5
精品 0 ?. 01 16 .3 25 .7 9 u. 1
精品 0 ?. 05 31 .2 43 .9 5 u. 1
精品 0 ?. 1 38 .5 57 .2 1 u. 9
精品 0 ?. 5 45 .7 73 .1 1 u. 2
实验表明夏枯草多糖粗品比精品抗氧化活性
要强些 ( 表 5 )。此现象可能是在脱蛋白、脱色
素等过程中 , 损失了某些糖蛋白和非多糖抗氧化
成分。
2.6.2 模拟胃液条件下多糖对 NaNO2 的清除效果
表 6 数值说明 PP2 多糖的浓度与 NO2 - 清除
率之间呈量效关系 , Vc为阳性对照。
表 6 PP2 对 NaNO2 的清除作用
Table 6 The scavenging effect of PP2 on NaNO2
PP2 _(μg?ml) Vc (μg?ml) NaNO2 ?清除率 ( % )
250 ?51 k. 21
300 ?59 k. 03
400 ?74 k. 16
500 ?89 k. 35
200 ?87 k. 76
不同 pH 和不同作用时间对各种多糖消除
NaNO2 的影响基本相似 , 在 pH2 - 5 条件下 , 提
取液对 NO2 - 清除量在前 30 min是随时间而增加 ,
以后随时间延长 , NO2 - 的清除逐渐趋于平衡。
在低 pH 值 ( 2 - 3 ) 条件下 , 提取液对 NO2 - 的清
除能力高于 pH ( 4～7) 值 , 而且随着 pH 值的升
高 , NO2 - 清除量下降。
2 .6 .3 PP2 对肝组织脂质过氧化产物丙二醛生成
的影响 从表 7 知 , Fe2 + + H2 O2 组丙二醛含量比
对照组有所增加 , 说明 Fe2 + + H2 O2 产生的·OH
可诱导脂质过氧化反应 , 在有 PP2 时 , 丙二醛生
成量比 Fe2 + + H2 O2 组明显减少 , 且随着 PP2 质量
浓度的增加 , 丙二醛生成量有明显的减小 , 说明
PP2 能强烈地抑制·OH 诱导的脂质过氧化作用 ,
Vc为阳性对照。
表 7 PP2 对 Fe2 + + H2 O2 诱导的小鼠肝组织丙二醛生成的影响
Table 7 The Effect of PP2 on MDA formation by FeSO4 + H2 O2
system in mice liver in vitro
实验组 PP2 ?? A532 nm 抑制率?%
Experimental group μg·mL - 1 bInhibiting rate
对照组 0 ?0 ?. 259±0 .062 ***
Fe2 + + H2 O2 0 ?1 ?. 736±0 .134
Fe2 + + H2O2 + 多糖 100 ?1 .598±0 .138 7 #. 9
200 ?1 .451±0 .142 * 16 6. 4
400 ?1 .086±0 .076 *** 37 6. 4
800 ?0 .891±0 .169 *** 48 6. 7
1600 ?0 .634±0 .221 *** 63 6. 5
Fe2 + + H2 O2 + Vc 0 ?. 753±0 .113 *** 56 6. 6
(200 ?μg·mL - 1 )
n= 5; * P < 0 .05 ; *** P < 0 .001 ; vs Fe2 + + H2 O2 .
2 .6 .4 PP2 对 H2 O2 诱导小鼠红细胞溶血的影响
从表 8 可知 H2 O2 组的 OD 值远比对照组大 ,
说明 H2 O2 能明显地引起红细胞溶血 , 即红细胞
膜受到影响 , 当在 H2 O2 体系中加入 PP2 后 , 溶
3144 期 张德华 : 夏枯草多糖的分离纯化与抗氧化活性研究
血显著降低 , 说明 PP2 可抑制红细胞氧化作用 ,
且抑制率和 PP2 的质量浓度成量效关系 , Vc 为
阳性对照。
表 8 PP2 对 H2 O2 诱导小鼠红细胞溶血的影响
Table 8 Effect of PP2 on the hemolysis of rat RBC induced by H2 O2
实验组 PP2 &? A415 ?nm 溶血 抑制率?%
Experimental group μg·mL - 1 ?度 Inhibiting
rate
对照组 0 ?0 .157±0 .032
Fe2 + + H2 O2 0 ?0 .562±0 .034 100 0
Fe2 + + H2O2 + 多糖 200 /0 ?. 498±0 ?. 036 88 .6 11 .4
400 /0 ?. 398±0 ?. 041 * 70 .8 29 .2
800 /0 ?. 266±0 ?. 048 ** 47 .3 52 .7
Fe2 + + H2 O2 + Vc 0 ?. 241±0 ?. 031 ** 42 .9 57 .1
(200 Tμg·mL - 1 )
n= 3 ; * P < 0 .05; ** P < 0 . 01; vs H2 O2
3 结论
夏枯草多糖热水浸提的最佳工艺条件是: 温度
90℃ , 提取时间 4 h, 料液比 1∶20, 水提取 3 次。
PP2 在紫外光谱图 , 显示样品无蛋白质、多
肽和核酸 ; PP2b 纸层析及琼脂糖凝胶电泳 , 结
果说明 PP2b为均一多糖 , 不含有其它成分。
在脱蛋白工艺上 , 采用 4 种方法联合 , 使溶
液中结合蛋白和游离蛋白去除更彻底。
PP2 经气相色谱分析 , 表明由鼠李糖、木
糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等单糖
组成。
在化学模拟体系、亚细胞器和组织水平上对
夏枯草多糖的抗氧化作用进行评价 : ①PP2 有较
高的清除·OH 自由基、O2 - ·自由基和亚硝酸根
离子的能力 , 在一定浓度范围内清除率与浓度剂
量呈正相关 , 但对 R·的清除能力较弱。② PP2
具有防止膜脂质过氧化的作用 , 从而减少红细胞
溶血和降低脂质过氧化产物丙二醛的生成量。
夏枯草多糖具有良好的抗氧化性能 , 根据自
由基理论 , 应具有开发为功能性保健食品的潜在
价值。
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